膀胱癌检测试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及到功能纳米材料及膀胱癌标志物的检测技术领域，尤其涉及到一种膀胱癌检测试剂盒及其应用。

背景技术：

2.膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系肿瘤中发病率较高的癌症之一。经尿道膀胱肿瘤电切术是非肌层浸润性膀胱癌(nmibc)的金标准，当肿瘤浸润肌层，需采用根治性膀胱切除术+盆腔淋巴结清扫+尿流改道。膀胱癌中大约80％患者初次就诊时为nmibc，然而有0.8％-45％的患者因未及时发现肿瘤而进展为mibc。因此，对于膀胱癌患者，早期诊断和至关重要。
3.在膀胱癌的筛查中，膀胱镜检查和细胞学检查仍然是目前膀胱癌诊断的主要技术，但前者是有创检查及费用高，并且可能漏诊50％的扁平病变，后者的敏感性低，存在假阳性，限制了其在临床上的应用。
4.无创尿液检查替代膀胱镜诊断膀胱癌、监测复发及判断预后，一直是研究的热点，除尿细胞学外，目前通过尿液检查诊断和检测膀胱癌复发主要有尿核基质蛋白22、膀胱癌肿瘤抗原、免疫-细胞检查等方法，但敏感性和特异性均不理想。另外，在基因检测中，首先要确定哪些基因突变与膀胱癌相关，进一步以该基因标志物设计引物来检测该基因，从而实现膀胱癌的筛查，但现有技术中对膀胱癌的标志物的研究不够深入，能够用于预测膀胱癌的标志物不多，现有的试剂盒对于膀胱癌检测的准确度有待进一步提高。
5.综上，目前针对膀胱癌患者的诊断方式较多，但均存在不足，因此亟需开发一种简便、快速、高灵敏的检测方式，以达到膀胱癌早发现、早的目的。

技术实现要素：

6.本发明的一个优势在于提供一膀胱癌检测试剂盒及其应用，检测简便、快速、灵敏度高、特异性强，可以用于膀胱癌的筛查，实现早发现早。
7.本发明的另一优势在于提供一膀胱癌检测试剂盒及其应用，以尿液中的mirna-96作为标志物来检测膀胱癌，取样方便，无创伤，对早中晚期的膀胱癌的筛查都具有重要意义。
8.本发明的另一优势在于提供一膀胱癌检测试剂盒及其应用，基于贵金属增强荧光的设计可以实现目标物的超灵敏检测，并且可以通过fe3o4纳米粒子的磁分离富集作用实现复杂生物样品中的靶标检测，对于尿液中不同浓度的mirna-96的检测精度均较高，结果准确可靠。
9.本发明的另一优势在于提供一膀胱癌检测试剂盒及其应用，通过贵金属金纳米粒子表面等离子体共振来提高上转化纳米材料ucnps的荧光强度，从而提高检测的灵敏性。
10.本发明的另一优势在于提供一膀胱癌检测试剂盒及其应用，无需专业人士在专门在实验室检测，无需复杂仪器，通过本发明提供的简单的试剂盒即可实现膀胱癌的检测，携
带方便。
11.本发明的另一优势在于提供一膀胱癌检测试剂盒及其应用，操作简单，技术要求低，反应时间短，检测结果可视化，易于分析。
12.本发明的另一优势在于提供一膀胱癌检测试剂盒及其应用，成本低，效果好，也适用于膀胱癌的复发检测，对患者友好易于接受。
13.根据本发明的一方面，本发明提供了一膀胱癌检测试剂盒，以mirna-96为标志物，其中所述试剂盒包括贵金属纳米粒子@dna1和上转换纳米颗粒@dna2，其中dna1和dna2分别为mirna-96对应的dna序列的部分，以分别和mirna-96偶联，mirna-96的核酸序列为5
’‑
uuuggcacuagcacauuuuugcu-3’。
14.根据本发明的一实施例，所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子。
15.根据本发明的一实施例，所述贵金属纳米粒子为fe3o4@au磁性纳米颗粒。
16.根据本发明的一实施例，dna1的核酸序列为5
’‑
ctagtgccaaa
‑‑c3 sh-3’，dna2的核酸序列为5
’‑
nh
2 c
6-agcaaaaatgtg-3’。
17.根据本发明的一实施例，dna1的核酸序列为5
’‑
ctagtgccaaax1‑‑c3 sh-3’，x1为1-8个t，dna2的核酸序列为5
’‑
nh
2 c
6-x2agcaaaaatgtg-3’，x2为1-8个t。
18.本发明还提供了一膀胱癌标志物检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
19.(1)fe3o4@au磁性纳米颗粒的制备；
20.(2)fe3o4@au@dna1的制备；
21.(3)ucnps@pss的制备；以及
22.(4)ucnps@pss@dna2的制备。
23.其中在所述步骤(1)中，包括以下步骤：
24.步骤(1-1)fe3o4磁性纳米粒子的制备：将氯化铁粉末与乙二醇混合并搅拌，加入naac，搅拌，反应完成后冷却，用无水乙醇和去离子水清洗，真空干燥得到fe3o4磁性纳米粒子；和
25.步骤(1-2)fe3o4@au的合成：取上述步骤(1-1)制备的fe3o4，加入去离子水并超声，然后加入氯金酸溶液并搅拌，滴加硼氢化钠，搅拌，当溶液颜由棕变为深紫时，加入ctab，搅拌，磁吸后用水与乙醇清洗，最后溶于去离子水中。
26.其中在所述步骤(2)中，首先混合tcep与dna1，达到预定浓度，然后取上述步骤(1-2)中的fe3o4@au加入dna1混合溶液，分批次加入氯化钠溶液，超声，磁吸分散，测定紫外，其中所述dna1的核酸序列为5
’‑
ctagtgccaa ax1‑‑c3 sh-3’，x1为0-8个t。
27.本发明还提供一膀胱癌标志物检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
28.(1)金纳米颗粒的制备；
29.(2)au@dna的制备；
30.(3)ucnps@pss的制备；以及
31.(4)ucnps@pss@dna的制备。
32.其中在所述步骤(1)中，加入haucl4与去离子水，达到预定温度后注入柠檬酸钠，冷却；在所述步骤(2)中，混合tcep与dna1，加入aunps，反应后在磷酸盐缓冲中老化，离心，去除上清后重新分散于磷酸盐缓冲中，其中所述dna1的核酸序列为5
’‑
ctagtgccaaax1‑‑c3 sh-3’，x1为0-8个t。
33.根据本发明的一个实施例，其中所述步骤(3)包括以下步骤：
34.步骤(3-1)nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss的制备，将ycl
3.
