收稿日期:2008-07-21
基金项目：国家科技支撑计划重大项目(2006BAD O2A03)；江苏省自然科学基金项目(BK2006159)；江苏省农业科技自主创新基金项目(CX
[07]603)；江苏省农业科学院基金项目(6110703;6510806)
作者简介：杨 杰(1969-)，男，四川南部人，博士，副研究员，主要从事水稻遗传育种研究。 通讯作者：仲维功(1954-)，男，江苏兴化人，研究员，主要从事水稻遗传育种研究。
分析和快速检测
杨 杰1，王 军1，周 彤2，陈志德1，仲维功1
(1.江苏省农业科学院粮食作物研究所，江苏南京 210014;2.江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京 210014)
摘要：为了明确江苏新发生的矮缩病害为水稻黑条矮缩病，采用RT -PCR 和序列测定方法对其病原进行了精确鉴定。根据水稻黑条矮缩病病毒基因组序列的信息，设计扩增RNA 聚合酶基因、外壳蛋白基因和RNA 沉默抑制子基因以及核心蛋白基因部分编码区的4对引物，提取感染水稻黑条矮缩病病毒的水稻植株总RNA 并进行RT -PCR 扩增，可以在感病植株中分别扩增出水稻黑条矮缩病病毒基因组特有的4个条带，测序结果表明，来源于江苏南京的分离物的4个基因部分编码片段与已登录的对应基因片段核苷酸序列同源性达99%以上，共发现7个碱基的突变。经生物信息学分析发现7个单碱基突变都是同义突变，氨基酸序列没有改变。根据以上结果确认该病病原为水稻黑条矮缩病病毒。利用该方法可以对水稻和其他寄主进行早期病毒检测。 关键词：水稻黑条矮缩病;RT -PCR；病毒检测
中图分类号:S432.4+1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2008)06-0087-06
Detecting and Analysis of Rice Black Stripe Dwarf Virus(RBSDV)on
Rice in Jiangsu Province with RT -PCR
YANG Jie 1,WANG Jun 1,Z HO U Tong 2,CHEN Zh-i de 1,Z HONG We-i gong 1
(1.Institute of Food Crops,Jiangsu Academy of Agriculture Sciences,Nanjing 210014,China;
2.Institute of Plant Protection,Jiangsu Academy of Agriculture Sciences,Nanjing 210014,China)
Abstract:To determine the pathogen of rice dwarf disease which has caused yield loss in Jiangsu Province in recent years was caused by rice black stripe dwarf virus(RBSDV).Four pairs of primers to a mplify RNA dependent RNA poly -merase and the coat protein and core protein and silencing suppressor of RBSDV were designed.Four bands with about 200bp to 300bp were obtained in infected rice plants by RT -PCR,respectively.The separate segment was ligated to pGE M -T -easy vector,then sequenced with M13primers.Their identities to rice black -streaked dwarf virus were higher than 99%and seven synonymous substitution were found.The results showed that the virus which causes rice dwarf dis -ease in Jiangsu is RB SDV.The identification of RBSDV in the small bro wn planthopper(Laodelphax striatellus ),rice and other host plants is of great importance for the disease forecasting.This approach can be used for early detection of RBS -DV in infected rice and other host plants.
Key words:Rice black stripe dwarf virus disease;RT -PCR;Virus detection 水稻黑条矮缩病毒(Rice bl
ack -streaked dwaf virus,RBSDV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)[1]，全基因组测序工作已经完成，总长29141bp，由10条dsRNA 组成，按分子量大小命名为S1-S10;RNA 依赖的RNA 聚合酶、外壳蛋白、
沉默抑制子等重要基因的功能已经基本明确[2-10]
。
水稻黑条矮缩病毒病是一种以灰飞虱为主要介体进行传播的病毒病，主要侵染禾谷类作物和禾本科杂草。水稻黑条矮缩病毒病的病株症状为浓绿矮缩，叶片僵直，不抽穗或穗小，叶背的叶脉和茎杆上有短条瘤状突起，该突起在发病初期呈腊白，后变为黑
