细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Immunol)2021，37(3)233•论著•文章编号：1007-8738(2021)03-0233^07敲低Aurora-A抑制HepG2人肝癌细胞增殖并促进其凋亡 李忠贤\韩淑霞2，刘斌3，卜稳平4，刘迪4，严慧5，刘清#(宁夏医科大学：1研究生学院，2总医院妇科，3总医院临 床技能综合培训中心，4总医院肝胆外科，5总医院肿瘤内二科，宁夏银川750004)
[摘要]目的探讨敲低Aurora-A对H e PG2人肝癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计A ur〇ra-A短发夹R N A(s h R N A)片段，构建和包装Aurera-A s h R N A慢病毒载体，转染H e PG2细胞，实时定量P C R检测Aurora-A m R N A表达，Western blot法检测 Aurora-A蛋白及磷酸化水平，噻唑蓝（M T T)法检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建Aurom-A s h R N A慢病毒载体，转染后的H e PG2细胞A u r o m-A蛋白磷酸化水平明显降低。敲低Aurora-A后，H e PG2细胞增殖显著降低，细胞凋亡 率显著增加。结论敲低Aur〇ra-A的表达抑制H e PG2细胞增殖并促进其凋亡。 [关键词]Aurora-A；细胞增殖；细胞凋亡；H e PG2人肝癌细胞
[中图分类号]Q279, R734.2, R392-33, Q253, Q255 [文献标志码]A
Knockdown of Aurora-A inhibits proliferation and promotes apoptosis of HepG2 hepatocellular carcinoma cells
LI Z h o n g x i a n1 ,H A N Shuxia2,U U B i n3,B U W e n p i n g4,L I U D i4,Y A N H u i5,L I U Q i n g4*
1Graduate School,Ningxia Medical University, "Department of Gynecology, 3Comprehensive Training Center for Clinical Skills, 4Department of Hepatobiliary Surgery,5Department of Oncology,General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China
* Corresponding author, E-mail： m sha n l976@163. com
[A bstract ] Objective To investigate the effects of knockdown of Aurora-A gene on the proliferation and apoptosis of HepG2 human hepatocellular carcinoma cells. Methods Aurora-A short hairpin RN A (Aurora-A sh RN A) was designed and Aurora-A shRNA lentiviral vector was constructed and packed, and then transfected into HepG2 cells. Aurora-A m RNA expression was detected by real-time quantitative PC R. Aurora-A protein expression and phosphorylation level were detected by W estern blotting. Cell proliferation was tested by MTT assay. Cell apoptosis w as analyzed by flow cytometry. Results The Aurora-A shRN A lentiviral vector was successfully constructed and Aurora-A protein phosphorylation level was significantly reduced in HepG2 cells transfected with the lentiviral vector. W hen Aurora-a was knocked down, the proliferation of HepG2 cells decreased and the apop
tosis rate increased significantly. Conclusion Knockdown of Aurora-A can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of HepG2 cells.
