07微生物学杂志 2007年9月第27卷第5期 JOURNAL OF M I CROB I O LOGY Sep t.2007Vol.27No.5
席琳乔1,2，王静芳2，马金萍2，龚明福1，张利莉13
(1.新疆生产建设兵团塔里木盆地微生物多样性重点实验室，新疆阿拉尔 843300;
2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300)
摘 要 利用特殊培养基对盐碱地棉花根际解磷菌进行了分离以及pH值和分泌有机酸能力的初步测定。利用溶磷圈法筛选出10个解磷能力较高的菌株进行深入研究，其中液体培养条件下测定了菌株的溶磷能力，有效磷在4.04～185.63mg/L，其中wpL2溶磷量达到185.63mg/L；测定了培养液pH值，下降到5.12～6.67，但是pH与溶磷量之间没有线性关系，测定了培养液的有机酸含量，菌株溶磷量与有机酸总量没有线性相关性，其中所分离到的解无机磷菌株均可以分泌酒石酸，除此之外,wpc1还分泌乙酸,wpc2和wpL2还分泌柠檬酸；分离到的解有机磷菌株均可分泌乙酸，除此之外,ypL1和ypc2分泌酒石酸,ypL3分泌柠檬酸,ypL2和ypc3分泌柠檬酸和丁二酸，均不能产生苹果酸。 关键词 解磷菌；解磷能力；有机酸；测定；棉花
中图分类号 S562 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2007)05-0070-05
D eter m i n a ti on for Solub ili z i n g Phospha te Ab ility and O rgan i c Ac i ds
Secreti on of Phosphobacter i a i n the Cotton Rh i zosphere
X IL in2qiao1,2,WANG J ing2fang2,MA J in2p ing2,G ONG M ing2fu1,ZHANG L i2li1
(1.X injiang Prodution&Construction Corps key laboratory of P rotection and U tilization of B iological R esources
in Tari m B asin X injiang,A laer,843300;2.X injiang Production&Construction C rops Key L aboratory of
Tari m A ni m al Husbandry Science&Technology X injiang,A laer,843300)
Abstract I n this research,the is olati on,culture of highly effective phos phobacteria fr om s oil and screening,purif2 ying of the m were studied.Ten strains which have a diss olving phos phorus capacity of4.04～185.63mg/L under liq2 uid conditins were screened thr ough studise on capacity of diss olving phos phorus.The pH included the diss olving phos2 phorus and basic character of these strains.Itwas found that strains had comp lete capacity t o s olubilize the phos phate.
The changes in pH value and in phos phor contentwere deter m ined when strains were gr own in liquid mediu m cultures.
pH decreased t o5.12～6.67.The t otal quantity and constituents of the organic acid were quite different for each strains.O rganic acids p r oduced by the strain were analysised in liquid chr omat ogra m.The bacteria mainly p r oduced tartaric acid,succinic acid,malic acid,citric acid and acetic acid.There was no significant relati onshi p bet w een the phos phate s olubilizati on capacity and the t otal and single quantity of the organic acids.Solubilizing organic phos phate strains can p r oduce tartaric acid,wpc1can p r oduce acetic acid,wpc2and wpL2can p r oduce citric acid;Solubilizing organic phos phate strains can p r oduce acetic acid,ypL1and ypc2can p r oduce tartaric acid,ypL3can p r oduce citric acid,ypL2and ypc3can p r oduce citric acid and succinic acid.But all did not p r oduce malic acid.
