一种支原体LAMP荧光检测引物组合物及其LAMP荧光检测法的制作方法

一种支原体lamp荧光检测引物组合物及其lamp荧光检测法
技术领域
1.本发明涉及支原体lamp检测技术领域，尤其涉及一种支原体lamp荧光检测引物组合物及其lamp荧光检测法。

背景技术：

2.自1980年pcr技术发明后，基于pcr技术的核酸检测迅速应用到临床、食品、环境的检测中，并成为核酸检测的金标准。但pcr的检测技术存在设备体积大、粗样品耐受性差、反应时间长、灵敏度难以达到单copy等诸多缺点，已经难以满足现代核酸检测的要求：速度快（《30min）、超灵敏度（1-5copy/test）、大体积粗制样品直检（20-50%反应体积样本量）、野外操作、简单化操作等方面的指标。在过去的20年中科学家一直尝试通过恒温扩增的方法来实现上述目标，这其中包括rca(rolling circle amplification)、lamp(loop-mediated isothermal amplification)、rpa(recombinase polymerase amplification)、nasba(nucleic acid sequence based amplification)、sda(strand displacement amplification)、hda (helicase dependent amplification)、tma(transcription-mediated amplification)等新型核酸恒温扩增技术。
3.在这些恒温扩增技术中，以2000年首次报道的lamp法尤为耀眼和引人关注，目前占据超过60%的恒温检测市场。核酸检测对lamp技术如此亲赖，究其原因，得益于其它恒温检测技术难以达到lamp技术的综合性优势：1、反应速度极快，优化的引物组合可以达到15min内检测到单copy分子，检测速度接近或超过rpa和nasba；能够达到超敏检测极限，1-5copy的分子能够稳定检出，稳定性极高，其它任何恒温技术难以达到如此稳定的水平；2、结果判读形式的多样化，适应各种环境和条件下的核酸快速检测。lamp扩增作为终点判读形式，可不借助任何其它辅助设备，裸眼观察检出结果。基于钙黄绿素、hnb、红黄变、og橙绿变都可以肉眼观察结果。lamp同样可借助浊度仪进行实时浊度分析。在反应体系中加入sybr green荧光染料后，可使用小型恒温荧光仪进行实时检测。以上这些结果判读形式均可在野外等非标准实验室进行，所需设备简单、小巧、价格低廉、便于普及。除此外，传统实验室中的荧光定量pcr仪，同样可进行lamp检测，可采用sybr green、mb探针法或lamp taqman探针法，对于经常操作pcr检测的人员来讲，可以无缝对接、无需更换设备。
4.3、对rna病毒的漏检率低，由于rna病毒的突变率较高，在pcr检测中个别突变对pcr的扩增影响较大，容易造成病毒漏检的假阴性。而lamp识别靶基因8个区段，在这些识别区段中个别的突变对lamp扩增影响较小，不易产生漏检。
5.4、试剂稳定、易于使用。同rpa、nasba等技术相比，lamp与pcr法都采用单一酶（或双酶）系统进行反应，生产批次稳定、反应酶系统耐高温，试剂稳定性好。在检测试剂中仅包含酶mix一管、引物/探针一管，使用方便，在荧光定量pcr机器上可方便的进行高通量检测。而rpa、nasba等系统需要多个复合酶，比例严谨、试剂稳定生产困难、保存运输条件苛刻、难
以高通量应用。
6.5、lamp法对耐受杂质能力最强。pcr、rpa、nasba等扩增体系均需要进行核酸纯化制备，在进行粗制品的直扩系统中，上样量均较小（《10%），无法大体积上样，杂质对这些扩增方法均影响较大。而lamp法对大多数样本的耐受性能达到20%以上，个别样本的含量可以容忍到50%以上，如此大的上样体积量，决定了lamp具有更高的检出率。
7.6、扩增反应同步病毒灭活，由于lamp反应温度在65℃的高温条件下进行，在病毒液直扩中，反应过程中即可灭活病毒，降低耗材的污染风险。
8.7、高特异性，随着lamp用酶不断改进、反应缓冲液的不断优化、探针技术的搭配、引物设计理念的不断改善，lamp的非特异性扩增获得质的提升，目前在优化的lamp体系中，假阳性的情况已经得到根本改善，假阳性比例接近甚至低于pcr方法。
9.lamp的劣势：（1）、对引物的要求特别高（2）、扩增产物不能用于克隆测序，只能用于判断（3）、由于其敏感性强，特别容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果（4）、多种检测比较困难（5）、基于钙黄绿素、hnb、红黄变、og橙绿变都可以肉眼观察结果。lamp同样可借助浊度仪进行实时浊度分析。在反应体系中加入sybr green荧光染料后，可使用小型恒温荧光仪进行实时检测。以上这些结果判读形式均可在野外等非标准实验室进行，所需设备简单、小巧、价格低廉、便于普及。基于这样观察，容易出现假阳性；（6）、对支原体的检测特异性低。

