doi:10.3969/j.issn.2095-1736.2021.03.063
收稿日期:2020-03-06；最后修回日期:2020-04-07
基金项目：国家重点研发计划项目(2018YFD0900601)；国家自然科学基金项目(81771545)作者简介：常宇阳，硕士研究生，研究方向为鱼类性别调控和性别分化,E-mail: 通信作者：关桂君，教授，博士生导师，研究方向为鱼类性别调控和性别分化,E-mail:gjguan@
常宇阳
1,2,3
，武小雯
1,2,3
，郭海燕
1,2,3
，关桂君1,2,3
(1.上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海201306;2.上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海201306;
3.上海海洋大学水产科学国家实验教学示范中心，上海201306)
摘㊀要㊀芳香化酶是调节雄激素向雌激素合成转换的关键酶㊂脑型芳香化酶(cyp19b )的表达在成鱼青鳉的脑中呈现显著雌雄性差异，在性腺中微弱表达且无明显性别差异㊂为探讨cyp19b 基因的生理功能，采用CRISPR /Cas9系统靶向敲除cyp19b 基因㊂在青鳉cyp19b 基因的第2和第4外显子上分别设计一个靶位点，通过显微注射gRNA 和Cas9蛋白到一细胞期的受精卵进行cyp19b 双靶点基因敲除㊂研究结果表明：成功获得两种可遗传的cyp19b 突变等位基因型种鱼，并通过杂合子交配㊁基因组PCR 及DNA 测序分析，选育得到两种cyp19b 敲除突变型纯合子品系㊂表型观察分析显示，两种突变型纯合子品系均无明显雌雄性偏差，胚胎均可以正常发育，成鱼均可以正常生殖，提示cyp19b 基因的缺失可能不直接影响性腺的雌雄性分化㊂cyp19b 基因如何影响性腺分化和发育，有待进一步深入探讨㊂ 关键词㊀青鳉;cyp19b 基因；基因敲除;CRISPR /Cas9中图分类号㊀Q78文献标识码㊀A 文章编号㊀2095-1736(2021)03-0063-05
Knockout and identification of brain type aromatase gene cyp19b in medaka
CHANG Yuyang
1,2,3
,WU Xiaowen
1,2,3
,GUO Haiyan
1,2,3
,GUAN Guijun 1,2,3
(1.Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources,Ministry of Agriculture,Shanghai Ocean University,
Shanghai 201306,China;2.Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources,Ministry of
Education,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.National Demonstration Center for
Experimental Fisheries Science Education,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)
Abstract ㊀Aromatase is the key enzyme for the synthesis and conversion of estrogens from androgens.Brain type aromatase (cyp19b )
is predominantly expressed and displays a sexual dimorphism in adult brain,in contrast to a slight expression with no sexual dimor-phism in adult gonad of medaka (Oryzias latipes ).In order to explore the bio-function of cyp19b gene in brain and gonad development,we used CRISPR /Cas9system to targeted knockout cyp19b .Two targeting sites were designed at exon 2and exon 4,respectively.Mi-croinjection of aliquots containing gRNAs and Cas9protein was carried out into 1-cell fertilized eggs.Results showed that two heritable cyp19b mutant alleles were successfully obtained,and two cyp19b knockout mutant homozygous lines were selected through heterozygous mating,genomic PCR and DNA sequencing analysis.There was no significant male-or female-bias in both lines of cyp19b knockout ho-mozygotes.In both lines of cyp19b knockout homozygotes,the embryo could develop normally and the adult could reproduce normally,suggesting that the loss of cyp19b gene might not directly affect the sexual differentiation of gonads.