Keywords Phos phobacteria;Capacity of diss olving Phos phorus;organic acids;deter m inati on;s olubilizing phos phate
收稿日期:2007-04-13
作者简介：席琳乔 男，讲师。主要从事草地农业生态的教学和科研工作。
项目来源：教育部重点项目(207139)；新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室开放课题(BR0506)；新疆生 产建设兵团科技攻关计划项目(2006GG26)
3通讯作者
磷是植物生长发育的重要物质基础，我国有74%耕地土壤缺磷，解决途径有增加磷源投入，提高难溶性磷的利用率。在生产实践中，作物对磷肥当季利用率一般为5%～10%，加上作物的后效，不超过25%，大部分磷肥作为难溶态在土壤中积累。挖掘土壤潜在磷库资源，降低化肥过量施用造成的环境污染，成为农业研究的一个热点。研究表明土壤微生物能够将难以吸收的磷转化为可吸收的形态，种子或土壤接菌后，能显著提高作 物产量[1,2]
。微生物活化磷出对持续高效农业具有深远的意义。实验对新疆盐碱地棉花(Gossypi 2um hirsutum )根际解磷菌进行了分离和相关特性的测定，以筛选出优良的菌株，为棉花微生物菌肥的开发提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验地 采样地点在阿拉尔市塔河种业
实验地。该地区属暖温带荒漠干旱气候，降水稀
少，年平均降水量仅为42～76mm ，而年平均蒸发量1900～2800mm 。全年日照时数2556.3～2991.8h，年平均气温8.9～11.4℃，无霜期
183～221d，作物主要有棉花、水稻等[3]
。
1.1.2 分离培养基 解无机磷细菌采用PK O (Pikovskaya ′s Mediu m )培养基，解有机磷细菌采用蒙金娜有机培养基[4,5,8]
；菌株保存采用LB 培养基。①蒙金娜有机培养基(g/L )：葡萄糖10，硫酸铵0.5，氯化钠0.3，氯化钾0.3，硫酸亚铁0.03，硫酸锰0.03，蛋黄卵磷脂0.2，碳酸钙5，琼脂20,pH =7.0～7.5;②PK O 培养基(g/L )：葡萄糖10，磷酸钙5.0，硫酸铵0.5，氯化钠0.2，氯化钾0.2，硫酸镁0.03，硫酸锰0.03，硫酸亚铁0.003，琼脂20,pH =6.8～7.0;③LB (Luria 2ber 2tani medium )培养基(g/L )：酵母粉5，蛋白胨10,
氯化钠5.0～10.0，琼脂20,pH =7.5。1.2 方法1.2.1 解磷菌菌株的初选及溶磷菌的测定 将分离获得的纯菌株分别点接种于蒙金娜有机培养基和PK O 培养基上，观察有无溶磷圈的出现，并根据溶磷圈直径(D )与菌落直径(d )比值的大小来初步确定解磷能力。将有溶磷作用的分离物接于LB 试管斜面培养基上保存备用。在150mL 三角瓶中分别装入PK O 和蒙金娜培养基50mL，高压灭菌30m in，然后将LB 培养基上生长24h
的细菌制成菌悬液(菌数约为108
个/mL )，然后接种500μL 到PK O 和蒙金娜液体培养基上，重复3次,28℃下摇床培养(160r/m in )7d 后,4℃离心(10000r/m in )15m in，取适量的上清液，测定含磷量、pH 值和有机酸含量和种类[4]
。上清液含磷量用钼锑抗比法测定，溶磷量为扣除不接种对照的值，以mg P /l 来表示;pH 值用酸度计测定(MP 220酸度计)。有机酸用岛津美国W aters475高效液相谱测定(紫外检测器W aters487)，谱条件：分析柱C18,4.6mm ×250mm ，检测波长210nm ，流动相为pH =2.75,0.01mol/L 磷酸二氢钾缓冲液，流速1.0mL /m in，柱
温25℃[5]
。
1.2.2 土壤基本理化性质的测定 总盐采用蒸