技术实现要素：

10.鉴于背景技术存在的不足，本发明涉及一种支原体lamp荧光检测引物组合物及其猫瘟病毒lamp荧光检测法，以解决引物要求高、扩增产物不能用于克隆测序、敏感性低、多种检测苦难、假阳性较高、对猫瘟病毒特异性低的问题。
11.本发明涉及一种支原体lamp荧光检测引物组合物，由正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3与探针lf、lf1、lf-q组成；各引物序列具体如下：f3 5
’‑
ctcaaatggatggtgctatc-3’；b3 5
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tggagcattatctccatcaa-3’；fip 5
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cgaggaacaccaacttgtctagata-ttagttgttgctgcaacaga-3’；bip 5
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bio aaggtgaagaagagatgattgaact-tccgtattctgaaagaagtgaa-3’；lf: 5
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aaagaatgtgttcacgtgtttga-3’；lf1: 5
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（fam） gtcagtgcaggctcccgtaaagaatgtgttcacgtgtttga（thf）gcattggtcca-3
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（c3-spacer）；lf-q：5
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acgggagcctgcactgac-3’（bhq1）。
12.进一步的，所述探针lf1与lf-q替换为lf’，其中lf’的序列为：lf
’ꢀ5’‑
（bhq1）attgcgggagatgagacccgcaa（fam-dt）aaagaatgtgttcacgtgtttga（thf）gcattggtcca-3
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（c3-spacer）。
13.进一步的，所述反向内引物bip设有生物锁。
14.本发明还提供了一种支原体lamp荧光检测法，其特征在于，采用上述的支原体lamp荧光检测组合物，具体检测方法如下：12.5ul 2
×
buffer（1.6m甜菜碱，40 mm tris-hcl (ph 8.8), 20 mm kcl, 20 mm (nh4)2so4, 4pmol lf，16pmol lf1和16pmol的lb-q 1ul bst 2.0 dna polymerase，8.4 mm mgso4， 1.2 um dntps ，1ul endo iv ，加入模板2ul，其余加水补充至25ul；放置在博日荧光定量pcr仪器中，40cycles 60℃ 60s 读取fam荧光，反应结束后取10ul的产物加入190ul的水中，振荡混匀，滴管取约60ul液体加入核酸试纸条中，5min观察。
15.进一步的，将所述16pmol lf1和16pmol的lb-q替换为16pmol lf’。
16.本发明的主要有益效果：1、大大提升lamp检测猫杯状病毒的特异性，减少假阳；2、可以进行多重lamp反应；3、荧光和胶体金可以同时检测，从而节约成本和时间；4、基于荧光检测，提升灵敏度。
附图说明
17.图1是本发明扩增曲线图。
具体实施方式
18.以下将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述和讨论，显然，这里所描述的仅仅是本发明的一部分实例，并不是全部的实例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
19.为了便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以具体实施例为例作进一步的解释说明，且各个实施例不构成对本发明实施例的限定。
20.本发明的实施例1，涉及一种支原体lamp荧光检测引物组合物，由正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3与探针lf、lf1、lf-q组成；各引物序列具体如下：f3 5
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ctcaaatggatggtgctatc-3’；b3 5
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tggagcattatctccatcaa-3’；fip 5
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cgaggaacaccaacttgtctagata-ttagttgttgctgcaacaga-3’；bip 5
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bio aaggtgaagaagagatgattgaact-tccgtattctgaaagaagtgaa-3’；lf: 5
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aaagaatgtgttcacgtgtttga-3’；lf1: 5
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（fam） gtcagtgcaggctcccgtaaagaatgtgttcacgtgtttga（thf）gcattggtcca-3
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（c3-spacer）；lf-q：5
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acgggagcctgcactgac-3’（bhq1）。
21.其中所述探针lf1与lf-q替换为lf’，其中lf’的序列为：lf
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（bhq1）attgcgggagatgagacccgcaa（fam-dt）aaagaatgtgttcacgtgtttga（thf）gcattggtcca-3
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（c3-spacer）。
22.其中所述反向内引物bip设有生物锁，所述生物锁对荧光检测没有影响，同时为试纸条检测提供基础。
23.本实施例设有对比实验，采用探针lf1与lf-q为反应体系1，采用探针lf’为反应体系2，采用eva green荧光染料为对照反应体系，具体实验如下：反应体系1：12.5ul 2
×
buffer（1.6m甜菜碱，40 mm tris-hcl (ph 8.8), 20 mm kcl, 20 mm (nh4)2so4, 4pmol lf，16pmol lf1和16pmol的lb-q 1ul bst 2.0 dna polymerase，8.4 mm mgso4， 1.2 um dntps ，1ul endo iv ，加入模板2ul，其余加水补充至25ul；放置在博日荧光定量pcr仪器中，40cycles 60℃ 60s 读取fam荧光，反应结束后取10ul的产物加入190ul的水中，振荡混匀，滴管取约60ul液体加入核酸试纸条中，5min观察。
24.反应体系2：12.5ul 2
×
buffer（1.6m甜菜碱，40 mm tris-hcl (ph 8.8), 20 mm kcl, 20 mm (nh4)2so4, and 0.2% tween 20)，5 pmol f3 ，5pmol b3, 40 pmol biotin-fip primers，40 pmol biotin-bip，4pmol lf，16pmol lf
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1ul bst 2.0 dna polymerase，8.4 mm mgso4， 1.2 um dntps ，1ul endo iv ，加入模板2ul，其余加水补充至25ul放置在博日荧光定量pcr仪器中，40cycles 60℃ 60s 读取fam荧光，反应结束后取10ul的产物加入190ul的水中，振荡混匀，滴管取约60ul液体加入核酸试纸条中，5min观察。
25.表1：荧光ct值对比表结论反应体系1与反应体系2中ct值均满足荧光检测，同时还可以进行试纸条检测，从而节约成本和时间。
26.最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本发明的具体实施方式，用以说明本发明技术方案，而非对其限制，本发明的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