Key words] Aurora-A；cell proliferation；cell apoptosis；HepG2 human hepatocellular carcinoma cells
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，H C C)是临 床实践中最常见的恶性肿瘤之一，在全球死亡率中 排名第二[1]。尽管在过去的几十年中，多模式疗法 已用于H C C，但由于术后复发和的耐药性，H C C的效果仍然不理想。尽管参与H C C发生和 发展的众多基因和信号转导途径已经被发现，但尚
收稿日期：20204)5-21；接受日期：20214)1>08
基金项目：宁夏自然科学基金（NZ17M1)
作者简介：李忠贤（1994-)，男，宁夏银川人，住院医师，硕士研究生Tel: 133****1805;E-m ail：
社区的概念* 通讯作者，刘清，E-mail: *****************不清楚H C C发生和发展的具体机制。近年来，各种 生物信息学的工具已广泛用于肿瘤学的研究，例如 从R N A测序数据和下一代测序数据中筛选出关键的 核
河南省政法管理干部学院心基因，以及验证它们对肝癌的功能机制[2]。例 如，对来自乙型肝炎病毒（hepa tit is B virus,H B V)相 关肝癌及邻近癌旁组织的总R N A进行R N A测序，发
现差异表达的基因胸苷激酶1 (thymidine kinase 1， T K 1)、甲状腺受体相互作用蛋白13(thyroid receptor interacting protein 13， TRIP 13) 在其启动子区域均包
含推定的八聚体结合转录因子4( octamer-binding transcription f actor 4，OCT4 )结合基序，它们通过
0CT 4共同的转录调控提示在H C C 的发生中起关键 作用，并表明0CT 4可能充当潜在的靶标[3]。诸 如癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas ， T C G A )项目和基因表达数据集（Gene Expression Omnibus ，G E O )数据库，用于在肝癌发展过程中寻
关键基因，经过基因表达水平的评估验证，综合分析
关键基因扮演的生物学功能[4]。例如以T C G A 数据 库中H C C 和正常组织的转录组学为研究手段，发现 7 氣基丁酸 A 型受体 rhol (gamma-aminobutyric acid type A receptor rhol ，G A B R R 1 )、性别决定区基因 Y
相关的高迁移率族蛋白11 [SRY-related high -mobility - group (H M G ) box 11， S 0X 11]、 胶原蛋
白 24A 1 (collagen 24A 1，C 0L 24A 1)和肌球蛋白轻链激酶2 (myosin l i g h t chain kinase 2，M Y L K 2)这四个基因在
肿瘤组织中显着上调，表达水平与总生存率（over a ll survival ，O S )和无进展生存(progression-free survival ， PFS )呈负相关，4个基因的联合检测是预测H C C 患
cyg
者生存的潜在新的生物标志[5]。这些可以帮助理解 H C C 发生和发展的机制，并确定H C C 诊断和预后的 新靶标。尽管有这些发现，但尚未全面揭示影响 H C C 患者病情发展和预后的关键基因。
A u r o r a -A 激酶是主要的有丝分裂调节剂，在肿
瘤细胞中异常表达，并通过调节有丝分裂的底物，如 蛋白憐酸酶 1 (protein phosphatase 1，P P 1 )、Polo 样激 酶1 (Polo-like kinase 1，P L K 1 )、爪蟾驱动蛋白样蛋
^ 2
(targeting protein for Xenopus kinesin-like
protein 2, T P X 2)
和大型肿瘤抑制物同源蛋白2( large
tum or suppressor，h o m o l o g 2
，L A T S 2 )促进细胞增殖，
并通过非有丝分裂途径影响其他分子，从而促进细 胞侵袭和转移[6]。Aurom -A 激酶的功能受多种调节 相互作用和翻译后修饰的控制，由于在癌症中经常 失调，使Aurom -A 抑制成为非常有吸引力的抗肿瘤 靶标[7]。目前A u r o r a 激酶抑制剂是分子靶向的 新领域，部分抑制剂已进人临床试验，表现出较强的 抗肿瘤活性[8]。本研究采用慢病毒构建Aurora -A 沉 默载体，感染H e P G
网格化管理2
细胞，探索其对H e P G
