漆酶(1accase)是一种含铜的多酚氧化酶，通常由500个氨基酸单一多肽组成,其中含有19种氨基酸，漆酶有一定的含糖量[1]。真菌漆酶是一种糖蛋白，由肽链、糖配基和Cu2+ 三个部分组成，分子量在60-390kDa之间[2]。肽链一般由500-550个氨基酸组成[3]，糖配基有氨基己糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖，占整个分子重量的10%-80%。糖配基组成及含量的不同是漆酶分子量存在较大差异的主要原因。 漆酶一般含有4个铜离子(P. radiate漆酶除外,仅含2个铜离子,无3号铜离子)。根据其光谱特征,可划分为3种类型的铜: 1号铜(只有一个铜离子,顺磁性)具有典型的蓝铜谱带:紫外可见光谱上600nm [ε: 5000 (mol·L-1cm)-1]处出现峰值,在EPR (电子顺磁共振)谱上有一个小的平行超精细耦合结构[A11:(4070) * 10-4cm-1],它参与分子内的电子传递,把电子从底物传递到其他铜原子上; 2号铜(只有一个铜离子,顺磁性)只具一般的EPR谱带(A11>140×10-4m-1); 3号铜由2个3号铜原子通过一个OH桥配位连接起来,组成双核铜区,具有抗磁性,因而在EPR上无谱带,紫外可见光谱上330nm处的肩峰是3号Cu2+的特征峰。漆酶空间结构更详细的资料来自其晶体衍射的研究。含四个铜原子的酶分子是常见的形式,而某些酶蛋白的辅基有例外
的情况。Karhunen E[4]等的研究指出,phlebia radiata产生的漆酶中只含有2个铜原子，另外还有一分子的有机小分子辅基吡咯喹琳醌(pyrroloquinolin-equi-none, PQQ),该辅基在分子中扮演类似Ⅲ型铜原子的功能。
漆酶能够催化酚类、芳胺类、羧酸类、甾体类激素、生物素、金属有机化合物和非酚类物质生成醌类化合物、羰基化合物和水，属于铜蓝氧化酶(或称为铜蓝蛋白酶)中的一小族，广泛存在于真菌、植物和昆虫中，有报道细菌也能产生漆酶I21。漆酶含有的铜离子，它们位于酶的活性位，在氧化反应中能够协同传递电子并将氧还原成水。目前, 研究最多的产漆酶微生物大多是白腐真菌, 主要有黄孢原毛平革菌、彩绒革盖菌、变栓菌、射脉菌、凤尾菇等。 1883年Yoshida[5]最先从漆树液中发现了漆酶131，后来被Bertranc命名。我国最早研究漆酶的是刘国智、黄葆同等，他们于20世纪50年代末利用漆酶在催化反应中需要消耗氧气的特性，设计了漆酶酶活的测定方法。随后，直到20世纪80年代末，国内对于漆酶的研究一直停留在漆酶酶活的测定、漆酶表观特性的描述性研究上；与此同时，漆酶的分离纯化、动力学特性和固定化的研究也开始起步。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，漆酶
的研究也取得了令人瞩目的成绩，学者们已经测定了漆酶的氨基酸序列，克隆了它的基因，并研究了漆酶的编码基因及其表达调控机制。以上种种研究成果都推动了漆酶在食品、环保等工业方面的应用。目前，在国内漆酶主要被应用在环保工业上，特别是在污水处理、纸浆的生物漂白及有毒化合物的生物降解等方面。
Ⅰ 性质
1真菌漆酶的理化性质[6]：
①含糖量：近来有研究发现,含糖量高的漆酶既不能提高漆酶的热稳定性,也不能阻止由紫尿酸自由基引起的漆酶失活。这一实例打破了原有认识:糖基化和漆酶的分泌、铜原子的保留以及热稳定性的提高有关。
②氧化还原电势：木材中最主要的木质素结构单元是非酚型单元美国经济简介,其氧化还原电势较高。到目前为止,已发现漆酶的最高氧化还原电势不超过800mV,这对氧化非酚型单元是显然不够的。近来发现,漆酶能氧化一些氧化还原电势高于漆酶的介体。后来,有人研究发现漆酶的氧化还原电势与其对介体的氧化并没有直接的联系,但对一个有效的漆酶-介体体系来说,漆酶必须有一个足够高的氧化还原电势使漆酶对介体的氧化在动力学上成为可能。
