DOI: 10.ki.aids.2021.04.03
论著•
温州市2019年新诊断HIV -1感染者的病毒基因型分析 朱传新'，郑文力、金聪囡2，吴矛矛\孙宝昌、吴可可、钭慧芬1
[1.温州市疾病预防控制中心，浙江温州325000; 2.温州医科大学检验医学院(生命科学学院），浙江温州325000]
摘要：目的分析温州市2019年新诊断HIV-1感染者的病毒基因型，揭示亚型分布特点及流行趋势。方法 采集232例HIV-1感染者血浆样本，采用巢式PCR 扩增区基因，于Los Alamos HIV database 下载参考序列，构建系 统进化树确定基因亚型，利用HIV Blast 工具进行同源性分析。结果获得199例感染者的区基因序列，以异性性 传播(61.3%，丨22/199)为主，其次是同性性传播（23.1%，46/199)。同性性传播感染者以19〜49岁（78.3%，36/46)的青 壮年为主，多为无配偶：共检出8种基因亚型，以CRF07_BC(47.2%，94/199)和CRF01_AE(29.1%,58/199)为主；其次 是CRF08_BC(6.5%，13/199)、C(6.0%，12/199)、B(4.5%，9/199)、CRF85_BC(2.5%，5/199)、CRF55_01B(1.5%，3/199)和
CRF59_01B(0.5%，1/199)。检出 2种独特重组型（URFs)，分别是URF(CRF01_AE/BC)(1.0%，2/199)和 URF(B/C) (1.0%，2/199)。发现20个传播簇，总成簇比例为20.6%(41/199)，CRF07_BC 、CRF01_AE 和CRF08_BC 的传播簇分另丨j
为6个、8个和2个;C 、CRF55_01B 、B 和URF(CRF01_AE/BC)的传播簇均为1个。结论温州市2019年新诊断HIV-1 感染者病毒基因亚型多样，以CRF07_BC 和CRF01_AE 为主，C 亚型占比偏高，成簇率约20%。应加强对HIV-1亚型 和传播簇的监测，掌握动态变化趋势。
关键词：1型艾滋病病毒；基因型；传播簇；同源性中图分类号：R 373.9
文献标志码：A
文章编号：1672-5662(2021)04-0337-06
Genotype Analysis of Newly Diagnosed HIV-1 Infected Cases in Wenzhou in 2019 ZHU Chuanxin', ZHENG Wenli', JIN Congnan2, WU Maomao', SUN Baochang1, WU Keke1, TOU Huifen'. (1. Wenzhou Center for Disease Control and
Prevention, Wenzhou 325000, Zhejiang, China; 2. School o f Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University 325000, Zhejiang)
Corresponding author: SUN Baochang, Email: ***************
Supported by Wenzhou Science and Technology Project (Y2020554, Y2020542)
Abstract: Objective To analyze the virus genotypes of newly diagnosed HIV-1 infected cases and reveal the distribution of subtypes and epidemic trends in Wenzhou, 2019. Methods Plasma samples were collected from 232 HIV- 1 infected patients. Pol gene regions were amplified by nested PCR. Reference sequences were downloaded from Los Alamos HIV Database. Phylogenetic trees were constructed to determine gene subtypes, and the HIV Blast tool was used for homology analysis. Results