HPLC使用注意事项 1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜 过滤)。 2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。 4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲 洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆 外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。 7.C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 8.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查 并清洗。清洗方法；①以异 丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清 洗；⑧用10％稀硝酸清洗。 9.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。
10.如果进液管内不进液体时，要使用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相 的清洗。
11.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
12.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的 流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
高效液相谱常见故障的断定及解决诊状 可能的原因 解 决 方 法
(一)保留时间变化
1.柱温变化 柱恒温，必要时需配置恒温箱
2.等度与梯度间未能充分平衡 至少用10倍柱体积的流动相平衡柱
3.缓冲液容量不够 用》25mmol/L的缓冲液
4.柱污染 每天冲洗柱
5.柱内条件变化 稳定进样条件,调节流动相
6.柱快达到寿命 采用保护柱
(二)保留时间缩短
1.流速增加 检查泵,重新设定流速
2.样品超载 降低样品量
3.键合相流失 流动相PH值保持在3"7.5检查柱的方向
4.流动相组成变化 防止流动相蒸发或沉淀
5.温度增加 柱恒温
(三)保留时间延长
1.流速下降 管路泄漏,更换泵密封圈,排除泵内气泡
2.硅胶柱上活性点变化 用流动相改性剂,如加三乙胺,或采用碱至钝化
3.键合相流失 同前(二)3
4.流动相组成变化 同前(二)4
5.温度降低 同前(二)5
(四) 出现肩峰或分*
1.样品体积过大 用流动相配样,总的样品体积小于第一峰的15%
2.样品溶剂过强 采用较弱的样品溶剂
3.柱塌陷或形成短路通道 更换谱柱,采用较弱腐蚀性条件
4.柱内烧结不锈钢失效 更换烧结不锈钢,加在线过滤器,过滤样品
5.进样器损坏 更换进样器转子
(五)鬼峰
1.进样阀残余峰 每次用后用强溶剂清洗阀,改进阀和样品的清洗
2.样品中未知物 单向离合器轴承处理样品
3.柱未平衡 重新平衡柱,用流动相作样品溶剂 (尤其是离子对谱)
4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽谱) 每天新配,用抗氧化剂
5.水污染(反相) 通过变化平衡时间检查水质量，用HPLC级的水
(六) 基线噪声
1.气泡(尖锐峰) 流动相脱气,加柱后背压
2.污染(随机噪声) 清洗柱,净化样品,用HPLC级试剂
3.检测器灯连续噪声 更换氘灯
4.电干扰(偶然噪声) 采用稳压电源,检查干扰的来源(如水浴等)
5.检测器中有气泡 流动相脱气,加柱后背压
(七)峰拖尾
1.柱超载 降低样品量,增加柱直径采用较高容量的固定相
2.峰干扰 清洁样品,调整流动相
3.硅羟基作用 加三乙胺,用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相PH值,钝化样品
4.同前(四)4 同前(四)4
5.同前(四)3 5.同前(四)3
6.死体积或柱外体积过大 连接点降至最低,对所有连接点作合适调整,尽可能采用细内径的连接管
7.柱效下降 用较低腐蚀条件,更换柱,采用保护柱
(八)峰展宽
1.进样体积过大 同(四)1
2.在进样阀中造成峰扩展 进样前后排出气泡以降低扩散
3.数据系统采样速率太慢 设定速率应是每峰大于10点
4.检测器时间常数过大 3d蓝光播放器设定时间常数为感兴趣第一峰半宽的10%
5.流动相粘度过高 增加柱温,采用低粘度流动相
6.检测池体积过大 用小体积池吸咪头,卸下热交换器
7.保留时间过长 等度洗脱时增加溶剂含量也可用梯度洗脱
8.柱外体积过大 将连接管径和连接管长度降至最小
9.样品过载 进小浓度小体积样品
液相谱柱使用经验谈
谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最
佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。
1、样品的前处理：
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
c、使用0.45祄的过滤膜过滤除去微粒杂质。
2、流动相的配制： 液相谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流
动相具备以下的特点：
a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
2、流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。
