ELISA时一抗 二抗反应完洗涤时都用PBST，而
WESTERN BLOT时却用PBS就行，这是为什么呢？
PBST即在PBS中加入Twen-20,Twen-20起的是什么作用呢？
Tween是一种离子表面活性剂，它可加速抗体非特异性结合的分离。加入Twen-20是为了有更好的洗涤效果，可以说是一种去污剂，我们这儿WESTERN BLOT也用的是PBST。只要多洗几遍，ELISA时一抗 二抗反应完洗涤时用清水也可以。
2、固定:4% PFA 15min;
3、PBST冲洗， 5min×3
4. 0.1% Triton/PBS 透化20min
5. PBST冲洗， 5min×3
6、用BSA封闭液封闭1h
7、加一抗RT 1h或4℃过夜；
8、PBST，5min×3
9、加入荧光标记二抗(1:200 PBST稀释) 1h in dark 10、PBST 5min×3
11、DAPI(1:1000 PBST) 10min
12、PBST 5min×3
13、封片观察并照相。
培训经理认证1) 二甲苯 2) PBS缓冲液
3) 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
4) goat血清
5) 一抗稀释液： 3%BSA in TBS，pH7.4
操作流程 1.脱蜡和水化
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60℃恒温箱中烘烤20min。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min； 2）无水乙醇中浸泡5min； 钠长石
3）95%乙醇中浸泡5min；
4）70%乙醇中浸泡5min；
2.PBS洗两次各5min。
3.抗原修复，用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热 0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15min，必须等缓
冲液冷却后，方能将切片取出。
4.PBS洗5min。
5.滴加5%正常山羊血清，室温封闭30min，甩去多余液体。
第六次人口普查 6.滴加一抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45min）。
7.PBS洗3次每次5min。
8.滴加荧光标记的二抗，室温避光孵育1h。（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、 Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200，用锡箔纸包住培养板放在抽屉中避光。）
9.PBS洗3次每次5min。
10. Hoechst染：把1000×Hoechst用PBS稀释，50ul/片，染10min。
11. PBS洗3次每次2 min。
福克纳12.封片： Mounting Medium封片，等Mounting Medium凝固后再拍照。
石蜡切片免疫组化染步骤
三步法（以SP试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
日本水蜜桃桃子 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37无敌推销员℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第
二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显剂显（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
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