Heterosexual transmission dominated in the study subjects (61.3%, 122/199), followed by homosexual transmission (23.1%, 46/199). The majority of subjects infected by homosexual transmission were young adults aged 19-49 years (78.3%, 36/46), and most of whom without a spouse. There were 8 subtypes, mainly CRF07 BC (47.2%, 94/199) and CRF01AE (29.1%, 58/199), followed by CRF08 BC (6.5%, 13/199), C (6.0%, 12/199), B (4.5%, 9/ 199), CRF85_BC (2.5%, 5/199).CRF55_01 B (1.5%, 3/199), and CRF59_01B (0.5%, 1/199) , CRF85 BC (2.5%, 5/199). Two URFs were found, including URF (CRF01AE/BC) (1.0%, 2/199) and URF (BC) (1.0%, 2/199). Twenty transmission clusters were found, with the total clustered rate as 20.6% (41/199), including 6 CRF07 BC transmission clusters, 8 CRF01AE transmission clusters, and 2 CRF08 BC transmission
clusters. Each C, CRF55 01B, B, and URF (CRF01AE/BC) transmission cluster was identified. Conclusion The subtypes of HIV infected by newly diagnosed
郑文力(1985-），男，浙江省温州市人，主管技师，从事微生物（病 subtypes and transmission clusters should be set up and
技师，从事微生物(病毒)检验，Email:29丨**************
收稿日期：2020-10-28；修回日期：2020-11 -24
基金项目：温州市科技局项目（Y2020554，Y2020542)
第一作者简介：朱传新（1963—)，男，浙江省温州市人，副主任
Wenzhou cases in 2019 were diverse. CRF07 BC and CRF01AE appeared as the main subtypes. Subtype C
accounted for a relatively higher proportion, with the
clustered rate as almost 20%. Programs regarding the
trends of subtypes changes and early warning of HIV-1
毒)检验
朱传新与郑文力为并列第一作者：
通信作者：孙宝昌，副主任技师，Email: ***************
Keywords: HIV-1;
Genotype; Transmission
cluster; Homology
目前全球已发现多种HIV基因亚型和重组病毒 株，不同亚型毒株的生物学特征、传播途径与分布特 点在不同感染人中有明显的差异，其感染力和毒 力也各不相同"。2013年以来，我国至少发现了 21 种流行重组型毒株（Circulating Recoml)inant Forms, CRFs)，近年来相继发现了新重组亚型和独特重组 型毒株（Unique Recombinant Forms，URFs)u_3]。分析 H1V基因亚型特点，了解毒株变异特点和基因重组 变化趋势，是准确检测、有效和预防的基础。
本文以2019年温州市新确诊HIV-1感染者为 研究对象，结合流行病学调查数据开展基因测序及 系统进化分析，旨在探讨温州市HIV-1感染人病 毒亚型分布及流行病学特征。
1材料与方法
