张可珺，帖儒修，陈 伟，邓少丽，陈 鸣 （400042 重庆，第三军医大学大坪医院野战外科研究所检验科）
［摘要］ 目的 探讨流式细胞仪在急性粒细胞白血病（AML）免疫分型中的特点和规律。方法 利用流式细胞术中CD45/SSC双参数散点图设门法，对四荧光素（FITC、PE、PC5、ECD）标记的骨髓血细胞免疫表型分析。取初发患者骨髓单细胞悬液100μl加入到测试管中，再加入特定抗体，室温避光1 h，然后经溶血处理，上机检测。每管均设置同型对照。结果 在76例AML中，髓系相关抗原cMPO、CD33、CD65表达最高，总阳性率分别为：96.1%、94.7%和93.4%，CD13、CD15、CD16的表达率较低，总阳性率分别为：50.0%、63.2%和89.5%；CD14、CD64在M4、M4EO、M5中阳性率最高；CD41、CD61在M7中的阳性率最高；CD34在M1和部分M2中强表达，但总阳性约为46.1%。结论 利用流式细胞术对患者骨髓血细胞进行多指标联合分析其免疫表型，与FAB分类符合率高达97%；本研究对本地区AML患者骨髓中髓系细胞特异性抗原表达阳性率进行评估；同时结合散点图分布特征成功实现对AML的诊断与分型。
［关键词］ 白血病；流式细胞术；免疫分型
[中图法分类号] [文献标志码] B
细胞免疫表型分析是从分子水平对血液恶性肿瘤进行分型诊断、预后评估的一种方法。与该类疾病诊断用的金标准FAB法比较，流式细胞术（flow cytometry, FCM）具有大量收集细胞，对该细胞进行分类和细胞膜及胞内蛋白质进行定量分析的独特优势[1]。但FCM应用临床以来，对AML分型诊断不够全面，不够规范，本研究应用CD45/ SSC 法设门，用四荧光通道的FCM检测76例AML分化抗原表达和散点图分布特征及于FAB分型比较进行分析。
1 资料与方法
1.1 标本来源
76例骨髓标本来自第三军医大学大坪医院血液科在2008年1月至2010年3月的初诊住院患
者，其中男性36例，女性40例，年龄为20～79岁，中位年龄55岁。所有病例均为FAB法和临床诊断确诊病例。
1.2 标本采集
标本采集均按无菌操作规程，取患者髂后上棘位骨髓液3～ 5 ml (无菌) ,用EDTA-2钾抗凝，30中华灵芝宝 min内送检验科。
1.3 荧光抗体标记
所有单克隆抗体均购自Backman Coulter公司，所有标本均采用四直接免疫荧光标记法。具体操作步骤见文献[1]。本研究选用髓系相关的cMPO、CD33、CD65、CD13、CD15、CD16、CD14、CD64、CD41、CD61、CD71、CD235a和系列非相关性的CD34、CD45等荧光标记的特异性单克隆抗体。抗体组合设计为：①cMPO-FITC+cCD22-PE+CD45-PC5sap2000；②CD65-FITC+CD15-PE+ CD45-PC5；③CD14-ECD+CD33-FITC+CD45-PC5；④CD61-FITC+ CD41-PE+CD45-PC5；⑤CD64-FITC+CD45-PC5；⑥CD13-FITC+ CD45-PC5；⑦CD16-FITC+CD45-PC5；⑧CD235a-FITC+CD71- PE+CD45-PC5；⑨CD38-FITC+CD34-PE+CD45-PC。
1.4 流式细胞仪及试剂
仪器为美国Beckman Coulter公司生产的EPICS XL型流式细胞仪，激光波长为488 nm，输出功率200 mW，检测前先用荧光微球进行常规光路校正及调整荧光补偿。检测时以CD45/ SSC 双参数散点图设门,每测定管收集10 000 个细胞，以线性放大器（LIN）收集前向角散射光（FSC）侧向角散射光（SSC）信号，以对数放大器(LOG) 收集荧光信号FL1 (530 nm)、 FL2(585 nm)、FL3 (670 nm)，FL4(675nm)。测量数据和图形输入G4Apple 计算机,应用Cell Quest 程序软件进行信号处理。所有荧光直标(FITC、PE、ECD、PC5) 抗体、破膜剂ReagentI\II、溶血剂等试剂均购自美国Beckman Coulter公司。
1.5 中华人民共和国外交部声明同型对照的设置
本研究中所选用的同型对照为人IgG1-PE/IgG1-FITC
/IgG1-PC5，即以该种抗体混合物对所分析的骨髓细胞进行标记，排除特异性抗体的非特异性结合，检测时利用同型对照结果调试电压和补偿，将不同抗体的非特异性结合排除为零。
1.6 统计学处理
结果用SPSS 10.0 软件进行相关分析。
2 结果
2.1 76例AML患者骨髓白细胞免疫分型
总阳性率指某一分化抗原在各型AML中的阳性例数占总AML例数的百分数。由表1可见，76例AML中，大部分类型中cMPO、CD33和CD65都呈阳性，只有M7时为阴性，该3项指标总阳性率依次为96.1%、94.7%和93.4%；其次为CD13、CD15、CD16，这3项指标在AML中的阳性率较低，其中CD16的阳性率最高，该3项指标总阳性率依次为50.0%、63.2%和89.5%；CD14、CD64在M4、M4EO及M5中都呈阳性，CD64偶尔会在少数M2中阳性表达，由于这3型AML较M2少见，因此以上2项指标总阳性率有所下降，分别为10.5%和14.5%；CD41、CD61在M7中都呈阳性表达；M6是极为少见AML,其中CD71、cMPO、CD33都呈阳性表达，但CD235a为阴性；CD34只有在M1中阳性表达率最高，而在M2中只有约52%，在其他型中的阳性率更低，其总阳性率约为46.1%。