Key words ㊀medaka;cyp19b ;gene knockout;CRISPR /Cas9
芳香化酶(Aromatase)是内源性雌激素合成的关
键酶[1]㊂哺乳类和鸟类中，芳香化酶由一个单拷贝的
cyp19基因所编码[2]，在鱼类中则存在两种不同的芳香化酶编码基因cyp19a 和cyp19b ㊂青鳉(Japanese meda-
ka HdrR,Oryzias latipes )胚胎发育时期，雌雄鱼脑部
cyp19b 的表达没有明显差别，随着青春期性成熟过程开始,cyp19b 表达开始出现雌雄性差，脑中cyp19b 表达量雌性高于雄性，提示cyp19b 可能参与脑-性腺轴的雌雄性分化调控[3]㊂除了在脑中表达,cyp19b 在鱼类的性腺㊁肝脏等器官中也有表达[4]㊂cyp19a 主要在卵巢中表达，是雌激素合成关键酶，以维持卵巢和卵母细胞发育㊂化学诱导突变(ENU-based mutagenesis)青鳉
cyp19a 研究显示,cyp19a 缺失突变个体有早期卵巢发育，但在青春期之后因部分卵巢退化而出现卵巢向精巢转化的XX 雄性逆转表型㊂并且cyp19a 和cyp19b 双突变个体表型同cyp19a 单独敲除的表型基本一致，证明内源性雌激素不是XX 生殖细胞进入卵细胞早期发育的必需因子[5]㊂由于青鳉cyp19b 的功能未知，我们利用CRISPR /Cas9系统设计了靶向敲除cyp19b ，成功建立了可遗传的cyp19b 缺失
品系㊂
青鳉与人类一样拥有XY 型性别决定系统[6]，这
使得青鳉成为研究性别调控和性别分化的良好模式动物㊂其繁殖快，世代周期短，每天都能产卵，并且胚胎透明，能方便地进行显微注射操作㊂近年来CRISPR /Cas9系统由于操作简便㊁效率高，在青鳉基因编辑中已经有不少成功的应用[7
-8]
㊂研究使用
CRISPR /Cas9系统，通过直接注射gRNA 和Cas9蛋白进行基因编辑，免去了质粒构建等步骤，简化了实验流程[9-11]
㊂青鳉cyp19b 基因敲除品系的建立，将
为研究芳香化酶在性腺性别分化中的作用提供了实
验素材㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀实验动物及养殖条件
采用的青鳉为HdrR 品系，饲养在26ħ~28ħ的
循环水箱系统中，光暗循环时间为14/10h㊂实验涉及
的所有动物实验，都遵照上海海洋大学动物实验委员会的规定严格执行㊂
1.2㊀基因敲除靶位点设计1.
2.1㊀序列比对分析保守结构域
设计靶点前，首先要对目的基因编码的蛋白质进
行保守结构域的分析㊂使用ensemble()网站检索和下载人(Homo sapiens ,Hum )㊁鸡(Gallus gallus ,Chk )㊁青鳉(Oryzias latipes ,Ola )㊁罗非鱼(Oreochromis niloticus ,Ore )的Cyp19b 蛋白序列，采用
Vector NTI11.5进行氨基酸同源性序列比对分析，并根
据Pfam 数据库()，将蛋白质氨基酸序列同源保守的结构域进行标注㊂
1.2.2㊀在保守结构域上设计靶位点通过crisprscan ( /)网
站[12]，分别在青鳉cyp19b 基因的第2和第4外显子上检索预测CRISPR /Cas9编辑系统的靶向敲除位点，选择评分高且不易产生脱靶效应的2个靶点进行引物设计㊂在选定的靶序列5ᶄ端加上T7启动子序列,3ᶄ端加上能通过PCR 与gRNA scaffold 相连的序列(表1中下
划线显示)，最终合成的序列为cyp19b gRNA1和
cyp19b gRNA2(表1)㊂还要合成一段gRNA-scaffold 序
列，合成的序列如表1所示㊂上述寡聚核苷酸由上海生工生物工程有限公司合成并提供㊂
表1㊀用于gRNA 合成的DNA 片段
Table 1㊀DNA fragments for gRNA synthesis
名称Name 序列(5ᶄ-3ᶄ)
Sequence