干残渣法;pH 采用哈纳pH211酸度计；有机质采用重铬酸钾法；全氮采用H 2S O 42H 2O 2消煮2开氏法；速氮采用扩散吸收法；全磷采用H 2S O 42H 2O 2消煮2钼兰比法；速效磷采用碳酸氢钠法；全钾采用H 2S O 42H 2O 2消煮，速效钾采用NH 4OAc 浸提，火焰分光度计测定。
2 结果与分析
2.1 样地土壤理化性质的测定
样地土壤理化性质的测定结果见表1。
表1 样地土壤理化性质
Table 1 Physical and chem ical characters of s oil at sa mp ling sites
样品名称总盐/%
pH 有机质/%
全氮/%速氮/×10-6全磷/%速磷/×10-6全钾/%速钾/×10-6
陆地棉0.397.55 1.31960.0601125.820.079623.630.6102184.95长绒棉
0.08
7.62
1.5262
0.0743
83.10
0.0810
37.54
0.6319
190.01
从表1中可以看出，总体上2种地的肥力较差，但是陆地棉的盐分含量较高，有机质较少，长
1
75期 席琳乔等：棉花根际解磷菌的解磷能力和分泌有机酸的初步测定
绒棉的含盐量较低，有机质的含量较高；可见长绒棉地的条件更有利于微生物的繁殖，引起这种原因可能是长绒棉植株比较高，水分蒸发少，土壤含水量高，对盐分和氮肥的淋溶较多，而陆地棉由于植株较低，水分蒸发较多，土壤含水量较低，对盐分和氮肥的淋溶较少。
2.2 溶磷能力的测定
液体培养条件下测定了10个菌株的溶磷能力，结果见表2。各菌株都可以溶磷，菌株溶解无机磷和有机磷能力有差异，其有效磷增量在4.04～185.63μg/mL之间,wpL2溶磷量达到185.63μg/mL;10株解磷菌,9株有溶磷能力,1株几乎没有溶磷能力,4株来自长绒棉,6株而来自陆地
棉。wpL1和wpL2溶解无机磷Ca
3(P O
4
)
2
能力
较好,ypL2、ypc2和wpc4溶解有机磷蛋黄卵磷脂较好。wpL2和其他菌株的差异显著(P<0.01), wpL1和wpc1差异不显著，与其他菌株差异显著(P<0.01)，其他菌株差异不显著;3株菌溶磷能力较好,7株菌溶磷能力较差，总体上棉花根际细菌溶磷强度较差。
表2 不同菌株溶磷量及其pH值
Table2 Capacity of diss olving Phos phorus
and pH of different strains
菌株编号pH细菌浓度溶磷量宿主
/(μg・mL-1)
wpc1 5.62 1.4323.64bc BC长绒棉
wpc2 5.90 1.40 4.04C长绒棉
wpL1 5.12 1.4654.57bB陆地棉
wpL2 5.41 1.48185.63a A陆地棉
ypL1 6.200.1612.78cC陆地棉
ypL2 6.530.2116.09cC陆地棉
ypL3 6.410.3811.57cC陆地棉
ypc2 6.670.2217.63cC长绒棉
ypc3 6.560.3211.68cC长绒棉
ypc4 6.570.8017.08cC长绒棉
注：小写字母表示差异显著(P<0.05)；大写表示差异极显著(P<0.01)，下同
SundaraRao等把Ca
3(P O
4
)
2
作为磷源，经过
14d的摇瓶培养，发现几株芽胞杆菌属(B acillus s p.)释放的可溶性磷含量为70.5～156.80μg/ mL。Pr omod等发现海洋底泥中的磷细菌弧菌V ibrio s p和假单胞菌(Pseudo m onas s p)在它们的对数生长期间，可溶性磷的含量为0.50～0.55 mg/L。Craven等报道，分离自海藻(Zostera m ari2 na)根际的1株未经鉴定的溶磷细菌的可溶性磷含量高达300mg/L。赵小蓉等测定培养5d假单胞菌属溶解无机磷的量最高为109.1mg/L[5]。范丙全等测定溶磷草酸霉菌(Penicillium oxali2 cum)培养10d，溶解无机磷的量为194.2mg/ L[9]。试验分离得到解磷能力较强的磷细菌，可溶性磷含量为185.63mg/L，菌株解无机磷的能力较高，解有机磷的能力较差，从细菌的生长速度来看，无机磷细菌较快，有机磷细菌较慢。