6h2o、ybcl
3.
6h2o、ercl3·
6h2o的水溶液加入到油酸与1-十八烯中搅拌，加热反应以形成油酸镧系络合物并除去水，冷却，滴加nh4f和naoh的ch3oh溶液，搅拌，加热除去ch3oh后，将该溶液在n2下加热并搅拌，冷却，再加乙醇沉淀，用乙醇和环己烷洗，真空下干燥；和
35.步骤(3-2)ucnps分散于环己烷中，加入dmf溶液和nobf4，搅拌，加入氯仿离心后溶于dmf溶液中，再加入氯仿离心，得到ucnps@bf4，在上述溶液中加入pss溶液，搅拌，将产物离心后重新分散于水中，重复数次后，将沉淀重新溶于dmf溶液中。
36.其中在所述步骤(4)中，将tct与dmf形成tct-dmf加合物，加入ucnps@pss、ch2cl2，搅拌，然后加入dna2，密封下搅拌，将获得的ucnps@pss@dna用dmf与水洗，分散于水中，其中所述dna2的核酸序列为5
’‑
nh
2 c
6-x2agcaaaaatgtg-3’，x2为0-8个t。
37.根据本发明的另一实施例，其中所述步骤(3)包括nayf4:yb
3+
,tm
3+
@pss的制备：将ycl
3.
6h2o、ybcl
3.
6h2o、tmcl3·
6h2o的水溶液与油酸和1-十八烯混合，搅拌，反应以形成油酸镧系络合物并除去水，冷却，滴加nh4f和naoh的ch3oh溶液，搅拌，除去ch3oh后，将该溶液在n2气氛下加热并搅拌，冷却，加乙醇沉淀，用乙醇和环己烷洗，真空干燥。
38.根据本发明的另一方面，本发明还提供一膀胱癌标志物的检测方法，使用膀胱癌标志物检测试剂盒检测尿液，其中膀胱癌标志物检测试剂盒中的fe3o4@au@dna1或au-dna1、ucnps@pss@dna2与尿液中的膀胱癌标志物mirna-96反应，通过测定荧光强度来判定mirna-96的含量，进而用于膀胱癌的诊断。
39.其中所述fe3o4@au@dna1或au-dna1是由fe3o4@au磁性纳米颗粒或金纳米颗粒与dna1连接后形成，其中dna1的核酸序列为5
’‑
ctagtgccaaax1‑‑c3 sh-3’，其中x1为0-8个t。
40.其中ucnps@pss@dna2是由ucnps@pss与dna2连接后形成，其中dna2的核酸序列为5
’‑
nh
2 c
6-x2agcaaaaatgtg-3’，x2为0-8个t，其中尿液中膀胱癌标注物mirna-96的核酸序列为5
’‑
uuuggcacuagcacauuuuugcu-3’。
41.根据本发明的另一方面，本发明还提供一膀胱癌标志物检测试剂盒和检测方法的应用，通过所述的膀胱癌标志物的检测试剂盒、根据所述的膀胱癌标志物检测试剂盒的制备方法制备的试剂盒以及应用所述的膀胱癌标志物的检测方法适于应用于膀胱癌的检测。
附图说明
42.图1是根据本发明的一较佳实施例的一种基于金磁纳米粒子增强荧光检测膀胱癌标志物mirna-96的试剂盒的制备方法及其应用示意图。
43.图2是根据本发明的上述较佳实施例的fe3o4@au的tem图。
44.图3是根据本发明的上述较佳实施例的ucnps的tem图。
45.图4是根据本发明的上述较佳实施例的ucnps@pss的tem图。
46.图5是根据本发明的上述较佳实施例使用膀胱癌标志物的检测试盒检测不同浓度mirna-96，不同浓度的mirna-96与荧光强度之间的线性关系示意图。
具体实施方式
47.以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优
选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
48.mirna是一类长约20-25个核苷酸的非编码rna，调控着某些编码细胞重要功能的基因表达，比如细胞增殖、分化和凋亡。对于不同的肿瘤，mirna表达谱具有明显的肿瘤特异性，提示其可做肿瘤早期诊断的潜在标志物。如northern印记和dna微阵列已实现对mirna的检测，然而这些方法仍存在反应时间长、过程复杂及灵敏度低等问题。此外，在众多标志物中，mirna-96被发现在膀胱癌的尿液中高表达，并能稳定存在，它的特异性与敏感性分别约为89％和72％，在低级别膀胱中，它仍有74％的敏感性。因此，mirna-96可作为检测膀胱癌的良好特异性标志物，然而因其低丰度及短序列等问题使灵敏的检测技术变得至关重要。
49.上转换纳米材料(upconversion nanoparticles，ucnps)由无机基质和稀土掺杂离子组成，具有上转换发光特性、高光学稳定性、低毒性、发射带窄、发光寿命长等优点，已广泛应用于生物和医学研究领域。由于单一ucnps的荧光强度相对较低，因此本发明采用贵金属金纳米粒子表面等离子体共振来提高荧光的强度。当贵金属的紫外线吸收峰与ucnps的荧光发射峰具有明显的重叠并且两者的距离处于适当范围之间时，可以发生金属增强效应，从而提高检测的灵敏性。此外，基于生物检测样品的复杂性，本发明还通过fe3o4纳米粒子的磁分离富集作用实现靶标检测。
50.综上，本发明以等离子体共振为基础的金属增强荧光效应应可以有效提高生物检测系统的灵敏度，高灵敏的检测手段有望在无创条件下实现膀胱癌疾病的早期检测。
51.本发明的发明原理：通过设计合成具有磁分离和贵金属增强荧光的复合纳米粒子fe3o4@au作为基底，调控其形貌和尺寸与ucnps的发射峰匹配，并且通过dna的设计调控两者之间的距离，当贵金属的紫外吸收峰与ucnps的荧光发射峰有明显的重叠，以及两者之间的距离在5-30nm之间，可以实现荧光强度的增强，并且强度的增强与目标物成线性相关，从而基于贵金属增强荧光的设计可以实现目标物的超灵敏检测，并且可以通过fe3o4纳米粒子的磁分离富集作用实现复杂生物样品中的靶标检测。
52.本发明的优点在于：
53.(1)fe3o4具有优异的磁性，能在复杂生物样品中进行磁性吸附；
54.(2)au能增强ucnps的荧光，从而提高检测的灵敏性；
55.(3)fe3o4@au比表面积大，dna可通过au-s键作用大量固定至fe3o4@au表面；
56.(4)ucnps具有上转换发光特性、高光学稳定性、低毒性、发射带窄、发光寿命长等优点。
57.本发明所要解决的技术问题是提供一种灵敏度高、特异性强、准确性高以及操作步骤简单的荧光生物传感器，用于膀胱癌生物标志mirna-96的超灵敏检测。