b．对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。
c．含水流动相最*在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。
d．流动相要求使用0.45 祄滤膜过滤，除去微粒杂质。
e．使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长谱柱的使用寿命，提高柱性能
HPLC的常用术语
第一部分 谱曲线
1、 romatogram）：谱柱流出物通过检测器系统时所产生的响应信号对时间或流动相流出体积的曲线图，或者通谱图（ch过适当的方法观察到的纸谱或薄层谱斑点、谱带的分布图。
2、 （谱）峰（chromatographic peak）：谱柱流出组分通过检测器系统时所产生的响应信号的微分曲线。 此主题相关图片如下： 此主题相关图片如下：
3、峰底（peak base）：峰的起点与终点之间的连接的直线（图1 中的CD）。
4、峰高（h ，peak height）：谱峰最大值点到峰底的距离（图1 中的BE）。
5、峰宽（W ，peak width）：在峰两侧拐点（图1 中的F ，G）处所作切线与峰底相交两点的距离（图 1 中的KL）。
6、半高峰宽（W h/2 ，peak withd at half height）：通过峰高的中点作平行于峰底的直线，此直 线 与峰两侧相交两点之间的距离（图1 中的HJ）。
7、峰面积（A ，peak area）：峰与峰底之间的面积（图1中的CHEJDC）。
8、拖尾峰（tailing peak）：后沿较前沿平缓的不对称的峰。
9、前伸峰（leading peak）：前沿较后沿平缓的不对称的峰。（又叫伸舌峰、前延峰）
10、假峰（ghost peak）：除组分正常产生的谱峰外，由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的谱峰，即并非由试样所产生的峰。这种谱峰并不代表具体某一组分，容易给定性、定量带来误差。（又叫鬼峰）
11、畸峰（distrorted peak）：形状不对称的谱峰， 前伸峰、拖尾峰都属于这类。
12、反峰（negative peak）：也称倒峰、负峰，即出峰的方向与通常的方向相反的谱峰。
柱的使用和维护注意事项(推荐)
谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。在谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护谱柱。
① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。
2.应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然
③ 一般说来谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。
④ 选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱， 分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶"饱和"，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。
⑥ 经常用强溶剂冲洗谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50"75ml。无动力除尘
下面列举一些谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100"200祃四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。
⑦ 保存谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。
⑧ 谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1"2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析
柱相同固定相的短柱（5"30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。采用保护柱会损失一定的柱效，这是值得的。 通常谱柱寿命在正确使用时可达2年以上。以硅胶为基质的填料，只能在pH2"9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。每次工作完后，最好用洗脱能力强的洗脱液冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相冲洗。含卤族元素（氟、氯、溴）的化合物可能会腐蚀不锈钢管道，不宜长期与之接触。装在HPLC仪上柱子如不经常使用，应每隔4"5天开机冲洗15分钟。
高效液相谱仪常规分析操作步骤及规程
高效液相谱仪操作步骤：
1)． 过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2)． 对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3)． 打开HPLC工作站（包括计算机软件和谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4)． 进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5)． 有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用
