1.引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长 会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否 则容易导致错配。引物3′端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使 错误引发机率增加。 3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱 基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3‛端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构 也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰 位点或标记物。 4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游 引物的GC含量不能相差太大。 5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计 算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C) + 2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻 近法(由。nearest neighbor
method)。
6. AG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的 相对稳定性。应当选用3′端AG值较低(绝对值不超过9),而5′端和中间AG 值相对较高的引物。引物的3'端的AG值过高，容易在错配位点形成双链结构并 引发DNA聚合反应。
7.引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚 体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。
8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
引物序列应该都是写成5-3方向的,
Tm之间的差异最好控制在1度之内，
另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。
要设计引物首先要到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是 否形成二级
结构。如这个区域单链能形成二级结构,就要避开它。如这一段不能 形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15〜30碱基之间。④G+C含量在40%〜60%之间。⑤碱基 要随机分布。⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。⑦引物之间不能有连 续4个碱基的互补。⑧引物5’端可以修饰。⑨引物3’端不可修饰。⑩引物 3’端要避开密码子的第3位。
1.引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互 补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结 构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测 估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能
（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用 7-deaza-2'-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2 （G+C）+（A+T），Ln值不能大于38，因为＞38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃）,不能保证产物的特异性。
4.G+C含量G+C含量一般为40%〜60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在 一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于 Tm值5〜10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效 引物的Tm为55〜80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧 啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集 序列区错误引发。
6.引物自身引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙 引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用 人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。
7.引物之间两引物之间不应不互补性，尤应避免3’端的互补重叠以防引物二聚 体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
8.引物的3′端引物的延伸是从3‘端开始的，不能进行任何修饰。3’端也不能有形 成任何二级结构可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3’端不能发生 错配。在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800^mol/L dNTP （四 种 dNTP 各 200Rmol/L）以质粒（103 拷贝）为模板，按95℃，25s； 55℃，25s； 72℃，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产 物的影响是有一定规律的。A : A错配使产量下降至1/20, A ： G和C ： C错七 下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。9. 引物的5‛端引物的5'端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因 此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记 生物素、荧光、、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、 插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。10.密码子的简并 如扩增编码区 域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影 响扩增特异性与效率。
Hairpin发卡结构
如果自由能值大于0 则该结构不稳定从而不会干扰反应如果自由能值小于0 则 该结构可以干扰反应
二聚体可以在序列相同的两条引物或正反向。引物之间形成如果配对区域在3 末端问题会更为严重3 末端配对很容易引起引物二聚
体扩增使
Pair Rating匹配度评分匹配度低的引物对常常不太有效是因为在同样退火温度 下Tm低的引物决定扩增的特异性而Tm高的引物更易于形成非特异性结合而造 成错误的起始
【1】引物的长度以15 —30bp为宜，否则会影响扩增的特异性。
【2】】碱基尽可能随机分布，避免相同的碱基成串排列，引物的G+C含量在 40%—60%之间，若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C,若G+C含量 太高，可在5‛端加上一些A或T。
【3】 应避免每条引物内部形成二级结构及两条引物的3'端互补形成引物二聚 体，避免在引物的3′端有3个G或3个C成串排列，3'端的末位碱基最好选T、 C、G,而不选A,也有建议在引物的两端用1—2个嘌呤碱基。
【4】尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过5℃）,退火温度 根据较低的Tm值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温 度。Tm值可以根据Tm=4（G+C）+2（A+T）计算。而对于较长的引物，Tm值需要 考虑动力学参数、从“最近邻位”的计算方式得到，现有的PCR引物设计软件大 多数都采用这种方式。（注：对于Tm值的计算有争议的地方是附加序列应不应 该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的 附加序列是不与模板链结合的，而在后来的PCR反应中，引物的附加序列是和 模板链结合了的。）
【5】 引物的3’端要与模板严格配对，而5’端碱基没有严格的限制，只要与模 板DNA结合的部分足够长，其5′端碱基可不与模板DNA配对而呈游离状态， 这样，我们可以在引物的5末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行 双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。
【6】不要在扩增序列的二级结构区设计引物，以免退火困难。也要考虑引物设 计处模板的特异性。
PCR 引物设计的目的是为了到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模 板DNA序
列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
要设计引物首先要到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是 否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能 形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片 段长度为100~600碱基对。
让我们先看看P1引物。一般引物序列中GC含量一般为40%〜60%。而且四种 碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合 理。应重新寻区域设计引物。
同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。
引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5'端加酶切位点 序列；标记生物素、荧光素、等，这对扩增的特异性影响不大。但3’端绝 对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3’端开始的。这里还需提醒的是3' 端不要终止于密码子的第3位，
因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特 异性与效率。
综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则:
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
② 产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15〜30碱基之间。
④G C含量在40%~60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5’端可以修饰。
⑨引物3’端不可修饰。
⑩引物3’端要避开密码子的第3位。
PCR 引物设计的目的是到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板
DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物 的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有 助于引物的设计。
1.引物的特异性
引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区
某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时 最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结 构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能(«°)小于58.6lkJ/mol时， 扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2'-脱氧GTP取代dGTP 对扩增的成功是有帮助的。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议