免疫组化操作规程
一 仪器设备
1.18cm不锈钢高压锅和电炉2医用微波炉3水浴箱; 4冰箱（-18℃-4℃）5.湿盒6耐高温塑料切片架7可调微量移液器8定时器9pH计
二 试剂
1.PBS(磷酸盐冲液pH7.2-7.4):NaCl 137mmol/L KCl 2.7mmol/L Na2HPO4 4.3mmol/L KH2PO4 1.4mmol/L
2.柠檬酸盐缓冲液(CB,pH6.0，0.01mol/L，1000ml配制):柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g
3.酶消化液 a 0.1%胰蛋白酶液:用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制. B 0.4%胃蛋白酶液:用0.1N的HCl配制
三 操作流程
1 脱蜡和水化
1)置于二甲苯I中浸泡10分钟,在二甲苯II中再浸泡10分钟
2)无水乙醇I中浸泡5分钟,在无水乙醇II中再浸泡5分钟
3)95%乙醇中浸泡5分钟
4)85%乙醇中浸泡5分钟
5)70%乙醇中浸泡5分钟
6)蒸馏水中浸泡5分钟
2抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片
1抗原热修复
A 高温高压热修复:取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于压力锅中大火加热至沸腾将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上放入已沸腾的缓冲液中.盖上锅盖扣上压力阀继续加热至喷气从喷气开始计时1-2分钟后压力锅离开热源冷却至室温取出玻片先用蒸馏水洗两次后用PBSapl洗5分钟 B微波热修复取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于微波盒中微波加热至沸腾将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上放入已沸腾的缓冲液中中高档继续处理10-15分钟取出微波盒冷却至室温取出玻片先用蒸馏水洗两次后用PBS洗5分钟
C酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液胰蛋白酶使用前预热至37℃,切片也预热至37℃消化时间约为5~30分钟胃蛋白酶消化37℃.时间为10-30俄罗斯和叙利亚的关系分钟
SP法
1)脱蜡水化
2)蒸馏水中5分钟
药理学进展
3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O22011安徽高考数学理科室温封闭10分钟蒸馏水洗1次
4抗原修复
5PBS洗5分钟
7甩去多余液体滴加Ⅰ抗西陵网校, 37℃1小时或者4℃过夜(4℃过夜后在37℃复温45分钟
8PBS洗2次各5分钟
9滴加生物素化Ⅱ抗,孵育条件参见所用试剂盒
10 PBS洗2次各5分钟
11滴加酶标抗体孵育条件参见所用试剂盒
12PBS洗2次各5分钟
福清进修校13DAB显5-10分钟,在显微镜下掌握染程度
14蒸馏水洗终止染,苏木素复染,盐酸酒精分化
15脱水,透明,封片,镜检
##SP法
1）脱蜡、水化；
2）PBS洗2～3次各5分钟；
3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
4）PBS洗2～3次各5分钟；
5）抗原修复；
6）PBS洗2～3次各5分钟；
7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；
11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分钟；
14）DAB显5～10分钟，在显微镜下掌握染程度；
15）PBS或自来水冲洗10分钟；
16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
17）自来水冲洗10～15分钟；
18）脱水、透明、封片、镜检。
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