细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Immun〇l)2021, 37(1)47•论著•文章编号：1007-8738(2021 )014047*07两种商业化二抗在免疫组织化学染中一致性的比较 李瞾\陈奕至\孟巍、杨智冉2，林育林张孙萍萍\杜雪梅、曲丛玲、昌红\韦继学3，李雁匕2* C首都医科大学附属北京世纪坛医院病理科，北京100038; 2首都医科大学附属北京世纪坛医院腹膜肿瘤外科（北京市肿瘤深 部热疗和全身热疗技术培训基地），北京100038; 3重庆市人口与家庭发展研究中心，重庆401120)
[摘要]目的比较两种商业化二抗在免疫组织化学染中的一致性。方法以常见肿瘤组织样本为待检组织，选取18种 常用免疫组织化学染一抗，按国际专家特设委员会的建议设立阳性对照及阴性对照。使用D A K0自动免疫组织化学染平 台，其他实验条件一致，以两种不同二抗进行免疫组织化学染，标准组二抗为D A K0聚合物系统（D AKO EnVision FLEX, High p H)，实验组二抗为 Power-S t a i n™试剂盒（P〇we r-S t a i n™1.0P〇lyHRP DAB K i t f o r Mouse+ Rabbit)。染后，采集图像，医 师单盲法进行定位、定性以及半定量评价；两组选取同一区域，均以数字病理图像测量方法定量测量吸光度校正值、测量区域 面积值以及灰度图阳性积分吸光度值，计算得到平均吸光度均值。结果两组所有样本染的定位均准确，定性一致，两组半 定量测量数据对两组强度比较、两组阳性百分率比较、两组平均吸光度均值比较，组间差异均无统计学意义。结论两种商业化二抗在免疫组织化学染中具有良好的一致性。中国盐业协会
[关键词]免疫组织化学染技术；二抗；一致性；数字病理
[中图分类号]R392-33, R392.31, R730.21 [文献标志码]A
Consistency of two commercial secondary antibodies for immunohistochemistry
LI Zhao1 , CHEN Yizhi1 , MENG Wei1, YANG Zhiran2, UN Yulin2, ZHANG Jue2, SUN Pingping1, DU Xuemei1, QU Congling1, CHANG Hong1, WEI Jixue3, U Yan1'2*
1 Department of Pathology, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100038 ；2Department of Peritoneal Cancer Surgery, Capital Medical University ( Beijing Technical Training Base of Tumor Deep Hyperthermia and Whole-body Hyperthermia), Beijing 100038；3Chongqing Municipal Population and Family Development Research Center, Chongqing 401120, China
* Corresponding author, E-m ail：****************
[Abstract] Objective To compare the consistency of immunohistochemical staining between the two commercial secondary antibodies. Methods Eighteen common immunohistochemical primary antibodies were selected and positive and negative controls were set up according to the recommendations from the AD Hoc Committee of International Experts. Under the same experiment
al conditions, the DAKO automatic immunohistochemical staining platform was used to test two different secondary antibodies for immunohistochemical staining. The standard group for the secondary antibody was provided by the DAKO polymer system (DAKO EnVision F LE X, High p H), and the experimental group for the secondary antibody was provided by the Power-Stain™ kit (Power-Stain™ 1.0 Poly HRP DAB Kit for Mouse + R abbit). Subsequently, the images were captured. A single-blind, positioning, qualitative and semi-quantitative scoring criterion was used for describing the positive stains by the experienced pathologist. Absorbance corrected values, measured area values and positive integral absorbance were detected by the digital pathology quantitative measurement in the same areas from the two groups. Then, the mean absorbance was calculated. Results The stains of all the samples from the two groups showed accurate location and consistent qualitative evaluation. No significant differences were found between the two groups in all the semi-quantitative scoring, including stain intensity, positive stain percentages and mean absorbance. Conclusion The two commercial secondary antibodies have strong consistency in the immunohistochemical staining.
