（荧光PCR法）
1.目的
规范解脲脲原体（UU）核酸DNA定量（PCR－荧光探针法）检测操作流程，准确进行解脲脲原体（UU）DNA定量分析。
2.应用范围
使用泰普生物科学(中国)有限公司解脲脲原体（UU）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行解脲脲原体（UU）DNA检测。
3.职责
由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。
4.内容
4.1 实验原理及其临床应用
采用聚合酶链式反应(PCR)及荧光标记探针技术，快速检测临床样品中解脲脲原体特有序列，从而判断解脲脲原体的存在。适用于对生殖道、尿道分泌物拭子样本中的解脲脲原体（UU）核酸进行体外定性检测，可用于解脲脲原体感染的辅助诊断及疗效监控。
4.2 标本采集
4.2.1 使用标本类型：生殖泌尿道分泌物等。
4.2.2 标本采集
4.2.2.1 生殖泌尿道分泌物
4.2.2.1.1 男性：用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌玻璃管中，密封送检（采集分泌物前2小时禁小便）。 4.2.2.1.2 女性生殖道：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置于无菌玻
璃管中，密封送检。
4.2.2.1.3 女性尿道：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌玻璃管中，密封送检。
4.2.3 标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送时应采用0℃冰壶。
4.3 试剂准备
4.3.1 供应商：泰普生物科学(中国)有限公司
4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰
箱-20℃。
4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。
4.4 标准品和质控品
4.4.1 标准品、质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。
4.4.2 标准品、质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。
4.4.3 标准曲线和质控频度：每次实验均需做标准曲线和质控。
4.5 操作过程说明
4.5.1 DNA提取
4.5.1.1 质控品处理：分别取出UU阴性、弱阳性、阳性质控品，8,000 rpm离心数秒，各吸50ul至1.5灭菌离心管中，加入50ul DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟。将处理好的质控品转至4℃静置10min,10000rpm离心5min,4℃保存备用。
4.5.1.2 生殖泌尿道分泌物棉拭子
4.5.1.2.1 向玻璃管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀，挤干棉拭子。
4.5.1.2.2 吸取全部液体转至1.5ml 离心管中，10,000 rpm离心5分钟。
4.5.1.2.3 去上清，向沉淀中加灭菌生理盐水1ml，混匀，10,000 rpm离心5分钟。
4.5.1.2.4 去上清，向沉淀中加入50ul DNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟，
将处理好的样本转至4℃静置10min,10000rpm离心5min,4℃保存备用。
4.5.2 加样: 从4℃冰箱取出处理好的样本、质控品和标准品转移至加样区，取上清液5ul加至PCR反应管进行PCR扩增。
4.5.3 Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析
4.5.3.1 打开计算机电源。
4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。打开电脑上的Mx3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现绿。如果不是绿而是红，软件会提示，这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。
4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，通常选择第一项“Quantitive PCR（Multiple Standards）”进行绝对定量分析。
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