表 1 76 例成人 AML 患者各亚型主要抗原的表达( %)
FAB 分型 | unixlinux 例 数 | MPO | CD33 | CD65 | CD15 | CD13 | CD16 | CD14 | CD64 | CD41 | CD61 | CD71 | CD 235a | CD34 |
M1 M2 M3 M4 M4EO 耶律隆绪M5 M6 M7 总阳 性率 | 1 58 5 3 1 4 1 3 | 100 100 100 100 100 100 100 0 96.1 | 100 96.6 100 100 100 100 100 0 94.7 | 100 100 80.0 100 100 100 0 0 93.4 | 100 48.3 20.0 100 100 75.0 0 0 50.0 | 100 65.5 40.0 33.3 0 75.0 0 0 63.2 | 100 100 20.0 100 100 100 0 0 89.5 | 0 0 0 100 100 100 0 0 10.5 | 0 5.2 0 100 100 100 0 0 14.5 | 0 0 0 0 0 0 0 100 3.9扬州大学网络教学平台 | 0 0 0 0 0 0 0 66.7 2.6 | 0 0 0 0 0 0 100 0 1.3 | 0 0 0 0 0 0 0 0 0 | 100 51.7 40.0 33.3 0 25.0 0 0 46.1 |
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2.2 76例成人AML免疫分型与FAB分型的比较
经统计分析，FCM分型与FAB分型符合率达97%。
2.3 76例成人AML各型AML CD45/SSC双参数散点图分布特点
异常细胞均设置为A门中，在CD45/SSC散点图中位于原始细胞区，而只有M3中，异常幼稚粒细胞在粒细胞区。异常原始细胞占收集总细胞数量百分比均符合FAB法对AML分型的标准。其中，M1中原始粒细胞大于骨髓非红系有核细胞（NEC）的90%；M2中原始粒细胞占NEC比例介于30%～89%；M3中以早幼粒细胞为主，该类细胞在NEC中大于30%，该型缺乏增多原始粒细胞；M4是以原始粒细胞与不同分化阶段单核细胞共同增多为特点，其中各阶段原始单核细胞占A门中总细胞数的20%以上; M5中各阶段单核细胞占NEC80%以上；M6中A门细胞包括幼稚红细胞和原始粒细胞等，其中幼稚红细胞在50%以上；M7, 原始巨核细胞大于30% 。见图1。
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A：M1 | B：M2 |
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C：M3 | D：M4 |
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E：M5 | F：M6 |
| 图1 76 例 AML 患者各型CD45/SSC双参数散点图分布特点 |
G：M7 | |
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3 讨论
目前，国内外均未有完整的关于AML的免疫分型结果，而且国外很少利用散点图分布特点进行分析，而本研究将以SS\CD45为参数分析散点图的分布特点，结合各种特异性抗原表达变化来综合分析，并形成了完整的AML免疫分型诊断典型图形。
分析对AML免疫分型诊断所用指标价值的大小十分重要[2]。由表1可见，cMPO在各型AML诊断中的价值最大，阳性率达100%,该指标随着在粒细胞和单核细胞中都表达，而且细胞越成熟，表达越高；其次为CD33和CD65，阳性率同样很高，CD33在M3中阳性表达率最高，对该型诊断有较高价值[3]；但在M7时，cMPO 、CD33和CD65都可呈阴性表达；此外，在M6时，cMPO 与CD33常为阳性表达； CD33 在M2中表达略低于M3，在M5、M7表达也较低，与理论认识中在非成熟粒细胞表达较高保持相一致[4]；CD65表达与cMPO相似，细胞越幼稚表达越低；CD13、CD15在AML中的价值较低，其阳性率较低，且无稳定规律表达，目前认为，CD15和CD16在较为成熟粒在细胞表达，尤其是CD16常可作为判断粒细胞成熟度的较好指标，CD14和CD64在诊断M5和M4中的价值最大[5]，CD14的特异性强于CD64,后者还偶表达于受特定刺激的中性粒细胞膜表面，由于M5和M4较为少见，
因此在本研究AML中阳性率都较低[6]；CD41和CD61对诊断M7价值很大，特别是CD41表达量较高，但其阳性率与CD61表达相一致[7]。特别指出CD34表达在M1表达较高，其他型AML中表达都较低，在总AML患者阳性率为48.6%，这就意味着仍有约50%的AML患者其骨髓血细胞CD34表达并不增高，或分析时错过增高时期[8]。
FCM免疫分型与FAB分型在AML诊断中符合率均很高，基本实现了应用FCM对AML进行免疫分型，不再依赖于FAB分型方法；而且随着新的特异性CD分子的不断发现，FCM检测可以实现对AML进行更为细致的分型，这必将更有利于实现AML的个性诊断和[9]。
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