[K ey words] immunohistochemistry；secondary antibodies；consistency；digital pathology
现代艺术150年收稿日期：20204)9-22；接受日期：2020-1143
基金项目：北京市医院管理局“登峰”人才培养计划（D FL20180701)；首都临床特应用研究与成果推广项目（Z161100000516077)；北京市优秀人 才培养资助集体项目（2017400003235J007)；首都医科大学附属北京世纪坛医院重点学科建设项目（2016&nzlwk)；北京市自然科学基金(7172108)
作者简介：李瞾（1989 -)，女，北京人，技师，医学硕士
Tel：************；E-mail：*****************************
*通讯作者，李雜，E-mail: ****************
48细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Imrmmol)2021，37( 1)
免疫组织化学技术（immunohistochemistry,IHC)是一种利用抗原抗体间的特异性结合来检测并定位 细胞和组织中特异性抗原的病理技术[1~。自20世 纪40年代Coons开始，直至20世纪90年代非生物 素检测系统％问世，免疫组织化学染逐渐成为临 床病理工作中不可或缺的部分，在诊断外科病理学 的基础上对于患者的医疗护理，在预测药物反应、免 疫方面有了很大的发展[3]。免疫组织化学染 的影响因素繁多，受冷缺血时间、固定剂、固定时 间、石蜡切片、保存时间、抗体、抗原修复技术以及 检测系统等因素的影响i4]。通过对免疫组织化学染 技术质量进行严格控制利于提高制片质量、提升 病理检验诊断水平，为临床诊断提供有力依据
目前的免疫组织化学检测技术在各地域、医院、科室 和人员之间存在较大差异，又由于缺少规范，在实际 操作过程中就会存在诸多问题[6]。全球范围内各质 控组织每年都会开展免疫组织化学染室间质评，以保障各实验室免疫组织化学染质量[7_9]，结果可 作为各实验室室内质控改进的依据。然而，一般室 间质评在时间上具有阶段性，且每次抽检一般以较 少的3 ~5种抗体的染结果样本作为质评结果[9"°]，所以具有一定的局限性。因此，在免疫组织 化学染领域，为了能够更好地完成免疫组织化学 染质控，从室内质控方面，国内一些实验室进行了 基于自己实验室染体系的研究与改进，对于日常 工作有一定的参考价值。如有些实验室从手工染 向全自动免疫组织化学染仪染过渡，标准化操 作为免疫组织化学染的可重复性奠定了基础["]。有些实验室还针对免疫组织化学染的质量控制专 门设计了可持续改进的方法流程％13]。在免疫组织 化学染质量控制中，体外诊断即用型二抗检测系 统是确保染结果一致性的重要因素之一，实验室 可根据自身情况选用不同的检测试剂盒或抗体[6]。日常工作中，实验室会遇到更换不同的二抗或引进 一种新的二抗的情况，新二抗是否能适应目前实验 室染体系，能否替代原二抗，两者染结果是否具 有一致性？有必要发展一种具有参考性的、实用性 强、经济简便的验证方法。本课题旨在研究两种商 业化二抗在免疫组织化学染中的一致性，为新试 剂进人实验室提供客观评价依据及解决方案。
1材料和方法
1.1材料
DAK0自动免疫组织化学染平台购自Agilent 公司；樱花染封片一体机购自Sakura公司；标准 组免疫组织化学染二抗DAK O EnVision FLEX购自 Agilent公司；实验组免疫组织化学染二抗？(^6!"-Stain™ 1•0 Poly HRP DAB K it for M ouse+ Rabbit 购自 Genemed公司；免疫组织化学染一抗：根据检测抗 原在细胞膜、细胞质及细胞核、细胞核/细胞质、细 胞膜/细胞质的定位分布，选取OriGene公司的18种 常用免疫组织化学染抗体（表1)。苏木素、分化 液、返蓝染液、无水乙醇、二甲苯购自北京益利精 细化学品有限公司。Axio Scope.A1显微镜购自Zeiss 公司；M S60摄像头购自Mshot公司；Image-Pro Plus 6.0为M edia Cybernetics图像技术公司产品。
表1本研究中免疫组织化学染18种一抗
序号定位（阳性部位）抗体名称克隆号稀释度1细胞膜CD3LN101100 2细胞膜CD20EP7工作液3细胞膜CD31EP78工作液4细胞质细胞角蛋白（cytokeratin，CK)AE1/AE31:60