58.一些化合物简称说明：ctab：十六烷基三甲基溴化铵；dmf：n,n-二甲基甲酰胺；nobf4：四氟硼酸亚硝；tct：三聚氯氰。
59.具体实施方式一
60.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于金纳米粒子增强上转换纳米粒子的荧光强度，用于膀胱癌标志物mirna-96检测的试剂盒，参考附图1，其中所述膀
胱癌标志物的检测试剂盒包括fe3o4@au@dna1和ucnps@pss@dna2，其中试剂盒的各种试剂、制备方法以及用于膀胱癌标志物mirna-96的检测方法主要包括以下步骤：
61.(1)fe3o4@au磁性纳米颗粒的制备方法
62.a.制备fe3o4磁性纳米粒子：将1.1～2g氯化铁粉末溶于40ml乙二醇溶液中，搅拌均匀后，加入3～5g naac，搅拌半小时，200℃反应9h，反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水各洗2～4次，60℃真空干燥12h。
63.b.fe3o4@au的合成：取3～7mg的fe3o4，加入50ml去离子水，超声10s。然后加入0.5～1.5ml的6mg/ml氯金酸溶液，并在0℃搅拌1h，100～150μl冰冷的0.2m硼氢化钠缓慢滴加至上述溶液中，保持0℃搅拌15min，可见溶液颜由棕变为深紫，加入0.2m ctab 5ml，搅拌过夜。磁吸后用水与乙醇各洗二遍，最后溶于10ml的去离子水中。
64.(2)nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss的制备方法
65.a.nayf4:yb
3+
,er
3+
的合成:将含有0.5～1mmol、0.1～0.3mmol、0.01～0.03mmol的水合ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o、ercl3·
6h2o的4ml水溶液加入到含有6ml油酸与14ml 1-十八烯的100ml烧瓶中。将上述混合物在室温下搅拌10min，然后加热至150℃反应1.5h以形成油酸镧系络合物并除去水，溶液呈淡黄透明，然后冷却到50℃。将含有3～5mmol nh4f和2～3mmol naoh的12ml ch3oh溶液缓慢滴加至以上混合物中，50℃下搅拌30min，然后，将该体系加热至100℃(1h)以除去ch3oh。除去ch3oh后，将该溶液在n2气氛下加热至250～310℃剧烈搅拌1-1.5h，然后冷却至室温。加20ml乙醇沉淀，用乙醇和环己烷(v/v，3:2)洗，60℃真空下干燥12h。
66.b.2ml ucnps分散于环己烷中，加入2ml的dmf溶液，然后加入20-25mg nobf4，剧烈搅拌60min。然后加入5ml氯仿离心1次后重新溶于5ml dmf溶液中，然后加入5ml氯仿离心，从而得到ucnps@bf4。在上述溶液中加入0.1～0.5ml pss溶液，60℃搅拌24h。将产物离心后重新分散于水中，重复三次后，将沉淀重新溶于5ml dmf溶液中。
67.(3)fe3o4@au@dna1的制备方法
68.fe3o4@au-dna1连接：首先用tcep与dna1混合1h，使dna浓度为5μm，然后取0.005～0.02mg/ml的fe3o4@au 0.5ml加入上述溶液，同时每隔半小时加入3m的氯化钠溶液10～30μl，共三次，每次加入后超声15秒，然后摇晃5～7h后磁吸分散在0.5ml溶液中测定紫外。
69.(4)nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss@dna2的制备方法
70.ucnps@pss与dna2连接：5mg tct与500μl dmf溶液在室温下搅拌1h，从而形成tct-dmf加合物，取100μl tct-dmf加合物，加入250-1000μl ucnps@pss、2ml ch2cl2，室温下搅拌30min，然后加入dna2(100μm,10-60μl)，密封下搅拌18h，最后将获得的ucnps@pss@dna用dmf与水洗两次(16500rpm,20min)，分散于1ml水中。
71.(5)fe3o4@au@dna1-mirna96-dna2-ucnps的制备方法
72.分别取10～25μl的fe3o4@au@dna1溶液与10～25μl的ucnps@pss@dna2及10μl mirna-96进行偶联，最后定容为100μl，反应条件37℃，反应时间45-120min。磁吸后再次定容至100μl，测定上清及下清荧光。
73.本发明中的所述dna1的核酸序列为5
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ctagtgccaaax1‑‑c3 sh-3’，其中x1为0-8个t，也就是说本发明中试剂盒及其制备方法用到的所述dna1的核酸序列可以为5
’‑
ctagtgccaaa
‑‑c3 sh-3’、5
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ctagtgccaaat
‑‑c3 sh-3’、5
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ctagtgccaaatt
‑‑c3 sh-3’、5
’‑
ctagtgccaaattt
‑‑c3 sh-3’、5
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ctagtgccaaatttt-c
3 sh-3’、5
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ctagtgccaaattttt
‑‑c3 sh-3’、5
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ctagtgccaaatttttt
‑‑c3 sh-3’、5
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ctagtgccaaattttttt
‑‑c3 sh-3’或5
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ctagtgccaaatttttttt-c