2.3 溶磷能力与pH值的关系
相对于原培养液(未接种)pH值为7.00，接种溶磷菌后，培养液pH值下降，在5.12～6.67之间。说明细菌在培养过程中，能够分泌一些致酸物质，导致pH值下降，使难溶性磷溶解。图1为培养7d有效磷增
量与培养液pH值的相关分析
。
图1 细菌溶磷量与介质pH值的关系Fig.1 The relati on Capacity of diss olving Phos phorus and pH
综合分析10株溶磷菌培养7d，有效磷增量与培养液pH值之间的相关系性分析，培养介质pH降低对菌株溶磷虽有作用,pH值相近时，不同菌株溶解磷酸钙的差异较大。ypc3与ypc4培养液的pH值为6.56和6.57，溶磷量分别为11.68 mg/L和17.08mg/L;ypc2与ypc4培养液的pH 为6.67和6.57，溶磷量分别为17.63mg/L和17.08mg/L;pH与溶磷量之间没有线性关系，这一结果与赵小蓉的研究结果一致[5]。但有一些研究发现，许多溶磷菌的溶磷量与培养液的pH 值存在一定的相关性。这一现象说明这些菌株的
27 微 生 物 学 杂 志 27卷
溶磷作用可能不仅仅取决于培养液中质子的数量，也说明菌株的种类不同解磷机理不同，有的菌株的解磷机理是分泌有机酸,pH下降，这些菌株的溶磷能力与pH和有机酸的数量具有极高的相关性。另外的菌株可能存在其他的解磷机理，需要进一步研究和对菌株进行鉴定。
2.4 不同菌株分泌有机酸的数量及其种类
对解磷菌分泌有机酸的种类数量的测定结果见表3。有机酸对溶磷菌溶解难溶性磷有非常重要的作用，它伴随着溶磷菌的溶磷过程。不同溶磷菌产生不同种类的有机酸，有机酸含量因菌株不同而有差异，分析10菌株溶磷量与有机酸总量没有线性相关性，但是溶磷量升高伴随着pH 值下降和总有机酸含量升高，说明pH值下降和有机酸生成是溶磷菌溶磷的重要溶磷机理。
分泌有机酸是微生物溶磷的一主要原因[7,8]，杨秋忠等(1998)[15]发现3株固氮菌属A zotobacter s p.菌株溶解磷酸铁的能力，主要取决于所分泌的柠檬酸和丙二酸，而与培养介质的酸度和分泌的其他胞外物质无关。林启美等(2001)[11,12]发现溶磷量与所分泌的有机酸量之间不存在显著相关性。本研究中10株溶磷菌培养有机酸含量与溶磷量间不存在显著相关，王光华[10]等(2004)的有机酸含量与溶磷量之间呈显著线性关系，但其他处理则不然，可能与培养液中有机酸成分以及各成分所占地比例有关，佐证了有机酸种类对微生物溶磷的影响大于有机酸数量对其溶磷影响的报道[7,8]。
表3 不同菌株分泌有机酸的数量
Table3 The quality and kind of organic acids of different strains
有机酸/(μg・mL-1)
菌株编号有机酸总量/(μg・mL-1)酒石酸苹果酸乙酸柠檬酸丁二酸
wpc1 3.094- 2.442-- 5.536dC wpc2 4.637-- 3.899-8.536dC wpL1 4.199---- 4.199dC wpL2 5.443-- 1.772-7.215dC yp1L7.332- 5.094--12.426c BC ypL2--28.885 3.84715.56248.294a A ypL3--0.631 5.099 5.73dC ypc2 5.618-9.058--14.676cC ypc3-- 2.999 4.46315.42322.885bB ypc4-- 6.627-- 6.627dC