用途Application cyp19b gRNA1GATCACTAATACGACTCACTATAGGACCAAGTCCTGCCAAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC gRNA 合成cyp19b gRNA2GATCACTAATACGACTCACTATAGGGAGCGTCCACATGTCCAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
gRNA 合成SgRNA-scaffold
AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC gRNA 合成Fw9CAATCATCTTAATCCCAGAGTGGG 突变检测Rv10GGCTGATGGAGAGCGTGTCCGGAGC 突变检测Fw5CACACATACCAGGTATGGGCTTC 突变检测Rv6
CAGTTGAGTAATACGTGCAGCTGACC
突变检测Fw13CAGGTCCTTCCTTCTGGACTT 突变检测Rv14
CATGTCGGAGGAGTTTCAGAGG
突变检测
1.3㊀gRNA 的制备
将cyp19b gRNA1和cyp19b gRNA2分别通过PCR
与SgRNA-scaffold 相连㊂PCR 反应程序为94ħ预变
性3min;94ħ变性30s,65ħ退火30s,72ħ延伸1min,34个循环;72ħ再延伸5min㊂PCR 的产物通过
QIAquick PCR Purification Kit 试剂盒(QIAGEN,28104)
进行纯化，之后通过MAXIscript T7In Vitro Transcrip-tion Kit (Thermo Fisher,AM1312)试剂盒进行体外转
录，得到gRNA1和gRNA2㊂通过氯化锂(LiCl)沉淀法纯化RNA(向体外转录得到的gRNA 中加入1/10体积的4mol /L LiCl 和2.5倍体积的无水乙醇，放置在-80ħ冰箱1h,4ħ12000r /min 离心15min，吸弃上
清液，再用70%乙醇清洗沉淀㊂移除乙醇，等离心管内残留的乙醇挥发后，用20μL 无酶水溶解沉淀，即得到
纯化后的gRNA)㊂纯化完成放入-80ħ冰箱备用㊂
1.4㊀显微注射
显微注射液的组成:gRNA1和gRNA2浓度均为
100ng /mL,Cas9蛋白(金斯瑞GeneScript,Z03385-100)
150ng /mL㊂注射前一天，用隔离缸将青鳉的雄性与雌
性隔离，注射当天解除隔离，使之交配并收取受精卵㊂青鳉自然交配受精后，卵细胞被激活进入减数分裂II 期分裂相，并释放极体㊂单倍体精子和卵子的细胞核融合最终形成合子，细胞质由植物极向动物极进行迁移㊂大约在30min 后抵达动物极，显微镜下观察到半透明凹陷状单一细胞㊂用毛细管显微注射针，将配制的gRNA 和Cas9蛋白混合液，注入此单一细胞内㊂
图1㊀不同物种的Cyp19氨基酸序列同源比对
Figure 1㊀Alignment of full-length Cyp19amino acid sequences among different species
1.5㊀突变鉴定及纯合子选育
将注射后的胚胎养至性成熟，剪尾鳍用海洋动物
组织基因组DNA 提取试剂盒(TIANGEN,DP324-03)提取基因组DNA，再用引物Fw9和Rv10(表1)进行基因组DNA 的PCR 扩增㊂PCR 产物用T7E1(金斯瑞Ge-neScript,Z03396-250)酶切，能切开的即为突变体F0代㊂将F0代突变体，与相对应的雌或雄性野生型青鳉进行配对交配(外交)㊂将子代养至成鱼，再提取DNA，用Fw5和Rv6引物PCR㊂PCR 产物进行TA 克隆并送测质粒，得到F1代杂合子突变型㊂将确认的F1代具有相同突变型的杂合子雌雄个体进行配对杂交，最终得到F2代cyp19b 基因敲除的纯合子青鳉㊂2㊀结果与分析
2.1㊀cyp19基因不同物种间的进化保守性
青鳉cyp19b 基因编码499个氨基酸，并且含有一