针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min分集接收。
6)． 调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。
点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
7)． 设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样
方法。若需建立
一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。
选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；
c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
8)． 进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，
可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9)． 关机时，先关计算机，再关液相谱。
10)． 填写登记本，由负责人签字。
注意事项：
1)． 流动相均需谱纯度，水用20M的去离子水。脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2)． 柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
3)． 所有过柱子的液体均需严格的过滤。
4）． 压力不能太大，最好不要超过2000 psi
流动相注意事项
高效液相谱的流动相通常是各种低沸点溶剂和水溶液。它是影响分离的一个非常重要因素。在实际工作中，流动相的选择和优化是确定谱分析的主要工作。
一、 流动相溶剂的选择
1.所选用的流动相溶剂要有一定的化学稳定性，不与固定相和样品组分起反应，其纯度和化学特性必须满足谱过程的稳定性和重复性的要求。
2.溶剂应当不干扰检测器的工作，溶剂应与检测器匹配，选择不影响检测器正常工作应选择在测定波长范围内无吸收的流动相。
3.在制备分离中, 溶剂应当易于除去, 不干扰对分离组分的回收。
4.溶剂的粘度要小，保证合适的柱压降。
5.从实用角度考虑，溶剂应当价格低廉，容易购得，使用安全，纯度要高。
二、流动相溶剂使用的注意事项
1.流动相溶剂应选择HPLC的溶剂或依此为标准的溶剂。流动相使用前用0.45μm滤膜过滤、脱气，清除微粒和灰尘。 在送液泵内，为了防止杂物（固体）进入流路，装有吸滤器，但网孔径为10μm，比此更小的颗粒仍然可通过，这会导致流路和柱子堵塞和污染。为此，建议常用0.45μm滤膜过滤。流动相溶剂须经脱气，如不脱气，在溶剂混合时，或压力温度变化时容易产生大量气泡，会导致泵误动作和输液不畅，检测器产生噪声信号等。
2.流动相恢复到室温后使用。流动相温度与室温相差时，流动相在恢复到室温前，基线水平很难稳定，特别是发生漂移，也容易产生气泡等现象。水与有机溶剂混合时，混合液变化大，往往会与室温相差很大，务必注意。
3.做HPLC流动相的试剂应用HPLC级的、水应用二次蒸馏水，水相流动相需经常更换，防止长菌变质。使用去离子水、针剂水、纯净水（炊用）并不合适、尤其是做梯度洗脱时，水中的不纯物会成为鬼峰，从而干扰分析结果。
4.流动相的pH值过高或过低，流动相使用纯水，使用高浓度磷酸盐缓冲溶液，使用离子对试剂等，均可能造成谱柱填料被化学破坏，这种对谱柱固定相及键合相的破坏通常是不可修复的
5.用缓冲盐做流动相时，在使用前和使用后都要用水清洗流路，绝对禁止将缓冲溶液留在流路中静置过夜或更长时间。
6.若需要使用含盐的流动相，使用前请务必过滤。并且使用该含盐流动相前，谱柱需先用低比例有机相（有机相含量应不低于10%）的溶液冲洗，以免缓冲盐析出。流动相若为蒸馏水或含盐的缓冲液，建议现用现配，以免流动相因滋生微生物而造成柱填料的污染。
7.进行梯度实验时要注意梯度变化过程中流动相的互溶性，避免因流动相不互溶而导致的缓冲盐析出问题。反相系统更换正相系统或正相系统更换反相系统时，用异丙醇置换系统内的储存流动相后在接柱子。
8.在更换两种互不相溶的流动相时，中间要用异丙醇溶液清洗过渡。例如：先用甲醇水做流动相，然后在用正己烷做流动相时，一定要先用异丙醇溶液冲洗甲醇水，然后用正己烷冲洗异丙醇，反之也是一样。在更换流动相时还要考虑谱柱是否更换。
9.仪器在短期（两三天）不用时，流路中可以是甲醇或水。仪器在长期不用时，流路中应用甲醇。
10.对于UV等检测器用于高灵敏度检测时，要使用UV吸收性小的HPLC的溶剂作为流动相溶剂，如甲醇、乙腈等。
11.当流动相溶剂为乙腈时，流速为1ml/min泵的正常压力5～7Mpa之间，如果压力逐渐降低，基线也出现异常。这是由于乙氰的粘性大，导致泵的流速降低。可适当提高流速使泵的压力恢复正常即可。8700g
12.流动相含有浓硫酸、浓硝酸、二、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶剂，会对流路中的PEEK树脂管路强度变成差、PEEK树脂管容易破裂使溶剂外溅。流动相含有卤素离子的溶剂，如KCI、NaCI、NH4CI等。对流路中的不锈钢材料有腐蚀作用，以上的溶剂须尽量避免使用。非用不可时，分析完了后，应立刻用蒸馏水把全流路清洗干净。
13.用于检定梯度等性能时，短时间使用在0.5%以下的低浓度丙酮水溶液是没有问题的。
14.注意：稀硝酸与甲醇不能混合，否则有可能会引起爆炸。
三、液相谱流动相的贮存
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议