3 sh-3’。
74.本发明的所述dna2的核酸序列为5
’‑
nh2 c
6-x2agcaaaaatgtg-3’，其中x2为0-8个t，也就是说也就是说本发明中的试剂盒及其制备方法用到的dna2的核酸序列可以为5
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2 c
6-agcaaaaatgtg-3’、5
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2 c
6-tagcaaaaatgtg-3’、5
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6-ttagcaaaaatgtg-3’、5
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6-tttagcaaaaatgtg-3’、5
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6-ttttagcaaaaatgtg-3’、5
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6-tttttagcaaaaatgtg-3’、5
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6-ttttttagcaaaaatgtg-3’、5
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nh
2 c
6-tttttttagcaaaaatgtg-3’或5
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nh
2 c
6-ttttttttagcaaaaatgtg-3’。
75.所述mirna-96核酸序列为5
’‑
uuuggcacuagcacauuuuugcu-3’。
76.综上所述，本发明制备一种基于fe3o4@au增强ucnps荧光发射强度用于膀胱癌标志物mirna-96超灵敏检测的试剂盒，用于膀胱癌的检测，为膀胱癌无创诊断提供了一种新颖可应用的方法，且具有高灵敏度、高特异性、简单、快速、无创易于操作等优点，可以实现对超低浓度mirna-96的检测，具有良好的应用前景。
77.其中各个试剂的具体制备方法及检测方法具体实施如下：
78.实施例1
79.一种基于au增强ucnps荧光发射强度用于膀胱癌标志物mirna-96超灵敏检测的试剂盒的制备方法及用其余mirna-96反应的检测方法，具体实施为以下步骤：
80.(1)fe3o4@au磁性纳米颗粒的制备方法
81.a.制备fe3o4磁性纳米粒子：
82.将1.35g氯化铁粉末溶于40ml乙二醇溶液中，搅拌均匀后，加入3.6g naac，搅拌半小时，200℃反应9h，反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水各洗3次，60℃真空干燥12h。
83.b.fe3o4@au的合成：
84.取5mg的fe3o4，加入50ml去离子水，超声10s。然后加入1ml的6mg/ml氯金酸溶液，并在0℃搅拌1h，120μl冰冷的0.2m硼氢化钠缓慢滴加至上述溶液中，保持0℃搅拌15min，可见溶液颜由棕变为深紫，加入0.2mctab 5ml，搅拌过夜。磁吸后用水与乙醇各洗二遍，最后溶于10ml的去离子水中。
85.(2)nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss的制备方法
86.a.nayf4:yb
3+
,er
3+
的合成:
87.将含有0.78mmol、0.2mmol、0.02mmol的水合ycl
3.
6h2o、ybcl
3.
6h2o、ercl
3.
6h2o的4ml水溶液加入到含有6ml油酸与14ml 1-十八烯的100ml烧瓶中。将上述混合物在室温下搅拌10min，然后加热至150℃反应1.5h以形成油酸镧系络合物并除去水，溶液呈淡黄透明，然后冷却到50℃。将含有4mmol nh4f和2.5mmol naoh的12ml ch3oh溶液缓慢滴加至以上混合物中，50℃下搅拌30min，然后，将该体系加热至100℃(1h)以除去ch3oh。除去ch3oh后，将该溶液在n2气氛下加热至290℃剧烈搅拌1.5h，然后冷却至室温。加20ml乙醇沉淀，用乙醇和环己烷(v/v，3:2)洗，60℃真空下干燥12h。
88.b.nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss的合成：
89.2ml ucnps分散于环己烷中，加入2ml的dmf溶液，然后加入25mg nobf4，剧烈搅拌
60min。然后加入5ml氯仿离心1次后重新溶于5ml dmf溶液中，然后加入5ml氯仿离心，从而得到ucnps@bf4。在上述溶液中加入0.17ml pss溶液，60℃搅拌24h。将产物离心后重新分散于水中，重复三次后，将沉淀重新溶于5ml dmf溶液中。
90.(3)fe3o4@au@dna1的制备方法
91.fe3o4@au-dna1连接：
92.首先用tcep与dna1混合1小时，使混合溶液浓度为5μm，然后取0.1mg/ml的fe3o4@au 0.5ml加入上述溶液，同时每隔半小时加入3m的氯化钠溶液26μl，共三次，每次加入后超声15秒，然后摇晃6h后磁吸分散在0.5ml溶液中测定紫外。
93.其中所述dna1的核酸序列为：5
’‑
ctagtgccaaa
‑‑c3 sh-3’。
94.(4)nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss@dna2的制备方法
95.ucnps@pss@dna2连接：
96.5mg tct与500μl dma溶液在室温下搅拌1h，从而形成tct-dmf加合物，取100μl tct-dmf加合物，加入250μl ucnps@pss、2ml ch2cl2，室温下搅拌30min，然后加入dna2(100μm,15μl)，密封下搅拌18h，最后将获得的ucnps@pss@dna2用dmf与水洗两次(16500rpm,20min)，分散于1ml水中。