其中所分离到的解无机磷菌株均可以分泌酒石酸,wpc1还分泌乙酸,wpc2和wpL2还分泌柠檬酸，浓度达到3.899μg/mL和1.772μg/mL。解有机磷菌株均可分泌乙酸,ypL1和ypc2分泌酒石酸,ypL3还分泌柠檬酸,ypL2和ypc3还分泌柠檬酸和丁二酸。对于10个菌株的有机酸测定中，发现分泌酒石酸的浓度最高达到7.332μg/ mL，乙酸的最高浓度达到28.885μg/mL，柠檬酸浓度达到5.099μg/mL，丁二酸浓度达到15.562μg/mL。从有机酸总量来看ypL2与其他菌株差异显著(P>0.01);ypc3和yp1L差异不显著，与其他菌株差异显著(P>0.01)其余的菌株差异不显著,y pL2、y pc2和ypc3分泌有机酸能力较好。
低分子量有机酸(草酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乙酸)通过溶解、鳌合等作用均能明显地促进实验室合成的不同形态磷酸盆中磷素的释放，不同有机酸活化磷酸盐的能力依次为柠檬酸、草酸>酒石酸、苹果酸>乙酸。同一有机酸，浓度越大，对磷酸盐中磷素的活化能力越强[13,14]。
土壤微生物可以将难溶性磷转化为植物可以吸收利用的形态。土壤中接种溶磷菌，可以显著的改善作物的磷素营养，溶磷菌的溶磷作用与其代谢所产生的低分子量有机酸种类密切相关。不同的菌株产生的有机酸种类和浓度相差大，导致
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5期 席琳乔等：棉花根际解磷菌的解磷能力和分泌有机酸的初步测定
菌株之间在磷的活化能力方面差异很大。土壤与植物根际中有机酸浓度很低，有机酸对难溶性磷的活化作用决定于有机酸种类。草酸和柠檬酸对各种合成磷源的释磷效果最好[14]，因此，在研究溶磷菌过程中，应筛选产生草酸和柠檬酸量多的菌株，从而利用这些菌株研制成的生物菌剂能够很好的提高土壤磷的生物有效性。
3 讨 论
对具有解磷的菌株测定了菌株的溶磷能力，有效磷增量在4.04～185.63mg/L，其中wpL2溶磷量达到185.63mg/L。对培养液pH值进行测定,pH值都有下降趋势，降到到5.12～6.67，但是pH与溶磷量之间没有线性关系。对培养液的有机酸进行了测定，菌株溶磷量与总有机酸总量没有线性相关性。解无机磷菌株均可以分泌酒石酸,wpc1还分泌乙酸,wpc2和wpL2还分泌柠檬酸；解有机磷菌株均可分泌乙酸,ypL1和ypc2分泌酒石酸,ypL3分泌柠檬酸,ypL2和ypc3分泌柠檬酸和丁二酸。酒石酸的含量最高达到7.332μg/mL，乙酸达到28.885μg/mL，柠檬酸达到5.099μg/mL，丁二酸达到15.562μg/mL。wpL2、ypL2、ypc2和ypc3可以作为微生物肥料生产的优良菌株。
分泌有机酸是微生物代谢活动常见的现象，解磷细菌分有机酸，主要是酒石酸、丙二酸和乙酸；不同菌株之间分泌有机酸的数量和种类差别都非常大，其溶解磷矿粉的数量与培养液中有机酸总量之间都没有显著的相关性，与各种有机酸的相关性也非常弱，微生物由于外部环境和自身代谢发生变化，其解磷机理也可能发生变化。
研究所测定的有机酸都是残留的未与磷反应的部分，微生物在代谢过程中所分泌的有机酸，大部分与钙等离子结合形成沉淀或其它螯合物，这部分有机酸在离心或过滤时被去掉，没有被测定出来，所以，培养结束时培养液中的有机酸量，并不能完全反映微生物分泌的有机酸数量，这可能是溶磷量与有机酸之间不存在显著相关性的主要原因。
在细菌培养的过程中，测定有机酸的含量，必须保证培养基中不含有机酸，另外培养基中也不含能够与有机酸结合形成沉淀的金属离子，这样才可以真实的反应出细菌分泌有机酸的数量，特别是解磷菌的机理容易发生变化，因此，必须测定培养液中有机酸的动态变化。
对于解磷菌生长和繁殖都需要碳氮源，必须测定解磷菌的在不同的碳源、不同氮源条件下，分泌有机酸的数量、种类以及动态变化。另外，还需要研究解磷菌的代谢途径，特别是在碳氮源不足或匮乏的情况下的代谢途径。这样可能能够更为确切的研究清楚解磷菌的机理。
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