个细胞素P450同工酶特有同源结构域，这一结构域的氨基酸序列从鱼类到人Cyp19蛋白中都保守存在，是蛋白酶催化活性必不可缺的(图1)㊂由于这一结构
域在Cyp19a 和Cyp19b 中都存在，在设计靶位点时，既要保证破坏Cyp19b 中P450功能结构域，又要避开因为P450结构域相似度高而破坏Cyp19a 功能的靶点㊂
2.2㊀cyp19b 基因敲除青鳉的筛选和鉴定设计的基因敲除双靶位点如图2(a)所示㊂取5
条显微注射后的成鱼尾鳍DNA，用Fw9和Rv10引物进行基因组PCR 扩增,PCR 产物进行T7E1酶切消化，其结果显示为野生型(WT)未能被T7E1酶切消化，因
而呈一条带，如图2(b)WT 所示㊂#1㊁#2㊁#3㊁#5同WT 一样，不能被T7E1酶切消化；而#4个体，因其DNA 双链错配而被T7E1酶切消化，酶切反应呈阳性，出现WT 以外的两条带㊂这条F0突变体是雄鱼，我们将其与3条野生型的雌鱼进行配对，并将其产生的子代养大
㊂
(a)青鳉cyp19b 基因敲除策略示意图;(b)F0代青鳉突变体的筛选鉴定电泳图(T7E1酶切)
图2㊀cyp19b 基因的敲除设计与F0代突变体的筛选鉴定
Figure 2㊀Knockout design and identification of cyp19b mutations
2.3㊀cyp19b 基因敲除F1代青鳉的鉴定
针对F0代突变型种鱼与正常青鳉杂交得到的子
代青鳉，取尾鳍DNA 进行靶点区域的基因组鉴定，分离得到两种可遗传的突变类型[图
3(b)]㊂第1种是因双靶点的有效切割，导致562bp 的缺失，并同时插入9bp 碱基的突变体，我们将其命名为Mut1㊂Mut1型突变的杂合子用引物Fw5和Rv6进行PCR 能够扩增得到两条带，没有突变的条带是920bp，发生突变的条带是367bp[图3(b)]㊂第2种
是在第1个靶位点缺失了
5bp，在第2个靶位点插入了
10bp，命名为Mut2㊂在Mut2的特异序列位点附近，设计了一对特异性引物Fw13和Rv14(表1)，这对引物能够有效和特异性扩增Mut2突变类型的杂合子或者纯合子，得到长度为579bp 的PCR 产物，而野生型则
无PCR 扩增条带[图3(a)]㊂虽然特异性引物Fw13和Rv14能鉴别野生型和Mut2突变型，但无法区分杂合子和纯合子突变，还要利用Fw5和Rv6引物对其进行基因组PCR 扩增和DNA 测序来最终确认Mut2的杂合子或纯合子㊂DNA 测序的峰图显示，靶位点处有重叠峰的为杂合子，靶位点处呈现单峰，并且序列不同于野生型的为纯合子[图3(c)]㊂
突变体氨基酸序列显示,Mut2因缺失5个碱基产生移码突变和终止密码子的提前出现，形成缺失P450功能结构域的蛋白产物，导致Cyp19b 功能丧失[图3
(d)]㊂Mut1突变体虽发生大片段缺失，但没有发生移码突变，最终导致在保守的P450结构域上丢失130个氨基酸，推测Mut1型突变体的蛋白酶活性功能也会部分或完全受损
㊂
(a)野生型和两种突变型的DNA 序列;(b)两种突变型的电泳鉴定;(c)两种突变型的DNA 测序峰图;(d)野生型和两种突变型(完全
或部分缺失P450结构域)对应的氨基酸序列
图3㊀cyp19b 基因突变型的分离及鉴定
Figure 3㊀Characterization of cyp19b gene mutation
2.4㊀青鳉Cyp19b 敲除型纯合子的筛选及其表型观察分析
将具有相同突变基因型的cyp19b +/-的性成熟青鳉雌雄配对，产生的子代3个月性成熟后剪取尾鳍，将抽提得到的基因组DNA 为模板，用特异引物进行PCR 及测序鉴定，筛选得到纯合子㊂初步观察显示,cyp19b -/-纯合子没有发生明显的胚胎期死亡，基本上都能够正常发育至成鱼㊂性成熟的cyp19b -/-纯合子青鳉有雄性也有雌性，目前鉴定得到Mut1纯合子7条雄鱼和5条雌鱼,Mut2纯合子5条雄鱼和4条雌鱼㊂两种突变类型的纯合子均可正常交配繁殖子代，说明cyp19b 基因不是胚胎发生发育必不可少的因子㊂
3㊀讨论研究在青鳉中首先实施了用PCR 直接扩增