技术特征：

1.一种支原体lamp荧光检测引物组合物，其特征在于，由正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3与探针lf、lf1、lf-q组成；各引物序列具体如下：f3 5
’‑
ctcaaatggatggtgctatc-3’；b3 5
’‑
tggagcattatctccatcaa-3’；fip 5
’‑
cgaggaacaccaacttgtctagata-ttagttgttgctgcaacaga-3’；bip 5
’‑
bio aaggtgaagaagagatgattgaact-tccgtattctgaaagaagtgaa-3’；lf: 5
’‑
aaagaatgtgttcacgtgtttga-3’；lf1: 5
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（fam） gtcagtgcaggctcccgtaaagaatgtgttcacgtgtttga（thf）gcattggtcca-3
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（c3-spacer）；lf-q：5
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acgggagcctgcactgac-3’（bhq1）。2.根据权利要求1所述的一种支原体lamp荧光检测引物组合物，其特征在于，所述探针lf1与lf-q替换为lf’，其中lf’的序列为：lf
’ꢀ5’‑
（bhq1）attgcgggagatgagacccgcaa（fam-dt）aaagaatgtgttcacgtgtttga（thf）gcattggtcca-3
’ꢀ
（c3-spacer）。3.根据权利要求1或2所述的一种支原体lamp荧光检测引物组合物，其特征在于：所述反向内引物bip设有生物锁。4.一种支原体lamp荧光检测法，其特征在于，采用权利要求3所述的支原体lamp荧光检测组合物，具体检测方法如下：12.5ul 2
×
buffer（1.6m甜菜碱，40 mm tris-hcl (ph 8.8), 20 mm kcl, 20 mm (nh4)2so4, 4pmol lf，16pmol lf1和16pmol的lb-q 1ul bst 2.0 dna polymerase，8.4 mm mgso4， 1.2 um dntps ，1ul endo iv ，加入模板2ul，其余加水补充至25ul；放置在博日荧光定量pcr仪器中，40cycles 60℃ 60s 读取fam荧光，反应结束后取10ul的产物加入190ul的水中，振荡混匀，滴管取约60ul液体加入核酸试纸条中，5min观察。5.根据权利要求4所述的一种支原体lamp荧光检测法，其特征在于：将所述16pmol lf1和16pmol的lb-q替换为16pmol lf’。

技术总结

本发明涉及支原体LAMP检测技术领域，尤其涉及一种支原体LAMP荧光检测引物组合物及其LAMP荧光检测法，其中一种支原体LAMP荧光检测引物组合物，由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3与探针LF、LF1、LF-Q组成，本发明大大提升LAMP检测猫杯状病毒的特异性，减少假阳；可以进行多重LAMP反应；荧光和胶体金可以同时检测，从而节约成本和时间；基于荧光检测，提升灵敏度。提升灵敏度。提升灵敏度。