2
细胞增
殖及凋亡的影响和可能的机制。
234
1材料和方法
1.1材料
TRIzol 试剂购自上海英潍捷基有限公司；CD N A
第一链合成试剂盒、实时定量PCR Mix 试剂购自北 京全式金生物公司；质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒 购自杭州艾思进有限公司；兔抗人Aurora -A 多克隆 抗体、兔抗人憐酸化的Aurora-A [ phospho -Aurora-A (Thr 288) , p -Aurora -A ]多克隆抗体购自 Cell Signaling Technology 公司；小鼠抗人G A P D H 单克隆抗体购自 N O V U S 公司；T 4 D N A 连接酶、Age I 和
£c〇R I 内切酶、实时定量P C R 试剂盒购自宝日医生物 技术(北京)有限公司；胎牛血清、Lipofectamine ™ 3000、 D M E M 培养基购自赛默飞世尔科技公司；全蛋白提
取试剂盒、蛋白定量试剂盒、超敏型E C L 发光检测 试剂盒购自南京凯基有限公司；短发夹R N A ( short hairpin R N A , shRNA )序列及引物由上海生工合成； G V 248 质粒、pHelperl _ 0 质粒、pHelper 2. 0、HepG 2
人肝癌细胞和H E K 293T 细胞在宁夏临床病原微生物 重点实验室保存。噻哩蓝（methyl thiazole tetrazolium ， M T T )、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide ，D M S 0)、藻
蓝蛋白标记的膜联素V /碘化丙啶（annexin V - allophycocyanin / propidium iodide , annexin V -APC/PI )
细胞凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司； Bond 聚合物优化检测试剂盒购自Leica Biosystems 公
司。B O N D -M A X 免疫组织化学自动染仪购自Leica 公司。
1.2方法
1.2.1实时定量P C R 和免疫组织化学染法分别 检测肝癌组织Aurora-A m R N A 和蛋白表达实时定 量 PCR 检测肝癌 c D N A -HLivH 060PG 02 cDNA 芯片 Aurora-A m R N A 的表达。此c D N A 芯片包含有30个
样本，分别为癌和癌旁，分布为60个孔的c D N A 样 本。将c D N A 芯片从-20 t 中取出，置于室温 1 min 。配置PCR mix ，以62孔进行配置。Power SYBR Green PCR Master Mix 620 j j l L ，正向引物
(20 j j u m o l /L )31 j j l L ，反向引物（20 (xmol /L ) 31 |x L , ddH 20 558 p L ，混匀以20 ply 孔加入c D N A 阵列中。
封板置于冰上15 min , 2000 r /min 离心1 min 。扩增 条件为 95 丈 5 min ; (95 t 30 s , 58 t 30 s , 72 X ： 30 s ) x 40个循环；65 T 5 s ，实验重复3次，以 ddH 20为阴性模板对照。Aurom -A 上游引物为
5,-GCCCTGTCT TACTG TCA TTCG -3,，下游弓I 物为
细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol Im 丨mm 〇l)2021，37(3)
3期李忠贤，等.敲低Aurora-A抑制HepG2人肝癌细胞增殖并促进•凋亡235
5，-A G G T C T C T T G G T A T G T G T T T G C-3，；G A P D H上游引 物为 5f-T G A C T T C A A C A G C G A C A C C C A-3\下游引物
为5'-C A C C C T G T T G C T G T A G C C A A A-3f。以相对表达 量2_AAet法分析A u r o r a-A m R N A的相对表达量。
免疫组织化学染法检测肝癌HLivH060CS01 组织芯片Aurora-A的蛋白表达水平。使用Leica B O N D-M A X免疫组织化学自动染仪进行染，石
蜡包埋肝癌组织及癌旁组织芯片，切片4 p m。常规 脱蜡、水化、热诱导的抗原修复，在Benchmark自动