gRNA 模板的简易CRISPR /Cas9方法敲除cyp19b 基因，并成功筛选出两种突变纯合子(cyp19b -∕-Mut1&Mut2)㊂相比单靶点敲除，双靶点可在不同位点同时进行敲除而产生靶基因的大片段缺失，既提升敲除概率，又能确保靶向基因功能区域的彻底敲除，还有利于突变型的PCR 筛选㊂但是多靶点同时敲除，也意味着脱靶效应风险的增加[13]㊂为了避免基因编辑过程中产生脱靶，应该选择潜在脱靶效应少的靶位
点，用gRNA 和Cas9蛋白质的最佳匹配浓度实施显微注射，最大限度地降低脱靶效应发生[14]㊂实验得到的两个不同类型的突变，全部或部分破坏了cyp19b
基因的细胞素氧化酶P450结构域[15-16]，从而破坏了Cyp19b 蛋白产物的生物学活性㊂初步观察发现cyp19b 突变型纯合子雌雄个体均能够正常生长繁殖㊂斑马鱼中敲除cyp19b 基因显示其精巢和卵巢发育正常，也能够正常繁殖[17]㊂然而，有报道发现cyp19b 基因敲除的罗非鱼雄性精巢，其输精管发育异常而形成输精管阻塞纤维化，导致雄性不育[18]，提示罗非鱼和小型鱼类(青鳉和斑马鱼)的cyp19b 基因在精巢发育中的功能多样性㊂鱼类的性别决定既有遗传决定的XY 型或ZW 型，也有温度㊁光照或pH 等非遗传决定因素㊂鱼类和其他脊椎动物的性别决定因素虽呈多样性，但调控生殖细胞进入雌雄分化的信号通路仍有高度的进化保守性㊂最新研究发现Elavl2和Ddx6是调控小鼠卵泡休眠期进入活跃期转变的关键因子[19
-20]
，在gsdf 缺失卵巢中也显著升高，提示
Elavl2和Ddx6可能受gsdf 调控，参与调控卵泡休眠期进入活跃期的转变过程㊂我们还发现gsdf 和cyp19b 双敲的XY 性腺中，卵母细胞数目显著下降，提示cyp19b 可能同Elavl2和Ddx6，或其他未知因子协同参与生殖干细胞微环境的调控㊂
青鳉cyp19a 和cyp19b 在性分化过程中的表达部位不同，在发育过程中的时空表达不重叠，推测两者功能互补的可能性不高[21]㊂cyp19a 和cyp19b
双敲结果[5]和本实验cyp19b单独敲除之后的结果，都说明青鳉cyp19b对性腺分化和发育的影响是有限的，其他因子可能替代cyp19b参与调控生殖细胞性分化的作用㊂Cyp19b敲除品系为进一步研究其功能以及其他因子的遗传补偿作用，提供了活体研究平台㊂
实验首次采用改良的简易CRISPR/Cas9系统对青鳉cyp19b基因进行敲除，成功得到了两个不同突变类型的cyp19b敲除青鳉㊂cyp19b敲除青鳉模型的成功构建为研究脑型芳香化酶在青鳉脑和性腺性别分化中的作用打下了坚实的基础㊂
参考文献
[1]FORLANO P M,DEITCHER D L,MYERS D A,et al.Anatomical distribution and cellular basis for hig
h levels of aromatase activity in the brain of teleost fish:aromatase enzyme and mRNA expression i-dentify glia as source[J].Journal of Neuroscience,2001,21(22): 8943-8955.
[2]ROSELLI C F.Brain aromatase:roles in reproduction and neuropro-tection[J].Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2007,106(1/2/3/4/5):143-150.
[3]OKUBO K,TAKEUCHI A,CHAUBE R,et al.Sex differences in aromatase gene expression in the medaka brain[J].Journal of Neuro-endocrinology,2011,23(5):412-423.