1.1样本采集采集2019年1_12月温州市232例新诊断未的HIV-1感染者的抗凝静脉血，及时 分离血浆置于-70 t保存。通过中国疾病预防控制 中心“艾滋病综合防治信息管理系统”收集研究对象的背景信息，包括年龄、性别、文化程度、婚姻状况、感染途径等。本研究已经通过温州市疾病预防控制 中心伦理委员会审批。
1.2核酸提取和基因片段扩增采用QIAGEN公司 的Viral RNA Mini Kit提取血浆样本中病毒RNA，对全部样本进行基因扩增。扩增产物使用2%的琼 脂糖凝胶电泳检测，检测阳性的产物送至杭州擎科 梓熙生物科技有限公司进行纯化和测序。引物信息 及反应条件见表1。
1.3数据分析使用SeqUencherv5.0软件对序列进 行清理、拼接和编辑，从Los Alamos HIV databa站下载HIV各亚型参考株序列，再用BioEdit v7.0.9 将样本序列与参考株序列进行比对和校准；用HIV BLAST进行序列分析以确定基因亚型；用MEG A v7 车欠件构建Neighor-Joining系统进化树（重复运算丨000次），显示>75%的Bootstrap，计算各亚型的平 均遗传距离，并将Bootstrap值>90%，簇内样本数為2 个，簇内平均遗传距离《0.015定义为传播簇:4_5，以初 步判断簇内感染者的传播关
系。
表1基因片段扩增用引物表
引物名称引物序列(5'-3')扩增反应条件RT-PCR
外侧上游引物MAW26-07BC TGGAAATGTGGAAAAGAAGGAC
外侧下游引物
第二轮PCR
RT21-07BC CTGTATTTCAGCTATCAAGTCTTTTGATGGG
内侧上游引物 内侧下游引物 测序引物
正向PR01-07BC
RT20-07BC
CAGAGCCAACAGCCCCACCA
CTGCCAATTCTAATTCTGCTTC
RT-PCR ： 50 ^ 30 min, 94 ^ 2 min; 94 X.30 s,
55^ 30 s，72^150 s, 30 个循环；72^10 min,
4 X：保温第二轮 PCK :94 t
5 min;94 T 30 s，PR01-07BC CAGAGCCAACAGCCCCACCA
63 ^30 8,72 ^150s，30 个循环;72^lOmin,
4丈保温
正向RTAS-qian GGACCTACACCTGTCAAC
正向RTB CCTAGTATAAACAATGAGACAC 反向PR0C1S GCTGGGTGTGGTATTCC
反向RT20-07BC CTGCCAATTCTAATTCTGCTTC
1.4同源性分析米用Los Alamos HIV databa站的HIV Blast工具对C亚型，新重组亚型CRF85_ BC,
CRF59_01B，CRF55_01B，独特重组型URF (CRF0LAE/BC)和URF(B/C)进行同源性分析，选取 前10条同源性最高并有注释地区信息的序列，判断 毒株可能的来源地。
1.5统计分析使用IBM SPSS Statistics 21统计软 件进行Y检验和《检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1人口学特征共获得199例感染者的P〇/区基因序列。他们的年龄为19〜83岁，平均（55.3±18.2) 岁；男性159例（79.9%)，女性为38例（19.1%)，2例 性别未知。汉族184例(92.5%)。异性性行为感染 122例(61.3%)，同性性行为感染46例(2
3.1%)，同性 性行为感染者中，19〜49岁占78.3%(36/46)。人口学 信息详见表2。
2.2亚型分布在获得/W区序列的199例感染者 中，检出8种基因亚型CRFs，分别为CRF07_BC94例 (47.2%)、CRF01_AE58 例（29.1%)、CRF08_BC 13 例 (6.5%)、C 亚型 12 例（6.0%)、B亚型 9 例（4.5%)、CRF85_BC 5 例（2.5%)、CRF55_01B 3 例（1.5%)、CRF59_01B 1例(0.5%)；另外发现2种URFs ，分别是
URF(CRF01—AE/BC)2 例（1.0%)和 URF(BC)2 例 (1.0%)，均为异性性行为感染，已婚有配偶。共
确定 46例MSM的病毒基因亚型，CRF07_BC24例(52.2%)、CRF01_AE 17 例（37.0%)、CRF_08BC 3 例 (6.5%)、B亚型 1例（2.2%)、CRF55_01B 1例（2.2%)。详见表2。