97.其中dna2的核酸序列为：5
’‑
nh
2 c
6-agcaaaaatgtg-3’。
98.(5)fe3o4@au@dna1-mirna96-dna2-ucnps的制备方法
99.分别取20μl的fe3o4@au@dna1溶液与10μl的ucnps@pss@dna2及10μl mirna-96进行偶联，最后定容为100μl，反应条件37℃，反应时间45min。磁吸后再次定容至100μl，测定上清及下清荧光。
100.即本发明中的膀胱癌标志物的检测试剂盒与尿液中的mirna-96之间反应形成fe3o4@au@dna1-mirna96-dna2-ucnps用于膀胱癌的检测，通过测定荧光强度即可判定所述mirna-96的含量，进而能够诊断出膀胱的癌变程度，因而被应用于膀胱癌的诊断。
101.实施例2
102.(1)fe3o4@au磁性纳米颗粒的制备方法
103.a.制备fe3o4磁性纳米粒子：
104.将1g氯化铁粉末溶于40ml乙二醇溶液中，搅拌均匀后，加入3.6g naac，搅拌半小时，200℃反应9h，反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水各洗3次，60℃真空干燥12h。
105.b.fe3o4@au的合成：
106.取5mg的fe3o4，加入50ml去离子水，超声10s。然后加入1ml的6mg/ml氯金酸溶液，并在0℃搅拌1h，150μl冰冷的0.2m硼氢化钠缓慢滴加至上述溶液中，保持0℃搅拌15min，可见溶液颜由棕变为深紫，加入0.2mctab 5ml，搅拌过夜。磁吸后用水与乙醇各洗二遍，最后溶于10ml的去离子水中。
107.(2)nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss的制备方法
108.a.nayf4:yb
3+
,er
3+
的合成:
109.将含有0.78mmol、0.2mmol、0.02mmol的水合ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o、ercl
3.
6h2o的4ml水溶液加入到含有6ml油酸与14ml 1-十八烯的100ml烧瓶中。将上述混合物在室温下搅拌10min，然后加热至150℃反应1.5h以形成油酸镧系络合物并除去水，溶液呈淡黄透明，
然后冷却到50℃。将含有4mmol nh4f和2.5mmol naoh的12ml ch3oh溶液缓慢滴加至以上混合物中，50℃下搅拌30min，然后，将该体系加热至100℃(1h)以除去ch3oh。除去ch3oh后，将该溶液在n2气氛下加热至290℃剧烈搅拌1h，然后冷却至室温。加20ml乙醇沉淀，用乙醇和环己烷(v/v，3:2)洗，60℃真空下干燥12h。
110.b.nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss的合成：
111.2ml ucnps分散于环己烷中，加入2ml的dmf溶液，然后加入22mg nobf4，剧烈搅拌60min。然后加入5ml氯仿离心1次后重新溶于5ml dmf溶液中，然后加入5ml氯仿离心，从而得到ucnps@bf4。在上述溶液中加入0.15ml pss溶液，60℃搅拌24h。将产物离心后重新分散于水中，重复三次后，将沉淀重新溶于5ml dmf溶液中。
112.(3)fe3o4@au@dna1的制备方法
113.fe3o4@au-dna1连接：首先用tcep与dna1混合1小时，使混合溶液浓度为5μm，然后取0.08mg/ml的fe3o4@au 0.5ml加入上述溶液，同时每隔半小时加入3m的氯化钠溶液26μl，共三次，每次加入后超声15秒，然后摇晃6h后磁吸分散在0.5ml溶液中测定紫外。
114.其中所述dna1的核酸序列为：5
’‑
ctagtgccaaatttt
‑‑c3 sh-3’。
115.(4)nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss@dna2的制备方法
116.ucnps@pss@dna2连接：
117.5mg tct与500μl dmf溶液在室温下搅拌1h，从而形成tct-dmf加合物，取100μl tct-dmf加合物，加入250μl ucnps@pss、2ml ch2cl2，室温下搅拌30min，然后加入dna2(100μm,10μl)，密封下搅拌18h，最后将获得的ucnps@pss@dna2-1用dmf与水洗两次(16500rpm,20min)，分散于1ml水中。
118.其中dna2的核酸序列为：5
’‑
nh
2 c
6-ttttagcaaaaatgtg-3’。
119.(5)fe3o4@au@dna1-mirna96-dna2-ucnps的制备方法
120.分别取22μl的fe3o4@au@dna1溶液与10μl的ucnps@pss@dna2及10μl mirna-96进行偶联，最后定容为100μl，反应条件37℃，反应时间45min。磁吸后再次定容至100μl，测定上清及下清荧光。
121.实施例3
122.(1)fe3o4@au磁性纳米颗粒的制备方法
123.a.制备fe3o4磁性纳米粒子：
124.将1.8g氯化铁粉末溶于40ml乙二醇溶液中，搅拌均匀后，加入3g naac，搅拌半小时，200℃反应9h，反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水各洗2次，60℃真空干燥12h。
125.b.fe3o4@au的合成：
126.取5mg的fe3o4，加入50ml去离子水，超声10s。然后加入1ml的6mg/ml氯金酸溶液，并在0℃搅拌1h，100μl冰冷的0.2m硼氢化钠缓慢滴加至上述溶液中，保持0℃搅拌15min，可见溶液颜由棕变为深紫，加入0.2mctab 5ml，搅拌过夜。磁吸后用水与乙醇各洗二遍，最后溶于10ml的去离子水中。
127.(2)nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss的制备方法
128.a.nayf4:yb
3+
,er
3+
的合成:
129.将含有0.78mmol、0.2mmol、0.02mmol的水合ycl
3.
6h2o、ybcl
3.