[4]CHAUBE R,RAWAT A,JOY K P.Molecular cloning and charac-terization of brain and ovarian cytochrome P450aromatase genes in the catfish Heteropneustes fossilis:sex,tissue and seasonal variation in,and effects of gonadotropin on gene expression[J].General and Comparative Endocrinology,2015,221:120-133.
[5]NAKAMOTO M,SHIBATA Y,OHNO K,et al.Ovarian aromatase loss-of-function mutant medaka undergo ovary degeneration and par-tial female-to-male sex reversal after puberty[J].Molecular and Cel-lular Endocrinology,2018,460:104-122.
[6]MATSUDA M,NAGAHAMA Y,SHINOMIYA A,et al.DMY is a Y-specific DM-domain gene required fo
r male development in the medaka fish[J].Nature,2002,417(6888):559-563. [7]FANG J,CHEN T,PAN Q,et al.Generation of albino medaka (Oryzias latipes)by CRISPR/Cas9[J].Journal of Experimental Zo-ology Part B Molecular and Developmental Evolution,2018, 330(4):242-246.
[8]WATAKABE I,HASHIMOTO H,KIMURA Y,et al.Highly effi-cient generation of knock-in transgenic medaka by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering[J].Zoological Letters,2018,4:3.[9]VARSHNEY G K,CARRINGTON B,PEI W,et al.A high-throughput functional genomics workflow based on CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in zebrafish[J].Nature Protocols, 2016,11(12):2357-2375.
[10]VARSHNEY G K,PEI W,LAFAVE M C,et al.High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9 [J].Genome Research,2015,25(7):1030-1042. [11]CHANG N,SUN C,GAO L,et al.Genome editing with RNA-guided Cas9nuclease in zebrafish embryos[J].Cell Research, 2013,23(4):465-472.
[12]MORENO-MATEOS M A,VEJNAR C E,BEAUDOIN J D,et al. CRISPRscan:designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo[J].Nature Methods,2015,12(10):982-988.
[13]MA Y,ZHANG L,HUANG X.Genome modification by CRISPR/ Cas9[J].FEBS Journal,2014,281(2
3):5186-5193. [14]SHEN B,ZHANG W,ZHANG J,et al.Efficient genome modifica-tion by CRISPR-Cas9nickase with minimal off-target effects[J]. Nature Methods,2014,11(4):399-402.
[15]DANIELSON P B.The cytochrome P450superfamily:biochemis-try,evolution and drug metabolism in humans[J].Current Drug Metabolism,2002,3(6):561-597.
[16]ZHANG J W,LIU Y,CHENG J,et al.Inhibition of human liver cytochrome P450by star fruit juice[J].Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences,2007,10(4):496-503. [17]YIN Y,TANG H,LIU Y,et al.Targeted disruption of aromatase reveals dual functions of cyp19a1a during sex differentiation in ze-brafish[J].Endocrinology,2017,158(9):3030-3041. [18]ZHANG X,MIN Q,LI M,et al.Mutation of cyp19a1b results in sterile males due to efferent duct obstruction in Nile tilapia[J].Mo-lecular Reproduction and Development,2019,86(9):1224-1235.
[19]TALWAR T,VIDHYASAGAR V,QING J,et al.The DEAD-box protein DDX43(HAGE)is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required for full nucleic acid unwinding activity [J].Journal of Biological Chemistry,2017,292(25): 10429-10443.
[20]STEFANO B,NORIYOSHI U,GENECIEVE K,et al.ELAVL2-regulated transcriptional and splicing networks in human neurons link neurodevelopment and autism[J].Human Molecular Genetics, 2016,
25(12):2451-2464.
[21]PATIL J G,GUNASEKERA R M.Tissue and sexually dimorphic expression of ovarian and brain aromatase mRNA in the Japanese medaka(Oryzias latipes):implications for their preferential roles in ovarian and neural differentiation and development[J].General and Comparative Endocrinology,2008,158(1):131-137.
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议