5细胞质CK5/60TI1C7工作液6细胞质CK7EP161120
7细胞质CK8/18Zym5.2
(UCD/PR-10. 11)
1100
8细胞质CK20EP230160
9细胞质波形蛋白（vimentin)V91160 10细胞质结蛋白（desmin)EP15160 11细胞质嗜铬颗粒素A( chromograninA，CgA)EP381200 12细胞质突触小泡蛋白（synaptophysin，Syn )EP1581110 13细胞质平滑肌肌动蛋白（smooth muscle actin，SMA)1A4180 14细胞核甲状腺转录因子1 (thyroid transcription factor-1，TTF-1 )SPT24工作液15细胞核尾型同源蛋白 2(caudal type homeobox-2，CDX-2)EP25工作液16细胞核KI-67 抗原（antigen KI々7, ki67)UMAB1071100 17细胞核/细胞质S100 蛋白（S100 protein, S100)无（多克隆）工作液18细胞膜/细胞质癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA)12-140-101180
1期李瞾，等.两种商仆化二抗在免疫组织化学染中一致性的比较49
1.2方法
1.2.1标本选取待测标本全部来源于工作中临床 肿瘤组织样本，研究得到医院伦理委员会的批准，患 者已签署知情同意书。参照国际特设专家委员会的 建议设立阳性对照及阴性对照[14]，根据待测抗原在 细胞膜、细胞质、细胞核、细胞核/细胞质、细胞膜/ 细胞质的定位特点，选取日常工作中的18种常用抗 体进行实验，每组同时对待检组织及同一张切片上 的组织芯片进行染。
1.2.2免疫组织化学染过程使用免疫组织化学 染专用载玻片。进行连续切片，烤箱烤片。两组 所有玻片同时脱蜡至水，进行高压抗原热修复
(pH 8.4)4 min ；冷却至室温，缓冲液洗净玻片，待 上机。上机前选择相应程序进行打签贴签。程序具 体步骤为双氧水灭活10 min ，缓冲液冲洗；一
抗孵育
20 min ，缓冲液冲洗；不同二抗孵育12 min ，缓冲液 冲洗；二氨基联苯胺（diaminobenzidine , DAB )显 7 min ，蒸馏水冲洗，下机。再以染封片一体机进 行苏木素复染、分化液分化，返蓝染液返蓝、梯度 乙醇脱水、二甲苯透明，最后树胶封片观察。1.2.3显微镜下观察和图像采集分析将免疫组织 化学染切片置于Axio Scope . A 1显微镜下观察，用
M S 60摄像头采集病理图像。请一位主治医师和一位 主任医师进行盲评，数字病理的方法进行定量测量，
记录下述四种评价指标。①定位指标（着部位）： 根据内对照和外对照（芯片），两者的着模式和着 部位是否准确。②定性指标（染阴性阳性）：根 据内对照和外对照，确定染结果的阳性、阴性，以 及是否存在假阳性、假阴性。③半定量指标：观察两 组染，包括待检组织的阳性强
度（1 +、2 +、3 + )， 以及阳性百分率。阳性强度中所有数据标准组与实 验组比较，即（医师丨强度判断标准组+医师2强度 判断标准组）与（医师1强度判断实验组+医师2强 度判断实验组）比较；阳性百分率中所有数据标准组 与实验组比较，即（医师1阳性百分率标准组+医师2 阳性百分率标准组）与（医师1阳性百分率实验组+ 医师2阳性百分率实验组）比较。④全定量指标：将 同一倍数和视野下采集到的图像以数字病理图像分 析软件Image-Pro Plus 6. 0进行分析。首先在显微镜 内尽量选择相同视野范围，测定每个样本的吸光度 并进行校正，其次测定测量范围面积。调整测量环 境、设置阳性区域的彩选择，再将图像转化为灰度 图像、选取刚才校正好的吸光度、测定阳性部分的积 分吸光度，然后计算每个样本的平均吸光度（平均吸 光度=灰度图阳性部分的积分吸光度+参与测量范 围面积）。每种抗体包含两个样本，求得这两个样本 的平均吸光度均值作为这个抗体的最终值，最后标 准组与实验组进行比较。详细研究流程（图1)。
常见肿瘤组织样本怍为f t 检组m
日常丄作的18种•抗
H 际特设专家委员会推荐的阳性对照、阴性对照
I
制作切片E
分组：标准组、实验组
常规免疫M 织化学染前处理步骤：烤片、脱蜡、修复、灭活
D A K 0染平台滴加一抗《育（5种抗原定位：细胞膜、细胞质、细胞核.细胞核/*、细胞唭/质）
D A K 0染T 台滴加二抗孵育：标准组（D A K O
E n V i s i o n
F L E X , H i g h PH )