6h2o、ercl3·
6h2o的
4ml水溶液加入到含有6ml油酸与14ml 1-十八烯的100ml烧瓶中。将上述混合物在室温下搅拌10min，然后加热至150℃反应1h以形成油酸镧系络合物并除去水，溶液呈淡黄透明，然后冷却到50℃。将含有4mmol nh4f和2.5mmol naoh的12ml ch3oh溶液缓慢滴加至以上混合物中，50℃下搅拌30min，然后，将该体系加热至100℃(1h)以除去ch3oh。除去ch3oh后，将该溶液在n2气氛下加热至310℃剧烈搅拌1.5h，然后冷却至室温。加20ml乙醇沉淀，用乙醇和环己烷(v/v，3:2)洗，60℃真空下干燥12h。
130.b.nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss的合成：
131.2ml ucnps分散于环己烷中，加入2ml的dmf溶液，然后加入28mg nobf4，剧烈搅拌60min。然后加入5ml氯仿离心1次后重新溶于5ml dmf溶液中，然后加入5ml氯仿离心，从而得到ucnps@bf4。在上述溶液中加入0.3ml pss溶液，60℃搅拌24h。将产物离心后重新分散于水中，重复三次后，将沉淀重新溶于5ml dmf溶液中。
132.(3)fe3o4@au@dna1的制备方法
133.fe3o4@au-dna1连接：
134.首先用tcep与dna1混合0.5h，使混合溶液浓度为5μm，然后取0.015mg/ml的fe3o4@au 0.5ml加入上述溶液，同时每隔半小时加入3m的氯化钠溶液26μl，共三次，每次加入后超声15秒，然后摇晃6h后磁吸分散在0.5ml溶液中测定紫外。
135.其中所述dna1的核酸序列为：5
’‑
ctagtgccaaatttttttt
‑‑c3 sh-3’。
136.(4)nayf4:yb
3+
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3+
@pss@dna2的制备方法
137.ucnps@pss@dna2连接：
138.5mg tct与500μl dmf溶液在室温下搅拌0.5h，从而形成tct-dmf加合物，取100μl tct-dmf加合物，加入250μl ucnps@pss、2ml ch2cl2，室温下搅拌30min，然后加入dna2(100μm,20μl)，密封下搅拌18h，最后将获得的ucnps@pss@dna2用dmf与水洗两次(16500rpm,20min)，分散于1ml水中。
139.其中dna2的核酸序列为：5
’‑
nh
2 c
6-ttttttttagcaaaaatgtg-3’。
140.(5)fe3o4@au@dna1-mirna96-dna2-ucnps的制备方法
141.分别取25μl的fe3o4@au@dna1溶液与10μl的ucnps@pss@dna2和10μl mirna-96进行偶联，最后定容为100μl，反应条件37℃，反应时间45min。磁吸后再次定容至100μl，测定上清及下清荧光。
142.实施例4
143.(1)fe3o4@au磁性纳米颗粒的制备方法
144.a.制备fe3o4磁性纳米粒子：将1.35g氯化铁粉末溶于40ml乙二醇溶液中，搅拌均匀后，加入3.6g naac，搅拌半小时，200℃反应9h，反应完成后冷却至室温，并用无水乙醇和去离子水各洗3次，60℃真空干燥12h。
145.b.fe3o4@au的合成：取5mg的fe3o4，加入50ml去离子水，超声10s。然后加入1ml的6mg/ml氯金酸溶液，并在0℃搅拌1h，120μl冰冷的0.2m硼氢化钠缓慢滴加至上述溶液中，保持0℃搅拌15min，可见溶液颜由棕变为深紫，加入0.2m ctab 5ml，搅拌过夜。磁吸后用水与乙醇各洗二遍，最后溶于10ml的去离子水中。
146.(2)nayf4:yb
3+
,tm
3+
@pss的制备方法
147.a.nayf4:yb
3+
,tm
3+
的合成:将含有0.78mmol、0.2mmol、0.02mmol的水合ycl3·
6h2o、
ybcl3·
6h2o、tmcl3·
6h2o的4ml水溶液加入到含有6ml油酸与14ml 1-十八烯的100ml烧瓶中。将上述混合物在室温下搅拌10min，然后加热至150℃反应1.5h以形成油酸镧系络合物并除去水，溶液呈淡黄透明，然后冷却到50℃。将含有4mmol nh4f和2.5mmol naoh的12ml ch3oh溶液缓慢滴加至以上混合物中，50℃下搅拌30min，然后，将该体系加热至100℃(1h)以除去ch3oh。除去ch3oh后，将该溶液在n2气氛下加热至290℃剧烈搅拌1.5h，然后冷却至室温。加20ml乙醇沉淀，用乙醇和环己烷(v/v，3:2)洗，60℃真空下干燥12h。
148.b.2ml ucnps分散于环己烷中，加入2ml的dmf溶液，然后加入25mg nobf4，剧烈搅拌60min。然后加入5ml氯仿离心1次后重新溶于5ml dmf溶液中，然后加入5ml氯仿离心，从而得到ucnps@bf4。在上述溶液中加入0.17ml pss溶液，60℃搅拌24h。将产物离心后重新分散于水中，重复三次后，将沉淀重新溶于5ml dmf溶液中。
149.(3)fe3o4@au@dna1的制备方法
150.fe3o4@au-dna1连接：首先用tcep与dna混合1小时，使混合溶液浓度为5μm，然后取0.1mg/ml的fe3o4@au 0.5ml加入上述溶液，同时每隔半小时加入3m的氯化钠溶液10μl，共三次，每次加入后超声15秒，然后摇晃6h后磁吸分散在0.5ml溶液中测定紫外。
151.其中所述dna1的核酸序列为：5
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ctagtgccaaatt
‑‑c3 sh-3’。
152.(4)nayf4:yb
3+
,tm
3+
@pss@dna2的制备方法
153.ucnps@pss@dna2连接：5mg tct与500μl dmf溶液在室温下搅拌1h，从而形成tct-dmf加合物，取100μl tct-dmf加合物，加入250μl ucnps@pss、2ml ch2cl2，室温下搅拌30min，然后加入dna2(100μm,15μl)，密封下搅拌18h，最后将获得的ucnps@pss@dna2用dmf与水洗两次(16500rpm,20min)，分散于1ml水中。
154.其中dna2的核酸序列为：5