染器上，并使用Bond聚合物优化检测试剂盒进行 检测。兔抗人Aurora-A抗体稀释至1:1000。组织芯 片包括正常人肝脏2例，肝细胞肝癌29例，癌/癌旁 各1点，合计60个位点。判读抗体的胞核染的染 强度(〇、1 +、2 +、3 + )和染阳性率，癌组织和 癌旁组织分别判读。“染强度”计分：计〇分，“1”计1分，“2”计2分，“3”计3分；“染阳性率”计分：计〇分，“矣20%”计1分，“20% <2分矣 40%”，“40%<3分矣60%”，“60%< 4 分矣 80% ”，“多80%计5分”；以“染强度”计分和“染 阳性率”计分的乘积为总分进行分析。
1.2. 2 Aurora-A s h R N A设计和载体构建以shRNA 设计原则，正义链5'端由碱基C C G G引导，接人靶 向（Target)序列，引入成环“loop”序列，再加入靶向 Target序列的反序列，3'端以T H T T G结束，反义链 5嗎由碱基A A T T C A A A A A引导，后续序列与正义链 互补。此两段互补的Oligo片段，两端加人Age I和£c〇R I的酶切位点及保护性碱基，设计的3条靶向A u r o r a-A m R N A蛋白质编码序歹丨J(coding s e q u e n c e，C D S):A u r o r a-A s h R N A-1为 5，-C C G G C A C A T A C C A-
A G A G A C C T A C A A C T C G A G T T G T A G G T C T C T T G G T A T-
G T G T T T T T G-3,,A u r o r a-A s h R N A-25^C C G G G C A-
G A G A A C T G C T A C T T A T A T C T C G A G A T A T A A G T A G C A-
G T T C T C T G C n T n T G-3，，Aurora-A s h R N A-3为5，-CC-
G G T G G C T C T T A A A G T G T T A T T T A C T C G A G T A A A T A A-
C A C T T T A A G A G C C A T n T T T G-31〇
电容式压力传感器
将s h R N A片段以含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, E D T A)的三轻甲基氣基甲焼
(Tris)(T E)缓冲液溶解，稀释到100 (x m o l/L，取正 义链和反义链序列各9 p L,10 x退火缓冲液取 2 +L，合计20 j j l L，混勻后上机。上机条件：95 T
5 m i n,94 ~ 4
6 T!降 1X I/m i n,46 ~ 26 降2 T/min。随后片段与载体进行双酶切，20 g/L琼脂糖凝胶电泳，胶回收，T4连接酶进行载体和片段的
连接，转化大肠杆菌感受态细胞，抗生素筛选后挑取 阳性克隆进行质粒提取。同时构建插人5'-11(^(：-C G A A C G T G T C A C G T-3'序列的载体，作为阴性对照 组，以空白细胞作为对照组。
1.2.3 Aurora-A s h R N A重组慢病毒的构建与滴度鉴
定H E K293T细胞培养至饱和度70% ；加人慢病毒
G V248-s h R N A穿梭质粒、慢病毒框架质粒pHelperl.O
和pHelper2_0, 48 h收集上清。丨2 000 r/m i n离心 5 min, 0.45 (x m滤膜过滤，过滤液即为病毒原液。病毒滴度测定以绿焚光蛋白（green fluorescent protein，G F P)的表达检测。将病毒原液按照10倍稀 释法稀释病毒原液，形成3个浓度梯度，将稀释的病 毒液分别感染H E K293T细胞，24 h后显微镜下计数 G F P阳性细胞，每个浓度重复3次，取镜下10个视 野，求平均值。慢病毒的滴度=感染细胞数x GFP 阳性率x病毒稀释倍数/病毒量。
1.2.4 实时定量P C R检测HepG2细胞Aurora-A m R N A沉默效率细胞过夜培养，以慢病毒感染 72 h后收集细胞，以TRIzol试剂提取总R N A，以第 一链c D N A合成试剂盒合成c D N A。实时定量PCR 试剂盒进行检测，实验重复3次，引物及结果的计算 同前。
1.2.5 Western blot 法检测 HepG2 细胞 Aurora-A 蛋
白表达以全蛋白提取试剂盒提取HePG2细胞全蛋
白，B C A蛋白含量检测试剂盒进行蛋白定量，100 g/L SDS-PAGE ，上样蛋白为 2.0 f j u g/p L，体积 20 j j l L。电泳完成后，湿转P V D F膜，以50 g/L脱脂 牛奶进行封闭，分别加兔抗Aurora-A抗体（1:1500)、兔抗p-Aurom-A抗体（1:2000)、小鼠抗G A T O H抗体 (1:20 000)，4丈孵育过夜；洗涤后，