实验组（G e n e m e d P o w e r -S t a i n ™ 1.0 Po】y H R P D A B K i t f o r M o u s e +R a b b i t )
D A K O 染平台D A B 显，复染、脱水、封片
采集图像
观察者单肓（医师1、f e 师2) 1
|选定同一区域数字病理定量测量两组数据
1定位定件1
半定11
吸光度校正
参H i 测童的面枳测定
灰度图阳性积分吸光度
1I -
1
两组比较
两组比较
两组比较
阳性部位是否准确 判定样本阳性、阴性
m 性强度
阳性百分比I
z c
~r ~两组样本T 均吸光度
、丨，灰度图阳性积分吸光度 卜職尤約■的面积
I
结合样本内阳性、阴性对照 判定两组染基本情况两组间比较
统i 十分析
两组间比较 统计分析
每组平均吸光度均值两组间比较统计分析迅雷看看桌面版
图1两种二抗一致性研究的设计流程图
50细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol ImmU n 〇l )2021, 37( 1)
1.2.4统计学分析分别记录两位观察者的评价结 果，记录数字病理定量测定结果。计数资料用配对
设计的非参数检验方法表示，计量资料用配对r 检 验方法表示，采用统计学软件S A S 9. 2进行统计学分 析，P <0.05为差异有统计学意义。2结果
2.1定性及定位研究
本研究采用病理标本36例，标记抗原部位包
括细胞膜、细胞质和细胞核、细胞核/细胞质、细
胞膜/细胞质（图2)，将实验染参照外部的阴性 和阳性对照，两组结果定位准确且两组结果定性 一致。此实验结果的价值在于以传统病理学医师 肉眼阅片的角度观察染，并对两种二抗在免疫 组织化学染一致性进行初步的定位、定性判定 (表 2)〇
A ：标准组；
B ：实验组.I 淋巴瘤组织
C
D 20的表达（细胞膜阳性）；2：平滑肌瘤组织SM A 的表达（细胞质阳性）；3：结直肠癌组织CD X -2的表
达（细胞核阳性）；4：神经鞘瘤组织S 100的表达（细胞核/细胞质阳性）；5：结直肠癌组织C E A 的表达（细胞膜/细胞质阳性）.
图2各部位抗原的阳性染结果（X 400)表2
本研究中各类抗原的定位和定性评价结果
序号
抗原定位抗体名称
标本类型阳性对照阴性对照
结果（与内、外对照对比）
定位定性1细胞膜CD3淋巴瘤扁桃体、胰腺、肝-定位准确阳性2细胞膜CD20淋巴瘤阑尾、扁桃体、肝-定位准确阳性3细胞膜CD31血管扁桃体、胰腺、肝-定位准确阳性4细胞质CK 结直肠癌阑尾、扁桃体、肝-
定位准确阳性5细胞质CK5/6鱗癌扁桃体、胰腺肝定位准确阳性6细胞质CK7乳腺癌肝、胰腺
阑尾
定位准确阳性7细胞质CK8/18结直肠癌阑尾、扁桃体、肝-
定位准确阳性8细胞质CK20结直肠癌阑尾
扁桃体、肝
劳动保护杂志定位准确阳性9细胞质vimentin 肉瘤阑尾、肝、胰腺-
定位准确阳性10细胞质desmin 平滑肌瘤阑尾、扁桃体肝定位准确阳性11细胞质CgA 神经内分泌瘤阑尾、胰腺肝定位准确阳性12细胞质Syn 神经内分泌瘤阑尾、胰腺肝
定位准确阳性13细胞质SMA 平滑肌瘤阑尾、扁桃体、肝-
定位准确阳性14细胞核TTF-1肺腺癌甲状腺、肺扁桃体定位准确阳性15细胞核CDX-2结直肠癌阑尾、胰腺扁桃体定位准确阳性16细胞核
ki67
7075t6
结直肠癌阑尾、扁桃体肝定位准确阳性17细胞核/细胞质S 100神经鞘瘤扁桃体、胰腺肝定位准确阳性18
细胞膜/细胞质CEA
结直肠癌
扁桃体
肝
定位准确
阳性
环糊精
1期李瞾，等.两种商、丨k化二抗在免疫组织化学染中一致性的比较51
2.2半定量研究
两种二抗染强度一致性研究的半定量评价结
果，两组间的差异无统计学意义（P>0.05，表3)。
两种二抗染阳性百分率一致性研究的半定量
评价结果提示，两组间的差异无统计学意义
(P>0.05，表4)。
表3两种二抗染强度一致性的半定量研究结果
序号抗原定位抗体名称医师1强度判断医师2强度判断标准组实验组标准组实验组
1细胞膜CD3 3 + 3 + 3 + 3 + 2细胞膜CD20 2 + 2 + 2 + 2 + 3细胞膜CD31 3 + 3 + 3 + 3 + 4细胞质CK 3 + 3 + 3 + 3 + 5细胞质CK5/6 3 + 3 + 3 + 3 + 6细胞质CK7 3 + 3 + 3 + 3 + 7细胞质CK8/18 3 + 3 + 3 + 3 + 8细胞质CK20 3 + 3 + 3 + 3 + 9细胞质vimentin 3 + 3 + 3 + 3 + 10细胞