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褐。发病田块一般减产10%~40%，重病田甚至颗粒无收[11-14]。水稻黑条矮缩病毒病曾于20世纪60年代中期在我国华东诸省市不少地区广泛发生。近年来，随着灰飞虱的大爆发，该病又迅速回升流行[15]。由于江淮流域近几年灰飞虱虫量基数大，而且田间杂草和禾本科作物是RBSDV的寄主[16-21]，通过灰飞虱的食毒和传毒，该病有可能在江淮流域大发生，对水稻生产构成新的威胁。
该病毒只能由特定的昆虫(以灰飞虱为主)带毒传播，在该病毒的科学研究和生产预测预报中，测定介
体昆虫灰飞虱带毒率和水稻植株被感染率显得十分必要。已有研究表明,RBSDV必须由灰飞虱在带毒的寄主植物食毒后才能带毒和传播病毒[11]。因此，鉴定寄主植物的带毒情况对于水稻黑条矮缩病的预测预报及其防治提供非常有价值的借鉴。
反转录PC R(RT-PCR)技术已经是成熟的技术，这一技术与免疫法相比，具有快速、灵敏和特异性强的优点，而且不需要制备抗血清，适于普及应用[22,23]。本研究利用RT-PCR技术方法对采自江苏省病区的水稻黑条矮缩病病株进行了病毒检测，并经测序证明，为建立水稻植株和越冬寄主植物水稻黑条矮缩病病毒率的检测体系奠定了基础。
1材料和方法
1.1植物材料
采集江苏省农业科学院试验田2007年田间自然发病株叶片，液氮迅速冷冻,-80e保存。
1.2菌株及载体
大肠杆菌DH5A由江苏省优质水稻工程中心保存,pGEM-T easy、Trizol、酶等购买自Tiangen公司。1.3总RNA提取和cDNA合成
所用的玻璃、瓷器、铁器均采用干热(180e)灭菌4h以上；配试剂等均用011%DEPC处理水。试验步骤如下：取50~100mg病株组织加入液氮充分研磨，待样品冻融之前加1mL Trizol，样品体积不能超过Trizol的10%，继续研磨直至完全溶解，吸入离心管,12000r/min离心10min(4e)，取上清,15~ 30e5min；加012mL氯仿异戊醇(氯仿B异戊醇= 20B1)溶液，用力摇15s,15~30e静置2~3min,4e 10000r/min离心15min，上层液相约为总体积的60%；取上清，加015m L异丙醇，混匀,15~30e静置10min,4e12000r/min10min；去上清，加75%乙醇l mL(011%DEPC水配制)，振荡,4e7500 r/min5min；去乙醇，空气干燥，用011%DEPC处理的水溶解，于-70e冷冻保存。
逆转录反应体系(25L L)：先将总RNA1L L(2 L g),Oligo dT(15)引物2.5L L和纯水混合,70e变性5min后，迅速冰上冷却；然后再依次添加其他成分。包括5@Buffer2.5L L,dNTP(10mmol/L)2.5L L, RNasin015L L，逆转录酶(AMV)1L L，纯水12.5L L。42e,1h;95e加热5min终止反应。
1.4RBSDV特异引物设计
根据已测序的RB SDV的基因组序列设计引物。分别设计合成RBSDV的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRP)、核心蛋白(Core protein)、沉默抑制基因(Putative silencing sup-pressor)、外壳蛋白(C oat protein)编码基因的4对引物。用于本研究RT-PCR的黑条矮缩病病毒的4个片段所在基因组位置及片段大小见表1(详情请登陆:www.iah.bbsrc.ac.uk/dsRNA virus-pro-teins/Fijivirus.htm)。
S1-For:5c-GGTGGAACGAAAGTTC AGTAGATC-3c
S1-Rev:5c-AATTTGGAC TACAC TTGGACGAA-3c
S2-For:5c-AGAGCGAC AAGAAGAATCGAAA-3c
S2-Rev:5c-C AAAAGTAGTTGTGTAAGCGGG-3c
S6-For:5c-CTC GAATCATCC GTCAC TTCTGAGT-3c
S6-Rev:5c-GGAC AAAACC TTTCC AATTATCGAG-3c
S10-For:5c-GGAAACATTAC TTTGAAGCCC-3c
S10-Rev:5c-CCACC ATAATGTGTAAC ATCCGTA-3c
表1RdRp(S1)、核心蛋白(S2)、沉默抑制子基因(S6)和外壳蛋白(S10)基因所在基因组信息Tab.1Genome data of RdRp(S1),Core protein(S2),Silencing suppressor(S6),C oat protein(S10)o f RBSDV
基因组/bp Genome segment 开放阅读框
/bp
ORFs
蛋白分子量
/kDa
Protei n size
aa
GenBank
登录号
Accession
nu mbers
功能特征
Functions and
properties
RT-PCR
扩增位置
RT-PCR
locus
参考文献
Refe-
rence
S1(4501)36~44271464(168.8)AJ294757RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)38~252[3] S2(3812)46~37231226(141.5)AJ409145功能未知117~415[3] S6(2645)82~2457792(8919)AJ409148沉默抑制子202~478[7,8] S10(1801)22~1695558(63.3)AF459813外壳蛋白Coat protein472~728[4,9]