表2温州市新诊断m v-丨感染者的人口学特征及基因亚型分布情况
变量人数（构成比/%)
U=199)
HIV不同基因亚型例数（比/%)
CRF01_AEU=58)CRF07_BC(n=94)其他U=47)
值P值
性别 1.0120.603男159(79.9)48(30.2)77(48.4)34(21.4)
女38(19.1)10(26.3)17(44.7)11(28.9)
不详2(1.0)0(0.0)0(0.0)2(100.0)
年龄/岁 6.7230.035 <2943(21.6)12(27.9)26(60.5)5(11.6)
30 〜4950(25.1)17(34.0)23(46.0)10(20.0)
50-6977(38.7)23(29.9)34(44.2)20(26.0)
彡7027(13.6)6(22.2)11(40.7)10(37.0)
不详感染途径2(1.0)0(0.0)0(0.0)2(100.0)
7.8260.098
同性性行为46(23.1)17(37.0)24(52.2)5( 10.9)
异性性行为122(61.3)31(25.4)55(45.1)36(29.5)
注射1(0.5)0(0.0)1(100.0)0(0.0)
不详30(15.1)10(33.3)14(46.7)6(20.0)
地域 3.7160.156温州籍166(83.4)48(28.9)76(45.8)42(25.3)
非温州籍31(15.6)10(32.3)18(58.1)3(9.7)
不详2(1.0)0(0.0)0(0.0)2(100.0)
注：其他基因型包括CRF08_BC，C，B, CRF85_BC，CRF55_01B, CRF59_01B，URF(CRF01—AE/BC)和URF(BC)。
2.3进化树分析共发现20个传播簇，大小为2〜3 例/簇，平均为2.05例/簇，总成簇比例为20.6% (41/ 199);CRF07_BC、CRF01_AE和 CRF08_BC的传播簇 分别为6个、8个和2个；在C、CRF55_01B、B和URF (CRF01_AE/BC)也检出1个传播簇，详见图1。同性 性行为感染者的成簇比例为26.1%(12/46)，异性性 行为感染者的成簇比例为20.5%(25/122)，两者差异 无统计学意义(彳=0.609，/M
3.435)。簇内成员均为 异性性行为感染者的占55.0%( 11/20)、均为同性性 行为感染者的占20.0%(4/20)，混合型传播簇（包含 异性和同性性行为感染者）占15.0%(3/20)。C、CRF55_01B、B和 URF(CRF01_AE/BC)可能由于样 本数较少，均只发现一个传播簇，簇内的成员均来自 同一个县或市，且均为异性性行为感染者。所有传 播族中的感染者男性占80.5%(33/41)，女性占19.5% (8/41)。详见表3。
2.4同源性分析对C亚型和新重组型与独特重组 亚型进行同源性分析，其同源性在94%~99%之间。根据同源性推断，C亚型可能来源于印度和中国云 南。另发现独特重组型URF(CRF01_AE/BC)和URF
表3温州市2019年新诊断HIV-1病例的传播簇
亚型
平均遗
传距离
传播方式
传播
簇数
病例
数
成簇比
例/% CRF07 一B CU=94)0.042 3异性性传播24
同性性传播24
混合型传播l a212.8
不详12
CRF01_AE(n=58)0.052 7异性性传播48
同性性传播12
混合型传播2a529.3
不详12
CRF08 BC(n=13)0.039 4异性性传播12
12
30.8
同性性传播
C(n=12)0.030 4异性性传播1216.7 CRF55_01B(n=3)0.026 4异性性传播l b2-
B(n=9)0.061 3异性性传播l b2-
URF(_01BC) (n=2)0.005 3异性性传播l b2-
URF(BC) (n=2)0.061 9未发现传播簇
CRF85_BC(n=5)0.011 7未发现传播簇
CRF59_01BU=1)-未发现传播簇
注:a: CRF07_BC混合型传播中同性性传播、异性性传播各1例；CRF01_AE混合型传播中同性性传播3例，异性性传播2例。b：样本 量过少，不计算成簇比例。
注：A为CRF07_BC,B为CRF01_AE，C为其他亚型；图的蓝条纹内的序列为传播簇；鲁表示参考株序列
图1各亚型系统进化树的构建
