《CellstemCell》lncTCF7经Wnt通路调控肝癌干细胞自我更新！ 客户单位：中国科学院生物物理所范祖森课题组
中康博提供：
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高通量生物信息分析（聚类分析、功能富集分析、KEGG信号通路富集分析）
推荐语: LncRNA介导的生物学已经牵涉于许多细胞过程。在癌症中，lncRNAs可作为转录调控因子与染质重塑复合物（SWI / SNF复合物）协作发挥功能。SWI/ SNF复合物参与哺乳动物干细胞自我更新和分化过程。然而，肿瘤干细胞中SWI / SNF复合物功能是什么仍然不太清楚。中国科学院生物物理所的范祖森研究员带领的研究小组在国际学术期刊《Cell Stem Cell》上在线发表了一项名为< The Long Noncoding RNA lncTCF7 Promotes Self-Renewal of Human Liver Cancer Stem Cells through Activation of Wnt Signaling >的最新研究论文，首次发现了一个新的非编码RNA—— lncTCF7, 它可以募集SWI / SNF复合物到TCF7的启动子区域来调节其表达，从而激活Wnt信号通路，进一步促进肝癌干细胞的自我更新。 研究示意图：
研究新颖点：
1. 三诺n50g长链非编码RNA——lncTCF7在肝癌组织和肝癌干细胞（CSCs）中高表达。十七届中央候补委员名单
2. LncTCF7对肝脏CSCs的自我更新至关重要。
3. LncTCF7通过调控TCF7的表达激活Wnt信号通路。
4. LncTCF7招募SWI / SNF复合体激活TCF7启动子。
研究思路：
研究结果：
1. 肝癌干细胞的筛选（样品筛选）awc
CD13和CD133已被广泛用作肝CSC表面标记。根据标志物，将Hep3B/Huh7和PLC / PRF的HCC细胞系分别分成CD13 CD133 细胞和CD13-CD133-细胞。研究发现：相比于CD13-
dsp管理器CD133-细胞，CD13 CD133 细胞的致瘤能力更强。
2. lncTCF7在肝癌干细胞中高表达（高通量筛选 验证）
为鉴定肝癌CSCs 的lncRNAs，采用来自3种细胞系的CD13 CD133 细胞（肿瘤干细胞）和CD13-CD133-细胞（非肿瘤干细胞）进行lncRNA芯片检测（Affymetrix）, 分析结果发现286个差异的lncRNA，随机选择10个lncRNAs进行PCR验证。研究选择了一个未鉴定的基因间lncRNA（命名为lncTCF7），由三个外显子组成，跨越将近3.6kb个碱基。研究者选择这个lncRNA出于以下三点考虑：
1. LncTCF7在肝脏的CSCs高表达。
2. 位于HSPA4和TCF7基因之间。
3. 位于细胞转录因子或干细胞信号通路相关基因附近。
接下来， 在37配对的HCC肿瘤和癌旁组织、14例乙型肝炎病毒（HBV）感染的肝肝硬化组织以及8例正常肝组织中验证lncTCF7的表达。结果发现：lncTCF7在HCC肿瘤中和肝癌
细胞系中显著高表达，而在肝硬化样品和健康肝组织中几乎检测不到，这表明lncTCF7表达具体疾病特异性。研究进一步通过Northern、RACE、RNA-FISH和细胞分级分离测定等实验确定lncTCF7是一个长度为683nt、位于细胞核的在肝癌干细胞中高表达的长链非编码RNA。
3. lncTCF7维持肝癌干细胞的自我更新（功能研究）
为了研究lncTCF7在肝癌干细胞的自我更新作用， 研究构建了lncTCF7细胞突变株。lncTCF7的敲降后转录因子Sox2，Nanog和Oct4的表达显著下调，并且显著抑制肝癌干细胞的致瘤成型能力。接下来，为进一步验证所得结果，构建了lncTCF7过表达细胞系。LncTCF7过表达显着上调转录因子的表达，也显著增强肿瘤干细胞致瘤成型能力。这些数据表明，lncTCF7在肝癌干细胞的自我更新维护中起关键作用。
4. lncTCF7激活TCF7的表达从而活化Wnt通路（lncTCF7的靶基因及通路研究）
为了进一步探索lncTCF7的靶基因， 研究采用对照组 lncTCF7敲降组的分组方式，收集细胞样品进行表达谱芯片检测，发现了2491个差异基因，其中就包括它的临近基因TCF7(HS
PA4，另一个邻近基因显示任何显著改变)。接下来对差异基因进行功能通路富集分析，发现这些差异基因涉及很多重要的信号通路，特别是Wnt信号通路（Wnt通路的相关基因）。后又通过在HCC细胞系（Hep3B/Huh7/PLC）和肝癌原代细胞中进一步验证TCF7和主要Wnt靶基因的表达水平。此外，lncTCF7过表达会显着增强TCF7和主要Wnt基因的表达。这些数据初步确定lncTCF7的靶基因——TCF7和Wnt相关基因。接下来，构建TCF7敲降细胞系。TCF7敲降后抑制Sox2的表达，且显著抑制肝癌干细胞的自我更新和致瘤成形能力。
TCF7位于lncTCF7附近，两者又存在表达差异，很符合顺式调控的类型。研究者收集了30例肝癌患者样品进行PCR检测, 发现lncTCF7与TCF7在表达值上呈正相关。
接下来，要进一步确定TCF7是否在lncTCF7的下游发挥自我更新作用，研究在lncTCF7敲降细胞中导入重组TCF7质粒， 发现TCF7恢复了肝癌干细胞的致瘤成形力和增殖力。 LncTCF7敲降后会显著下调部分Wnt分子，包括Wnt7a、Wnt4和Wnt2b等。在这3种Wnt信号分子， Wnt7a的表达量下调最为显著。
为了进一步确定Wnt7a是否在lncTCF7和TCF7的下游发挥作用， 研究在lncTCF7敲降细胞
中导入重组Wnt7a质粒，发现Wnt7a能恢复肝癌干细胞中TCF7、Sox2和Nanog的表达水平，也能恢复肝癌干细胞的致瘤成形力。 DKK1是Wnt信号通路的胞外抑制剂。DKK1的处理封闭了肝癌干细胞中lncTCF7维持的自我更新能力。这些数据表明，lncTCF7 在 TCF7的上游调控肝癌干细胞的自我更新能力。总之，lncTCF7促进TCF7表达来激活Wnt信号通路，导致肝CSC的自我更新。
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