③等电点(PI): 大多数漆酶的PI值在3-5的范围内。
④分子质量：不同的漆酶,氧化能力不一样,其分子质量也相差很大。
⑤N端氨基酸序列：同源性担子菌漆酶的N端氨基酸序列具有很大的相似性,而已知的子囊菌N端氨基酸序列都不具有相似性,与担子菌漆酶的序列也相差很大。对于同一种漆酶的同工酶来说,它们的N端氨基酸序列非常相似,甚至完全相同。
⑥挑山工教学实录漆酶的氧化特性：漆酶是单电子氧化还原酶，可以催化6类底物：酚及其衍生物；芳胺及其衍生物；羧酸及其衍生物；甾体激素和生物素；金属有机化合物；其它非酚底物。漆酶氧化速率的大小不仅与漆酶本身的稳定性有关，而且也与漆酶与底物作用的一些动力学参数如K(表观速率常数)有关。
⑦对抑制剂的敏感性：一般来说,铜螯合剂对漆酶的活性都有抑制作用不同的抑制剂对漆酶活性的抑制作用不一样。同一种抑制剂对不同的菌种其抑制作用也不一样。
⑧反应动力学：在一定的温度范围内，随着反应温度的升高，漆酶的酶活力增加。但温度越高，漆酶越不稳定，越易失活。酶活性随温度的升高先升高后降低。pH值对漆酶酶活性
亦有类似影响。一般来说，大多数漆酶在碱性环境中不稳定、易失活。因此，把漆酶用于纸浆漂白时应同时考虑漆酶的稳定性和反应的最适温度及pH值，以达到最佳的漂白效果。
如何提高漆酶的稳定性已成为许多研究者研究高效漆酶的一个重要内容。近来有报道，C. thermophilium漆酶比一般的真菌漆酶具有更高的热稳定性并在pH值为6.8时反应较适宜。漆酶反应的最适pH值随反应底物的不同而不同, Km值也不同。Km值的大小可以反映出漆酶对底物亲和力的大小，而漆酶对底物的亲和力又是影响漆酶氧化底物速率的一个重要因素。Km值越小，亲和力越大，漆酶对底物的氧化率也就越高。
测定漆酶活性的方法有HPLC法、测压法、分光光度法、级谱法等。目前常以3-乙基苯并噻唑-6-磺酸(ABTS)为底物,测定酶对其的氧化速度。以ABTS 为底物测定漆酶酶活是目前国外最为常见的方法之一。
文献报道，以巨噬细胞ABTS 为底物测定漆酶酶活力，漆酶的最适温度大约在30-60℃病毒唑注射液。且稳定性较好。在pH=3 时酶活最高，在pH=5-7之间稳定性较好。[7]
2 真菌的分子生物学及其生物学功能
⒈ 漆酶的分子生物学研究[4]
当前,漆酶的分子生物学研究主要体现在三方面:漆酶基因的克隆、漆酶基因结构和组织分析、漆酶基因的异源表达。已研究的漆酶基因中都含有10个左右的内含子,这些内含子在活性域位置上有比较高的保守性。一些特殊序列的存在与否决定了该酶的表达形式-饮食与健康的关系诱导型或组成型,诱导型菌株的调控序列中含有一段受酚类化合物作用的序列,而不含有该序列的酶基因则都是组成型表达的。漆酶的异源表达和表达调控则还有很多工作要做,这些工作的突破将使漆酶的应用和它在个体发育中的功能得到分子水平上的解释。
⒉ 漆酶的分子生物学功能
漆酶的分子生物学功能体现在四方面:对植物的保护作用,如Botrytis Cinerea菌产生的胞外漆酶可保护植物免受感染和腐烂;对植物形态产生的作用,如根状体菌丝体束的形成,就是因为漆酶能在细胞间催化酚类化合物的聚合黏连来固定菌丝;参与木质素的生物合成、降解和土壤腐殖质的形成;漆酶参与连续反应链中起传递电子和催化氧化作用。
Ⅱ 应用武汉市人民警察培训学院
㈠ 在食品加工中的应用
漆酶在食品工业上的应用是近20年发展起来的，主要在饮料加工、食品成分测定以及食品组分功能改进等方面。
⒈ 饮料加工