(BC)与云南毒株相似度分别在94%〜95%和96%~ 99%之间。新重组亚型CRF85_BC与四川毒株的相 似度为98%, CRF59_01B与云南毒株的相似度为98%, CRF55_01 B与广州毒株相似度在97%~99%之间
2.5感染C亚型病例特征分析本研究中发现12例C亚型感染者，其中来自温州平阳县10例，职业为 农民的7例，均为异性性传播，
且在进化树分析中发
现一个传播族，提示这些感染者存在较为密切的流 行病学关联。现今部分温州农民常年在外经商，云 南也是平阳农民外出经商的选择地之一，通过电话 对其中5例感染者进行访谈，核实了他们曾经在云 南经商的情况，提示温州的C亚型感染可能来源于 云南。
3讨论
HIV- 1M组病毒在全球广泛流行，约90%的HIV 感染者感染该组毒株:11。中国流行的HIV-1十分复 杂，新型重组亚型多见|6]。2012年全国分子流行病 学调查显示，我国HIV-1感染者存在11种以上的病 毒亚型，其中 CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC和 B 型占92.8%[”。2017年Xiao等[8]对中国人的HIV- 1亚型分析发现，CRFO1_AE和CRF07_BC在中国HIV 感染人中占比最高，分别占46.36%和19.16%。
2009年浙江省调查研究显示，省内主要流行株 为CRF01_AE和BC重组亚型'而2015年浙江省分 子流行病学研究表明主要流行株已经转变为CRFO1—AE和CRF07_BC:4]。陈婉君等[丨。：人对湖州市 138例HIV感染者和艾滋病患者调查结果显示，CRF07_BC所占比例最高（43.5%)，其次为CRF01_ AE(33.3%)。罗明宇等[ni人在嘉兴市HIV分子流行 病学分析中指出，较大HIV分子传播簇为CRF07_ BC。本研究发现温州市以CRF07_BC和CRF01_AE 为主要流行株，CRF07_B C的占比最局，提7K C
RF07_BC以较快的速度在浙江省传播。CRFO1_ AE通过异性性传播的方式在东南亚和中国东南沿 海省份广泛传播，2005年又在中国MSM中发现112]，表明CRF01_A E已不再只通过异性性传播，同性性 行为也是其感染途径之一。CRF07_BC最早于1997 年在广西发现，主要是通过注射方式传播:I2H3]，本研究中也发现I例通过注射感染CRF07_BC, 46例MSM感染者中以CRF07_BC为主。CRF85_BC 于2016年首次报告在四川被发现同年CRF85_ BC第一次在浙江（义乌人）出现」5]，本研究发现5例 (温州人)CRF85_BC，提示该亚型正逐渐分散传播。
本研究发现,B亚型和CRF01_AE的平均遗传距 离大于其余亚型，估计早于其他亚型传入浙江，姚亚 萍等:'6报告B亚型先于CRF01_AE和CRF07_BC传 人浙江MSM人中。CRF01_AE与CRF07_BC在进 化树具有多个传播簇，成簇现象明显，CRF08_BC和 C亚型也呈现成簇现象，其中CRF01_A E与 CRF08_BC亚型的成簇比例处于较高水平，提示不同亚型的感染者有不同的流行圈，彼此间传播相关度 高，危险系数较大。
除此之外，本研究发现的C亚型所占比例为
6.0%，是浙江省 2009 年（1.8%)和 2015 年（1.8%)报
告的约3.3倍[6，11]。吴可可等U72015年报告在温州市
的38例HIV-1感染者中C亚型的比例为18.4%。经
调查：云南是平阳农民外出经商地之一。在2005年
的报告中，云南瑞丽发现了遗传上与印度C亚型相
似的基因型，证明是从印度传入了 C亚型:|8]。本文
对C亚型来源的推测综合了序列同源性和流行病学
调查结果，提示温州的C亚型感染可能主要来源于
云南。但流行病学调查的人数有限，还有待进一步
深人研究。
综上所述，不同的性别年龄、地域和感染途径等
因素都会影响HIV-1感染的人数和亚型的分布状况。目前温州市主要以CRF07_BC和CRF01_AE为
优势株，重组型种类多样和C亚型独特分布，这些特
点提示未来温州市的HIV-1亚型动态变化复杂，防
控任务更加艰巨，需要进一步完善HIV亚型的分子
监测体系，为针对性制定艾滋病防制措施提供有效
依据。由于本文只做了区扩增测序，本研究存在
局限性。
(致谢：感谢浙江省疾病预防控制中心艾防所张佳峰老
师在本研究数据分析和文稿撰写修改过程中给予的帮助和
支持，同时感谢参与课题研究的各位流行病学人员。）
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