引物合成由Invitrogen公司完成。将合成的引物用ddH2O稀释为10pmol/L L,-20e保存备用。
以反应得到的c DNA为模板，按下列反应体系进行PCR。PCR反应体系(25L L)为:cDNA2.5L L，上游引物0125L L，下游引物0125L L,10@Buffer2.5 L L,MgCl2(5mmol/L)2L L,Taq酶0125L L,dNTP(2.5
88华北农学报23卷
mmol/L)1L L，纯水16.25L L 。扩增条件为:94e 5min,94e 30s,54e 30s,72e 30s,35个循环;
72e 延伸10min;10e 10min 结束反应。PCR 产物采用1%TBE 琼脂糖凝胶电泳,EB 染。
1.5 PCR 产物目的片段的回收、连接和转化
PC R 产物经1.0%的琼脂糖电泳后用Gel Ex -traction Mini Kit 回收，与pGEM -T 载体连接后，采用热激转化大肠杆菌DH5A 感受态。
1.6 质粒提取
挑单菌落接种到5mL LB 液体培养基中,37e ,180r/min 振荡培养过夜；菌液分装到1.5mL 离心管中后，离心收集菌体并吸净残余培养液。利用TI ANGEN 试剂盒提取质粒。1.7 序列分析
将2个单独的克隆交南京基天生物公司，使用载体上的M13引物从2端测序。序列分析采用DNAMAN 软件。
2 结果与分析
2.1 RBSDV 4个基因部分片段的PCR 扩增
对采自江苏省南京市的病叶提取总RNA，以反转录后的cDNA 为模板，根据已报道黑条矮缩病病毒基因组序列设计的特异引物进行PCR 。利用S1-For 和S1-Rev 引物组合扩增RNA 聚合酶基因部分编码片段大小为215bp；利用S2-For 和S2-Rev 引物组合扩增核心蛋白基因部分编码区片段大小为299bp；利用S6-For 和S6-Rev 引物组合扩增可能的沉默抑制子的部分编码区片段大小为277bp；利用S10-For
和S10-Rev 引物组合扩增外壳蛋白基因部分编码区片段大小为257bp 。4个片段RT -PCR 结果见图1，片段大小与根据黑条矮缩病病毒基因组预测的条带大小一致。由此可以看出，本研究所使用的4对引物对RB SDV 的检测特异性强，扩增效率高，适于对水稻植株RB SDV 的鉴定。
1,2.RdRp;3,4.核心蛋白;5,6.沉默抑制子;7,8.外壳蛋白。
M .D NA ladder;1,2.RdRp;3,4.Core protei n;5,6.Si lenci ng suppress or;7,8.Coat protei n.
图1 水稻病叶中利用RT -PC R 扩增病毒4个编码区结果
Fig.1 The RT -PCR of incom plete RNA dependent RNA polymerase,Core protein,Silencing suppressor,
C oat protein
2.2 4个片段序列比较与分析
我们对江苏省南京市收集到的病叶扩增到的RdRp 部分编码片段与已发表的RBSDV 分离物的对应序列进行同源性比较(序列登录号)，发现1个碱基的突变,C 突变为T(图2)。为探讨该突变是否对基因编码氨基酸有影响，我们对其编码的氨基酸序列进行分析(图3)。结果发现，该突变是mR NA 密码子第3位碱基的改变，即从GAC 突变为GA T，对应的密码子是G UC 和G UA，而GUC 和G UA 是同义密码子，都编码天门冬氨酸(Asp)。因此，该突变
为同义突变。
S1.已发表序列(AJ294757);J S1.本研究测序结果。S1.GenBank accession number,AJ294757;JS1.This research.
图2 RBSDV 的RNA 依赖的RNA 聚合酶基因部分编码片段的共线性比较
Fig.2 The alignment of incomplete RNA dependent RNA polymerase(RdRP )of RBSDV
下画线表示3联体密码位置；箭头表示碱基突变位置。The underli ned is triplet c odon;the arrow i ndicate the mutation.
图3 RdRP 部分编码区序列及其对应的氨基酸序列F ig.3 The incomplete nucleotide o f RdRP of RBSDV
and the deduced amino acid
对S2大分子的核心蛋白基因的部分编码片段与已发表结果进行比较分析，发现有3个碱基的突变(图4)，对其编码的氨基酸序列进行分析发现,3个突变都是mRNA 密码子第3位碱基的改变，并且都是同义突变,ACT 突变为AC C,AC U 和ACC 都编码苏氨酸(Thr);GC T 突变为GCC,GC U 和GCC 编码丙氨酸(Ala)。
对S6大分子的沉默抑制子基因的部分编码片
6期杨 杰等：江苏水稻黑条矮缩病病毒的R T -PCR 分析和快速检测
89
段与已发表结果进行比较分析发现有1个碱基的突变(图5)，对其编码的氨基酸序列进行分析发现，该
突变也是mRNA 密码子第2位碱基的改变，并且也是同义突变,TCC 突变为TC T,UCC 和UC U 都编码丝氨酸(Ser)。
对S10大分子的外壳蛋白基因的部分编码片段
与已发表结果进行比较分析发现有2个碱基的突变(图6)，对其编码的氨基酸序列进行分析发现，这些突变也是mRNA 密码子第3位碱基的改变,GG T 突变为GGC,GGU 和GGC 都编码甘氨酸(Gly );TGT 突变为TGC,UGU 和UGC 编码半光氨酸(Cys)，并且也是同义突变。
S2.已发表序列(AJ409145);J S2.本研究测序结果。S2.GenBank accession number(AJ409145);JS2.This research.