饮料中的酚类化合物极易发生氧化反应，从而引起饮料的后混浊、泽加深及香味与口感下降等问题，最终导致饮料变质。而漆酶能够氧化多酚类物质生成多酚氧化物，多酚氧化物自身能够发生再聚合，形成可以被滤膜截留的大颗粒，最终达到净化饮料的目的。由于这一催化反应专一性强，污染问题少，澄清的果汁浅且稳定，因此漆酶的应用成为饮料加工中的热点。研究表明，漆酶的作用效果不仅优于物理、化学方法，也优于其它酶(如单宁酸酶、酚酶和花素酶等)的作用效果[8]。20世纪90年代初还出现了利用固定化漆酶去除多酚物质的技术，即通过物理或化学的方法将漆酶以共价结合的方式固定于有机物或无机物的支持介质上，然后用于除去多酚；使用的介质包括分子筛、硅胶、琼脂糖、戊二醛等。由于固定化漆酶储存在适当的条件下，活性损失很小，并可重复使用，使其在食品加工中有着广泛的应用前景。
⒉ 食品成分测定
以Meneguzzo 为代表的部分学者认为漆酶酶活的变化与葡萄饮料变质程度成正相关；而以Perino为代表的另一部分学者则认为二者间并不存在正比关系，酶活的变化是由灰霉菌引起的。虽然对此争论还未达成共识，但如果漆酶果真能够作为葡萄饮料的变质指示剂，那么将出现一种快速简便的葡萄饮料变质检测方法。
⒊ 食品成分的功能性改进
Pertersen利用漆酶中铜离子的催化特性，除去沙拉、蛋黄酱等食品中溶解的氧，消除了食品中的亚麻酸和溶解氧反应生成的挥发性异味组分，达到了改良食品感官参数的目的。在烘烤工业中，漆酶通过氧化芳香族氨基酸，使得烘焙制品口感酥软、风味好、体积大、硬度低、稳定性好。
⒋ 生产食用菌
木耳、香菇、猴头、多脂鳞伞、亚侧耳、草菇等食用菌中都含有漆酶，由于漆酶所具有的催化活性，使其在食用菌的生产中起着至关重要的作用。其主要作用有：参与木质素的降
解，为菌体的生长发育提供营养；参与菌体的呼吸作用，促使菌体生长发育；利用其对木质素的特殊降解作用，使液体培养菇类成为可能；在菇类的袋料栽培过程中，参与菌简转而改善产品质量；能有效抑制杂菌的污染。
㈡ 在环保工业中的应用
利用酶制剂进行污染物处理和环境监测具有效率高、速度快、可靠性强等优点，因此酶和酶技术在环境治理方面具有较高的应用价值。现代环保技术应用漆酶进行生物整治和生物漂白，给环境保护带来了光明的前景。
⒈ 生物整治
生物整治主要包括工业废水处理、有毒农药的分解等，其目的有二，一是从排除物中除去有害物质并降低其毒性，二是将有害物质转变为有经济价值的产物。漆酶能够降解广泛应用于染料、颜料、防腐剂、除草剂、杀虫剂和杀菌剂等化学制剂中的氯酚类化合物和苯胺取代物[9]，而在生物整治中被广泛应用。近年来,随着人们环保意识的增强,漆酶在污水治理方面的作用显得越来越重要,成为酶工程与环境保护交叉领域研究的热点。
⒉ 生物漂白和脱
生物漂白，就是利用微生物或其分泌的酶处理纸浆，达到脱除木素、改善纸浆的可漂性并提高纸浆白度的一种方法。真菌漆酶具有单电子氧化还原电位高、催化活性强等特点,可以氧化芳香环化合物,对纺织染料的脱及降解效果明显。目前许多工厂排放的有毒废水对环境造成了严重污染，大量化学品的使用使这种情况更加严重。用生物学方法进行废水处理，不仅能减轻环境的压力，而且能提高产品的品质。因此，利用漆酶进行生物漂白和脱将更加现实和可行。
㈢ 其他应用
漆酶可催化木质素降解，在纸浆生产过程中添加一定量的漆酶可以增加纸浆的得率，提高经济效益，因而可将其应用于造纸工业。漆酶还可催化木素(例如碱木素、硫酸盐木素、溶剂木素等)氧化聚合形成生物胶粘剂，在刨花板生产过程中，这种胶粘剂可以用于木材纤维的胶合，此方法可有效地减少化学胶粘剂的使用量，不仅节约了生产本，还有利于环境的保护。此外，漆酶还被应用于生物检测、医药、纺织等工业中。
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