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nh
2 c
6-ttagcaaaaatgtg-3’。
155.(5)fe3o4@au@dna1-mirna96-dna2-ucnps的制备方法
156.分别取20μl的fe3o4@au@dna1溶液与10μl的ucnps@pss@dna2及10μl mirna进行偶联，最后定容为100μl，反应条件37℃，反应时间45min。磁吸后再次定容至100μl，测定上清及下清荧光。
157.实施例5
158.(1)金纳米颗粒的制备方法：在三颈烧瓶中加入2.5ml haucl4(0.01m)与97.5ml去离子水，油浴温度达到120℃后快速注入875μl柠檬酸钠(0.1m)，120℃下冷凝回流30min，冷却至室温。
159.(2)nayf4:yb
3+
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3+
@pss的制备方法
160.a.nayf4:yb
3+
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3+
的合成:将含有0.78mmol、0.2mmol、0.02mmol的水合ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o、ercl3·
6h2o的4ml水溶液加入到含有6ml油酸与14ml 1-十八烯的100ml烧瓶中。将上述混合物在室温下搅拌10min，然后加热至150℃反应1.5h以形成油酸镧系络合物并除去水，溶液呈淡黄透明，然后冷却到50℃。将含有4mmol nh4f和2.5mmol naoh的12ml ch3oh溶液缓慢滴加至以上混合物中，50℃下搅拌30min，然后，将该体系加热至100℃(1h)以除去ch3oh。除去ch3oh后，将该溶液在n2气氛下加热至290℃剧烈搅拌1.5h，然后冷却至室温。加20ml乙醇沉淀，用乙醇和环己烷(v/v，3:2)洗，60℃真空下干燥12h。
161.b.2ml ucnps分散于环己烷中，加入2ml的dmf溶液，然后加入25mg nobf4，剧烈搅拌60min。然后加入5ml氯仿离心1次后重新溶于5ml dmf溶液中，然后加入5ml氯仿离心，从
而得到ucnps@bf4。在上述溶液中加入0.17ml pss溶液，60℃搅拌24h。将产物离心后重新分散于水中，重复三次后，将沉淀重新溶于5ml dmf溶液中。
162.(3)au@dna1的制备方法
163.au-dna1连接：首先用tcep与dna1混合1小时，使混合溶液浓度为5μm，然后取aunps(1ml，1nm)加入上述溶液，反应16h后在磷酸盐缓冲(10mm,ph＝7)中老化24h(nacl浓度为0.1m)，离心(13000rpm,30min)2次，去除上清后重新分散于磷酸盐缓冲中。
164.其中所述dna1的核酸序列为：5
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‑‑c3 sh-3’。
165.(4)nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss@dna2的制备方法
166.ucnps@pss与dna2连接：5mg tct与500μl dmf溶液在室温下搅拌1h，从而形成tct-dmf加合物，取100μl tct-dmf加合物，加入250μl ucnps@pss、2ml ch2cl2，室温下搅拌30min，然后加入dna2(100μm,15μl)，密封下搅拌18h，最后将获得的ucnps@pss@dna2用dmf与水洗两次(16500rpm,20min)，分散于1ml水中。
167.其中dna2的核酸序列为：5
’‑
nh
2 c
6-ttttttagcaaaaatgtg-3’。
168.(5)au@dna1-mirna96-dna2-ucnps的制备方法
169.分别取20μl的au@dna1溶液与10μl的ucnps@pss@dna2及10μlmirna进行偶联，最后定容为100μl，反应条件37℃，反应时间45min。磁吸后再次定容至100μl，测定上清及下清荧光。
170.具体实施方式二
171.为验证本方法在临床应用的价值，对膀胱癌患者与对照组人尿液样品中的mirna-96进行了检测。直接使用本发明提供的膀胱癌标志物的检测试剂盒对尿液样品进行检测，膀胱癌标志物检测试剂盒中的试剂fe3o4@au@dna1与ucnps@pss@dna2与尿液样品中的膀胱癌标志物mirna-96进行反应，检测原理方法如上述具体实施方式一所述，检测结果如表1所示。
172.表1尿液中mirna-96的检测
[0173][0174][0175]
由表1检测结果可知，mirna-96在高级别膀胱癌和低级别膀胱癌中的浓度高于在
肾结石及良性前列腺增生中的浓度，这说明mirna-96在膀胱癌中的浓度高于非膀胱癌患者，并且高级别膀胱癌中mirna-96的浓度要高于低级别膀胱癌。表明本发明提供的膀胱癌标志物的检测试剂盒对于尿液中不同浓度mirna-96的检测精密度高，结果准确可靠，能够被应用于膀胱癌的检测。
[0176]
综上所述，本发明基于fe3o4@au增强ucnps荧光强度的方法构建一种灵敏度高、检测限低、选择性好、操作简单且检测结果准确可靠的检测试剂盒用于膀胱癌的超灵敏诊断。实验过程中只需要将fe3o4@au材料进行适配体功能化以用作识别单元，ucnps材料作为荧光信号输出，只需添加微量待测样本即可实现mirna-96高灵敏度、强特异性、无创伤、成本低、简单、快速，对于膀胱癌的检测具有重要的意义及应用前景。
[0177]
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

技术特征：

1.一膀胱癌检测试剂盒，以mirna-96为标志物，其特征在于，包括贵金属纳米粒子@dna1和上转换纳米颗粒@dna2，其中dna1和dna2分别为mirna-96对应的dna序列的部分，以分别和mirna-96偶联，mirna-96的核酸序列为5
’‑
uuuggcacuagcacauuuuugcu-3’。2.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒，其中所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子。3.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒，其中所述贵金属纳米粒子为fe3o4@au磁性纳米颗粒。4.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒，其中dna1的核酸序列为5
