人外周血免疫细胞亚25流式全景分析摘要：人外周血是最容易获取的人体样本，在医学类科研工作中至关重要。如何最大化、最高效地观察和利用有限的人外周血标本，通过一次实验检测得到更多的结果指标，对现有的实验研究意义重大。因此本文主要描述如何进行25流式检测及介绍相关分析方法，通过对单个细胞同时检测25个参数，可以实现对外周血各种免疫细胞亚的全景式描述，以及对某种细胞亚的深度表型分析。 关键词: 人外周血, 亚分类, 25流式分析
材料与试剂
材料：
1.
2. 15 ml离心管 (Corning, catalog number: 430791)
3.
4. 10 ml移液管 (Corning, catalog number: 4488)
5.
6. 1.5 ml离心管 (Axygen, catalog number: MCT-150-C)
7.
8. 96孔圆底板 (Corning, catalog number: 351177)
9.
10. BD Falcon流式管 (Corning, catalog number: 352052)
11.
12. 70 μm滤膜 (Corning, catalog number: 352350)
13.
14. 肝素抗凝管
试剂：
1.
2. Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set (Ms Ig Kpa Comp Bead
Set 6Ml, BD Biosciences, catalog number: 552843)
3.
4. Lonsera乌拉圭 (南美) 特级胎牛血清 (Lonsera, catalog number: S711-001S)
5.
6. Lymphoprep (Stemcell, catalog number: 07851)
7.
8. 20x PBS缓冲液 (生工，catalog number: B548117)
9.
10. 0.5 mol/L EDTA (生工，catalog number: B300599)
11.
12. Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl (Lonza, catalog number: 17-942E)
13.
14. 1x PBS (见溶液配方)
15.
16. FACS buffer (见溶液配方)
17.
抗体：
1.
2. Mouse antihuman CD32-BUV395 (BD Biosciences, custom)
3.
4. Mouse antihuman CD16-BUV496 (BD Biosciences, custom)
5.
6. Mouse antihuman CD19-BUV563 (BD Biosciences, custom)
7.
8. Mouse antihuman IgD-BUV615 (BD Biosciences, custom)
9.
10. Mouse antihuman CD4-BUV661 (BD Biosciences, custom)
11.
12. Mouse antihuman CD64-BUV737 (BD Biosciences, custom)
13.
14. Mouse antihuman CD14-BUV805 (BD Biosciences, custom)
15.
16. Mouse antihuman CD57-BV421 (BD Biosciences, custom)
17.
18. Mouse antihuman CD3-BV480 (BD Biosciences, custom)
19.
20. Mouse antihuman CD15-BV650 (BD Biosciences, custom)
21.
22. Mouse antihuman CD27-BV711 (BD Biosciences, custom)
23.
24. Mouse antihuman CD20-BV750 (BD Biosciences, custom)
岛屿最多的国家25.
26. Mouse antihuman CD197-BV786 (BD Biosciences, custom)
26. Mouse antihuman CD197-BV786 (BD Biosciences, custom)
27.
决定论和非决定论的分歧在于
28. Mouse antihuman CD45RA-BB515 (BD Biosciences, custom)
29.
30. Mouse antihuman TCRgd-BB630 (BD Biosciences, custom)
31.
32. Mouse antihuman CD195-BB660 (BD Biosciences, custom)
33.
34. Mouse antihuman CD8-Percp-cy5.5 (BD Biosciences, custom)
35.
36. Mouse antihuman CD38-BB790 (BD Biosciences, custom)
37.
38. Mouse antihuman CD11c-PE (BD Biosciences, custom)
39.
40. Mouse antihuman CD13-PE-CF594 (BD Biosciences, custom)
41.
42. Mouse antihuman CD123-PE-Cy5 (BD Biosciences, custom)
43.
44. Mouse antihuman CD25-PE-Cy7 (BD Biosciences, custom)石油化工装置工艺管道安装设计手册
45.
46. Mouse antihuman CD127-AF647 (BD Biosciences, custom)
47.
48. Mouse antihuman CD56-APC-R700 (BD Biosciences, custom)
49.
50. Mouse antihuman HLA-DR-APC-H7 (BD Biosciences, custom)
仪器设备
1.
2. 实验室2级生物安全柜 (Thermo Scientific™ 1300 Series A2 Biological Safety Cabinet
Packages)
3.
4. 高速离心机 (Thermo Scientific™ Sorvall™ ST 40离心机)
5.
6. 倒置相差显微镜 (Olympus, model: CKX41)
7.
8. 血细胞计数板 (Sigma-Ardrich, model: BR717805-1EA)
8. 血细胞计数板 (Sigma-Ardrich, model: BR717805-1EA)
9.
10. X30流式细胞分析仪 (BD FACSymphony™系统)
11.