质desmin 3 + 3 + 3 + 3 + 11细胞质CgA 2 + 2 + 2 + 2 + 12细胞质Syn 3 + 3 + 3 + 3 + 13细胞质SM A 3 + 3 + 3 + 3 + 14细胞核TTF-1 3 + 3 + 3 + 3 + 15细胞核CDX-2 3 + 3 + 3 + 3 + 16细胞核ki67 3 + 3 + 3 + 3 + 17细胞核/细胞质S100 3 + 3 + 3 + 3 + 18细胞膜/细胞质CEA 2 + 2 + 2 +1+
表4两种二抗阳性染百分率一致性的半定量研究结果
序号抗原定位抗体名称医师1阳性（％)医师2阳性（％)标准组实验组标准组实验组
1细胞膜CD3100809090
2细胞膜CD20801009090
3细胞膜CD31100100100100
4细胞质CK100100100100
5细胞质CK5/68070100100
6细胞质CK7100100100100
7细胞质CK8/18100100100100
8细胞质CK209090100100
9细胞质vimentin100100100100
10细胞质desmin90100100100
11细胞质CgA80806050
12细胞质Syn100909595
13细胞质SM A100100100100
14细胞核TTF-11001009595
15细胞核CDX-2100100100100
16细胞核ki6790907070
17细胞核/质S100100909595
18细胞膜/质CEA80709090
2.3全定量研究
两种二抗染强度一致性研究的全定量评价结 果，两组平均吸光度均值比较，提示两组间的差异无 统计学意义(P>〇.〇5)。本研究通过医师肉眼定位、定性以及半定量观察结合数字病理定量测量可以显 水两种二抗DAKO聚合物系统和Power-Stain™试剂 盒在免疫组织化学染中具有良好的一致性。3讨论
在个性化精准医疗时代，临床病理诊断应具有 客观性、重复性、一致性。精准病理学主要包含：传 统病理向形态组学的发展、分子病理学的拓展、数字 切片到计算病理学和智能化病理学以及病理大数据[15]。精准病理学，对免疫组织化学染的准确和 可重复性提出更高要求，需要进行严格的免疫组织 化学染质量控制。在免疫组织化学染检测技术 共识中，有专家学者指出，免疫组织化学染检测步 骤的主要包括：脱蜡和抗原修复、封闭、一抗的应 用、二抗和检测系统、脱水透明、封片、归档以及免 疫组织化学染仪的自动染[6]。这些可以作为日 常免疫组织化学染工作中各环节质量控制的参考。有学者对抗原修复中不同pH修复液以及不同修复 方式对免疫组织化学染结果的影响进行研究[1W7]，有对同一免疫组织化学染指标以组织芯片进行不 同平台其中包含实验室开发的检测法（laboratory developed test,LDT)的染结果进行一致性分析[18]，还有对于同一个免疫组织化
学染指标不同克隆号 一抗在不同平台间的研究[19]。在免疫组织化学染 质量控制的诸多问题中还有学者提出免疫组织化学 染病理技术中的试剂质量稳定性会直接影响到病 理检查结果[M]。目前体外诊断产品免疫组织化学染 二抗检测系统试剂盒通常为即用型工作液，其产 品说明一般会提供产品性能特性、参考检测流程以 及有效期等信息[6]，制造商在出厂前会进行质控，以保证产品的稳定性。但不同的两种二抗是否具有一 致性，能否等效，就需要我们根据自己实验室的染 体系进行验证。本研究可以为新二抗进入实验室的 一致性验证、免疫组织化学染质量控制提供参考。
免疫组织化学染作为日常工作中的定性或简 单分级半定量实验，一般由诊断医生肉眼判断染 深浅、细胞阳性比率。数字图像分析是人工智能技 术在病理图像处理领域的应用，对拍摄和扫描的数 字图像进行预处理、分割、特征提取和分类，进而整 合计算出病理特征信息[21]，并且较光学显微镜可以 自动定量具有更高的一致性和精确性[M]。从1965年 对细胞和染体进行最初的电脑图像分析，到目前 可以对整张切片的数字化图像扫描，并可对人工智 能进行不断地训练学习，数字病理取得了长足发展[23~。近年来有研究将各种基于免疫组织化学染 的数字图像分析已成功广泛应用于病理学[25]、肿 瘤学[26]、临床试验研究[27]，以及免疫相关研究[28]等领域。本实验也是免疫组织化学染数字病 理图像分析定量测量在抗体研究领域的应用，有一
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议