’‑
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‑‑
c
3 sh-3’，dna2的核酸序列为5
’‑
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2 c
6-agcaaaaatgtg-3’。5.根据权利要求1所述的膀胱癌检测试剂盒，其中dna1的核酸序列为5
’‑
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c
3 sh-3’，x1为1-8个t，dna2的核酸序列为5
’‑
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2 c
6-x2agcaaaaatgtg-3’，x2为1-8个t。6.一膀胱癌检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)fe3o4@au磁性纳米颗粒的制备；(2)fe3o4@au@dna1的制备；(3)ucnps@pss的制备；以及(4)ucnps@pss@dna2的制备。7.根据权利要求6所述的膀胱癌检测试剂盒的制备方法，其中在所述步骤(1)中，包括以下步骤：步骤(1-1)fe3o4磁性纳米粒子的制备：将氯化铁粉末与乙二醇混合并搅拌，加入naac，搅拌，反应完成后冷却，用无水乙醇和去离子水清洗，真空干燥得到fe3o4磁性纳米粒子；和步骤(1-2)fe3o4@au的合成：取上述步骤(1-1)制备的fe3o4，加入去离子水并超声，然后加入氯金酸溶液并搅拌，滴加硼氢化钠，搅拌，当溶液颜由棕变为深紫时，加入ctab，搅拌，磁吸后用水与乙醇清洗，最后溶于去离子水中。8.根据权利要求7所述的膀胱癌检测试剂盒的制备方法，其中在所述步骤(2)中，首先混合tcep与dna1，达到预定浓度，然后取上述步骤(1-2)中的fe3o4@au加入dna1混合溶液，分批次加入氯化钠溶液，超声，磁吸分散，测定紫外，其中所述dna1的核酸序列为5
’‑
ctagtgccaaax1‑‑
c
3 sh-3’，x1为0-8个t。9.一膀胱癌检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)金纳米颗粒的制备；(2)au@dna的制备；(3)ucnps@pss的制备；以及(4)ucnps@pss@dna的制备。10.根据权利要求9所述的膀胱癌检测试剂盒的制备方法，其中在所述步骤(1)中，加入haucl4与去离子水，达到预定温度后注入柠檬酸钠，冷却；在所述步骤(2)中，混合tcep与dna1，加入aunps，反应后在磷酸盐缓冲中老化，离心，去除上清后重新分散于磷酸盐缓冲中，其中所述dna1的核酸序列为5
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ctagtgccaaax1‑‑
c
3 sh-3’，x1为0-8个t。11.根据权利要求6至10任一所述的膀胱癌检测试剂盒的制备方法，其中所述步骤(3)包括以下步骤：步骤(3-1)nayf4:yb
3+
,er
3+
@pss的制备，将ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o、ercl3·
6h2o的水溶液
加入到油酸与1-十八烯中搅拌，加热反应以形成油酸镧系络合物并除去水，冷却，滴加nh4f和naoh的ch3oh溶液，搅拌，加热除去ch3oh后，将该溶液在n2下加热并搅拌，冷却，再加乙醇沉淀，用乙醇和环己烷洗，真空下干燥；和步骤(3-2)ucnps分散于环己烷中，加入dmf溶液和nobf4，搅拌，加入氯仿离心后溶于dmf溶液中，再加入氯仿离心，得到ucnps@bf4，在上述溶液中加入pss溶液，搅拌，将产物离心后重新分散于水中，重复数次后，将沉淀重新溶于dmf溶液中。12.根据权利要求11所述的膀胱癌的检测试剂盒的制备方法，其中在所述步骤(4)中，将tct与dmf形成tct-dmf加合物，加入ucnps@pss、ch2cl2，搅拌，然后加入dna2，密封下搅拌，将获得的ucnps@pss@dna用dmf与水洗，分散于水中，其中所述dna2的核酸序列为5
’‑
nh
2 c
6-x2agcaaaaatg tg-3’，x2为0-8个t。13.根据权利要求6至10任一所述的膀胱癌的检测试剂盒的制备方法，其中所述步骤(3)包括nayf4:yb
3+
,tm
3+
@pss的制备：将ycl3·
6h2o、ybcl3·
6h2o、tmcl3·
6h2o的水溶液与油酸和1-十八烯混合，搅拌，反应以形成油酸镧系络合物并除去水，冷却，滴加nh4f和naoh的ch3oh溶液，搅拌，除去ch3oh后，将该溶液在n2气氛下加热并搅拌，冷却，加乙醇沉淀，用乙醇和环己烷洗，真空干燥。14.根据权利要求13所述的膀胱癌的检测试剂盒的制备方法，其中在所述步骤(4)中，将tct与dmf形成tct-dmf加合物，将ucnps@pss、ch2cl2加入到tct-dmf加合物中，搅拌，然后加入dna2，密封下搅拌，将获得的ucnps@pss@dna用dmf与水洗，分散于水中，其中所述dna2的核酸序列为5
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nh
2 c
6-x2agcaaaaatgtg-3’，x2为0-8个t。15.一膀胱癌的检测方法，其特征在于，使用膀胱癌检测试剂盒检测尿液，其中膀胱癌检测试剂盒中的fe3o4@au@dna1或au-dna1、ucnps@pss@dna2与尿液中的膀胱癌mirna-96反应，通过测定荧光强度来判定mirna-96的含量，进而用于膀胱癌的诊断。

技术总结

本发明提供了一膀胱癌检测试剂盒及其应用，其中所述膀胱癌标志物的检测试剂盒包括Fe3O4@Au@DNA1与UCNPs@DNA2，以与尿液中的膀胱癌标志物miRNA-96偶联，根据反应后的荧光判定膀胱癌标志物的含量，进而得以检测出膀胱的癌变程度，无创伤、成本低、检测简便、快速、灵敏度高、特异性强，可以用于膀胱癌的筛查，以实现早发现早。早发现早。早发现早。