12. 电动移液器 (Eppendorf, model: 4430000018)
实验步骤
一．人外周血免疫细胞的制备 (Gupta等，2013)
1.
2. 准备洁净的15 ml离心管，倒入3 ml lymphoprep。抽取健康人外周血置于肝素抗凝管中备
用，在无菌的15 ml离心管中加入3 ml人外周血, 再加入3 ml 1x PBS后 (文中未特殊说明均为1x PBS) 进行混匀稀释。左手倾斜离心管，右手用移液器吸取稀释后的外周血缓慢加到lymphoprep表面，形成密度梯度。在加入外周血的过程中，可适当缓慢摆正离心管，注意加液体时要轻柔，移液器的速度调整到最低，以免将lymphoprep和外周血混匀 (图1)。
图1. 密度梯度离心上样结果示意图
3.
4. 400 x g，20 min，升速 (ACC) 1，降速 (DEC) 0，室温进行密度梯度离心。
5.
带锈防锈剂6. 离心结束后离心管内液体分为5层，从上到下分别为：血浆，外周血单个核免疫细胞 (包括
外周血单核细胞和淋巴细胞等)，lymphoprep，粒细胞，红细胞 (图2)。准备干净的15 ml离心管，加入10 ml PBS，用吸管吸取第二层的外周血免疫细胞并转入含有PBS的离心管中，上下颠倒后放入离心机800 x g，10 min室温离心 (视频1)。
图2. 密度梯度离心产物示意图
视频1. 吸取密度梯度离心后中间层淋巴细胞和单核细胞的过程
7.
8. 离心结束后去上清，轻弹管底，再加入10 ml PBS，上下颠倒后放入离心机400 x g，5 min
室温离心。
9.
10. 重复步骤4清洗外周血免疫细胞以彻底去除残留的lymphoprep。
11.
12. 最后得到的细胞沉淀就是外周血免疫细胞，可用PBS重悬细胞后进行细胞计数。理论
上，1 ml外周血可得到1 x 106左右外周血免疫细胞。
二． 25流式染实验 (参考文献1)
25流式染和正常流式染步骤一致，本实验研究的25全景分析所用的抗体均为表面抗体，因此只需要进行常规流式表面染。 1.
2. 配制抗体混合物。一个反应体系为100 μl，按照抗体说明书建议的最佳稀释比例 (2.5
μl/test) 用FACS buffer (见溶液配方) 对不同的抗体进行稀释。
注：由于最终体积为100 μl，且人相关抗体的使用量较多，所以溶剂FACS buffer的体积需要减去各个抗体的使用体积。且所有的抗体需要避光操作，避免荧光猝灭；抗体开盖之前需要先离心避免管壁上的抗体飞溅引起浪费；抗体不易长时间在室温放置，建议置于冰上使用。
3.
4. 取1 x 106个外周血免疫细胞，用抗体混合物重悬细胞，置于96孔板中，充分混匀后4 °C避
光孵育30 min。
5.
6. 染结束后，直接加入150 μl FACS buffer清洗细胞，400 x g，5 min室温离心。
7.
中国统计年鉴2013
8. 离心结束后去上清，用300 μl FACS buffer分两次重悬细胞沉淀，再将细胞通过70 μm滤膜
过滤到流式管中，即可上机观察。
9.
10. 在表面染的过程中，我们需要制作25染方案的单染管用于流式自动调节补偿。取26
个流式管，分别标上各个通道的荧光名称，第26个为空白管，每个流式管中加入两滴Ms Ig Kpa Comp Bead (约有50 μl的体积)，混匀后，对应管壁上标注的荧光通道加入之前染使用的表面抗体各0.25 μl，1:200稀释。充分振荡混匀后4 °C避光孵育15 min，各加入400μl FACS buffer，混匀后即可用于流式分析。
注：Ms Ig Kpa Comp Bead使用前需要充分摇匀。
三． 25全景分析 (van der Maaten和Hinton，2008；Wallach和Liliean，2009；Monaco
等，2016)
得到流式结果后，需要使用正版flowjo V10软件对结果进行全面分析 (视频2)。
绝密武器电影视频2. 各类淋巴细胞圈门过程
1.
2. 在flowjo V10中导入数据后，我们需要对25补偿进行手动调整。主要是因为小球调整的
补偿和细胞真实的补偿存在一定的差异，所以还需要手动确认 (图3)。
图3. 手动确认补偿的结果对比图
3.
4. 去除原始数据中由于液流不稳定等机器原因导致的噪音信号。主要使用plugin插件中的
flow AI得以实现 (图4)。
注：使用flow AI选择参数时，必须选中time参数，不然将无法计算相关参数。
图4. 运行flow AI的参数选择
5.
6. 运行结束后，我们将看到原始数据拆分成了bad events和good events两项。之后我们可
以对good events进行常规的圈门统计分析 (图5)。
图5. Flow AI运行后的结果界面
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