加人H R P标记 的山羊抗兔IgG(1:2000)、H R P标记的山羊抗小鼠 IgG(l:500)，室温孵育2 h;T B S T清洗3次后，以E C L化学发光底物试剂盒利用多荧光凝胶成像系 统进行曝光和显影，并以Image J软件分析Western blot条带的吸光度（A)值，G A P D H作为内参。
1.2.6 M T T法检测HepG2细胞增殖 HepG2细胞
以1〇4个/孔接种至96孔板，培养过夜。感染慢病
毒，分别于〇、24、48、72、96 h，加人M T T溶液
20 j j l L(终剂量5 mg/mL)，4 h后弃上清。加入
D M S0 150 jiL终止，采用酶标仪490 n m检测吸光度
(A)值，每孔重复5次。
1.2.7 Annexin V-A P C/P I双标记结合流式细胞术 检测细胞凋亡HePG2细胞以106个/孔接种至6孔 板，培养过夜。感染慢病毒，继续培养至细胞增殖为 底面积的90%时，以不含E D T A的无胰蛋白酶消 化液消化细胞，加入P B S终止反应。4 T、4000 r/min离心5 min，弃废液，重复以P B S清洗 1次。再次离心后，加入400 (j l L 1x annexin V结合 液充分悬浮细胞，加人5 jjuLannexin V-A P C染液，
充分混勻，避光孵育15 min；再次加人10 (xL P I染 液，混匀后，4 t避光孵育10 min。加人400 (xL PBS 液重悬细胞，上机检测。
1.2.8统计学分析数据统计及作图以GraphPad Prism7.0软件进行，配对t检验分析H C C癌及癌旁 组织相对表达量的分布情况。计量资料首先进行正 态分布检验，如符合采用One-way A N O V A方法分析 组间差异，两两比较采用Dunnett-t检验，若不符合 则采用Kolmogorov-Smirnov秩和检验，计数资料采用 卡方检验，P< 〇.〇5为差异有统计学意义。
2 结果
2.1肝癌组织Aurora-A m R N A和蛋白高表达，但与临床病理指标无明显相关性
Aurora-A m R N A在肝癌组织、癌旁组织中的相 对表达水平分别为（3. 335 ± 0. 425)、（1. 034 ± 0.189)，肝癌组织中的相对表达水平显著高于癌旁 组织，差异有统计学意义(P< 0.01)。Aurora-A蛋白 在肝癌组织中多表达于细胞质，少量表达于细胞核，癌旁组织中则很少见阳性表达，其表达水平(4.714 ± 2.325)显著高于癌旁组织(0.624 ±0.354)，差异有 统计学意义（P<〇.〇5，图1)。
癌组织 癌旁肝组织
236
图1H C C组织及癌旁肝组织A u r o m-A蛋白表达（免疫组织 化学染，x 400)
根据Aurora-A m R N A的表达情况进行临床病理 信息比较，结果显示不同性别、不同年龄、T N M分 期、肿瘤大小、分化程度这些临床病理学参数也无明 显统计学差异（P>〇.〇5，表1)。细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M〇n m m Un〇I)2021, 37(3)
表1组织Arnw a-A m R I V A的表达量和H C C患者临床病理参数的关系
临床病理参数n Aurora-A m RN A相对表达量
性别
男23 1.912 ±0.149
女7 2.014 ±0.434
年龄
<60岁18 1.835 ±0.207
>60岁12 1.906 ±0.321
TNM分期
I1-
n11 1.607 土0.203
I17 1.971 ±0.214
IV1-
最大肿瘤直径
^5cm9 2. 105 ±0.427
>5 cm21 1.981 ±0.217
分化程度
低分化3 1.687 ±0.541
低-中分化15 1.769 ±0.248
中分化11 1.941 ±0.325
高分化1-
2.2 s h A u r o r a-A慢病毒颗粒的包装及滴度测定
包装的慢病毒可以有效感染H E K293T细胞 (图2)。慢病毒的滴度分为：s h R N A-N C( 5.61 ±0.38) x 108转导单位（tranduction unit,T U)/m L,A u r o r a-A s h R N A-1为（6. 23±0.77 )x 108I U/m L,A u r o r a-A s h R N A-2为（5. 47± 0• 68)x108I U/m L，A u r o r a-A s h R N A-3S(4.92±0.55)x l08I U/m L o
A：细胞形态（透射光，x200);B:G F P表达（荧光显微镜，x200).