图4 RBSDV 的核心蛋白部分编码片段的共线性比较Fig.4 The alignment of incomplete core protein gene of
RBSDV
S6.已发表序列(AJ409148);J S6.本研究测序结果。S6.GenBank acces sion number(AJ409148);J S6.This research.
图5 RBSDV 的沉默抑制基因部分编码片段的共线性比较
Fig.5 The alignment of incom plete silencing suppressor gene of
RBSDV
S10.已发表序列(AJ409148);J S10.本研究测序结果。S10.GenBank accession number(AJ409148);JS10.This research.
图6 RBSDV 的外壳蛋白基因部分编码片段的共线性比较Fig.6 The alignment of incom plete coat protein gene of RBSDV
通过以上分析发现江苏南京市水稻黑条矮缩病的病原分离物与已发表的RBSDV 病原存在变异，有意思的是,7个碱基的突变都是同义突变，对氨基酸序列不影响，说明在蛋白水平上，水稻黑条矮缩病病毒编码的氨基酸存在保守性。
3 讨论
基因突变导致mRNA 密码子第3位碱基的改变
但不引起密码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变的核苷酸变异称为同义突变，反之则称为非同义突变。一般认为，同义突变不受自然选择，而非同义突变则受到自然选择作用。在进化分析中，了解同义突变和非同义突变发生的速率是很有意义的。很多研究表明同义突变的发生一般要比非同义突变快的多[24-26]
。本试验对在南京市收
集黑条矮缩病毒部分编码片段序列的分析结果中只
90
华 北 农 学 报23卷
发现同义突变，说明江苏省南京市发现的RB SDV 存在变异，但在蛋白水平上没有改变，本研究所克隆的4个片段是重要的功能基因，这对维持病原物的遗
传稳定性具有重要意义。
编码区的核苷酸位点可以分为非简并,2重简并和4重简并的位点[27]。如果一个位点上所有可能的变化都是非同义的，则该位点是非简并的；如果3种可能的变化中有1种是同义的，则该位点是2重简并的；如果所有可能的变化都是同义的，该位点即为4重简并的。根据定义所有非简并位点上的替换都是非同义的，而所有4重简并位点上的替换都是同义的，更复杂的是，在2重简并位点上，转换型变化(C -T 和A -G)是同义的，而所有其他变化，即颠换型变化，都是非同义的。本试验发现的RB SDV 基因组的突变主要是C -T 转换，其进化意义有待进一步深入研究。
对于植物体内的RBSDV 病毒，虽然可以根据其发病症状来判断，但寄主从感染病毒后到发病有相当长的一段潜育期，此间无法判断它是否受病毒感染，而且生物学症状容易受寄主生理、环境条件和观察者经验等因素的影响。用RT -PCR 方法检测则可以避免这些因素的干扰，具有专一性强、灵敏度高、快速而准确等优点。经GenBank Blast 检索，在水稻基因组序列中没有RBSDV 病毒同源序列，说明在水稻中没有病毒的内源基因，因此利用RBSDV 病毒的外壳蛋白、RNA 依赖的RNA 复制酶基因、基因沉默抑制子基因、核心蛋白基因的特异引物进行RT -PCR 鉴定该病毒是准确可行的。同时由于RBSDV 必须由灰飞虱在带毒的寄主植物食毒后才能带毒和传播病毒，因此，鉴定寄主植物的带毒情况对于水稻黑条矮缩病的预测预报及指导防治提供非常有价值的借鉴。
本研究建立的水稻感病植株病毒分子检测方法快速、简便、精确，可在水稻黑条矮缩病的流行学及预测预报中发挥重要作用，而且对类似持久性虫传病害(如水稻条纹叶枯病、玉米粗缩病)的预测预报及指导防治提供借鉴。
目前尚未发现水稻黑条矮缩病高抗或免疫品种，水稻中可能匮乏对该病毒的内源性抗病基因，本研究所克隆的RBSDV 的重要功能基因，为利用生物技术手段创建水稻条纹叶枯病抗源提供了外源基因，可进一步利用RNA 干扰原理创造抗病水稻新资源
[28-30]
。同时玉米粗缩病的病原物也是RB SDV,
在玉米中也没有内源的抗性基因[14]
，因此，本研究
所克隆的功能基因片段也可用于玉米粗缩病的生物
技术育种。参考文献:
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