图2慢病毒包装H E K293T细胞形态及G F P的表达
2.3 Aurora-A s h R N A感染的 H e p G2 细胞 Aurora-A m R N A水平明显降低
Aurora-A m R N A相对表达量结果显示，与对照 组相比，阴性对照组无差异（P > 〇.05 ); Aurora-A shRNA-1、Aurora-A shRNA-2、Aurora-A shRNA-3 转 染组沉默效率分别为（72.38 ±3. 25)%，（53.68 ± 4. 16)%和（45. 39 ±3.62)%，与其他2组相比均显 著降低，差异有统计学意义(P<〇.〇1，图
3)。
3期李忠贤，等.敲低Ainwa -A 抑制HepG 2人肝癌细胞增殖并促进其凋亡237
化耐照d U h R N A -l shRNA-2 shRNA-3
丨，
0.01仍其他2组.
图3 Aurora-A s h R N A 沉默效率图
Aurora-A (Thr288)
A : Western b lo t 法检测HepG 2细跑Aurora-A 及鱗酸化A urora-A 的蛋
白表达；B : HepG 2细胞Aurora-A 蛋白及磷酸化水平的半定量分析.
bP <0.01 »s 其他 2 组.
图4 Aurora-A 及碟酸化Aurora-A 的蛋白表达水平
2.5 敲低A u n >r a -A 抑制H e p G 2细胞增殖并促进 其凋亡
结果显示，相比于对照组，A _m-A shRNA -l 组 细胞在24、48、96 h 时增殖均显著降低，差异有统计 学意义<0.01，图5A )。细胞凋亡检测结果显 示，对照组细胞凋亡率（4. 621 ± 1. 124)% ，阴性对 照组凋亡率（6. 7乃 ±2. 364)%，Aurora-A shRNA-l 组细胞凋亡率U 6. 321 ±5. 276)%，与对照组相比， 阴性对照组无差异（/?>〇.〇5)，入111^4止奶入-1组细
A : M TT 法检测敲低A urora-A 对HepG 2细胞增殖的影响；
B ：流式细
胞术检测HepG 2细胞凋亡；C : HepG 2细胞凋亡的半定量分析. *P <0.05, bP <0.01 ia 其他2 组.
图5敲低Aurora-A 对H e p G 2细胞增殖和凋亡的影响
3
讨论
H C C 是肝脏的原发性肿瘤，占肝脏原发性肿瘤
的90%以上，每年诊断出超过50万例新病例，并且 是全世界癌症死亡的第四大主要原因;9、尽管可以 采用栓塞化疗或术前经皮经肝动脉闭塞和生物疗法 等临床干预措施，但这些措施的总体效果仍然非常
有限[w]。人类肝癌发生发展的分子机制尚不完全清 楚，对其关键基因的分子调控网络知之甚少。因此， 有必要寻和研究与肝癌密切相关的核心分子，了 解肝癌发生发展的分子机制。近年来通过T C G A 、 G E 0数据库、转录组测序、小干扰R N A (Small i n t e r f eri n g R N A , siRNA )文库筛选、全基因组 CRISPR
基因敲除筛选等方法进行H C C 相关关键基因的筛 选，并探索相关的分子机制。通过G E 0数据库分析 肝硬化转化为肝癌相关的关键基因，发现细胞周期蛋
A 对照组
明性对照绀
shRNA-l
B 卜厂
□对照m □明性对照组
» shRNA-l
2.4 Aurora-A s h R N A 感染的 H e p G 2 细胞 Aurora-A 蛋白及磷酸化水平明显降低
Western b l o t 结果显示s h R N A -l 组与对照组相 比，A u r o r a -A 及磷酸化的A u r o r a -A 蛋白表达量明显 降低，差异有统计学意义(P <〇.〇l ，图4)。
I03-8 10 s I06 107
对照组m ‘
C
30 r -
培养时|nj (h }
#
二乙二醇二丁醚6.7%
2 1038 105 106 107.2 |〇38 丨05 106 1〇72
----------------------------------------------------------►
Annexinv-APC
阴性对照m
shRNA-1
工
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豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
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