01 HLA 简介
HLA（⼈类⽩细胞抗原，Human Leukocyte Antigen）由 6 号染⾊体上⼀类编码 MHC（主要组织相容性复合体，Major Histocompatibility Complex）基因⽣成。HLA 以⾼度的多态性成为⼈类重要的遗传标记，在免疫应答和调控中发挥着重要作⽤。HLA 等位基因的分类命名法由 WHO HLA系统命名委员会确定，数据库中已正式命名的 HLA-I 型（HLA-A、B、C）和 HLA-II 型（HLA-DRB、DQB1等）等位基因，已达到 31675个 (IMGT / HLA 数据库 2022.01)。 HLA 与许多⾃⾝免疫性和传染性疾病的敏感性和耐药性有关。近期有研究称 HLA-A*24 型⼈的 T 细胞对新冠病毒免疫反应更强[1]。HLA 配型相合程度，是器官、⾻髓和⼲细胞移植成功与否的关键因素。此外，肿瘤患者的 HLA 基因型以及肿瘤中的体系突变均有可能影响免疫的疗效。
图 1. HLA等位基因的分类命名法
02 HLA 的检测
尽管⼀代测序法是当前 HLA 分型的主要⽅法，已应⽤于 HLA 组织配型实验室和各临床医院，但通量低和耗时长是主要缺点。其次，⼀代测序分离杂合标本中的 HLA 等位基因序列也需要更为复杂昂贵的⽅式 才能实现。⼆代测序由于通量和速度的极⼤提升，单次分型即可完成产⽣全相的⾼分辨率 HLA 分型，因⽽迅速得到⼴泛应⽤。
基于探针杂交捕获的⼆代测序，可⾼通量、低成本的实现⾼分辨 HLA 分型。相较于基于 PCR 的靶标序列富集⽅式，杂交捕获对于序列多态性的⾼容忍度是⼀个突出的优势。但是在⾯对 HLA 这样的超⾼多态性靶标时，杂交捕获也可能会⼒有不逮。纳昂达针对这⼀挑战专门开发了多态性探针补充⽅案，以最少的探针数覆盖 HLA 数据库中的数万种 HLA 型别，保证各种型别都有错配数 ≤7 的探针可结合（图 2A）。如图 2B 所⽰，常规设计对杂合⼦⽂库的捕获效果不 佳，HLA-DQB1 中的部分位点多态性出现丢失情形。⽽经多态性补充后的探针，可顺利捕获两种等位基因。
图 2. 纳昂达多态性探针补充⽅案
HLAtyping Panel v1.0 【catalog: 1001622 (16 rxn)、1001621 (96 rxn)】是纳昂达针对 HLA 基因全部外显⼦区域多态性优化设计的⼀款 Panel，可保证等位基因的均衡捕获，从⽽⽀持更可靠的 HLA 分型结果。本⽂中，我们主要分享HLA 分型标准品测试和⽣信分析经验。
03 实验设计
HLA 分型的标准品为 UCLA Immunogenetics Center 的细胞系标准品 UCLA DNA Reference Panel，包含 24 种 Class I 和 12 种 Class II。HLAtyping Panel v1.0 靶向⼀系列 HLA 基因及免疫通路基因，覆盖基因组约 40 kb 区域。靶向捕获测序均在 Illumina 和 MGISEQ 双平台上进⾏，参考相应使⽤说明。涉及试剂见表 1。
表 1. 靶向捕获试剂信息
HLA-HD[2]、Athlates[3] 和OptiType[4] 软件应⽤于HLA分型的分析（表 2）。其中 HLA-HD 和 Athlates 可⽤于 HLA I 型和 II 型的分型, HLA-HD 可以⼀次性对所有 HLA I 型和 II 型进⾏分型鉴定，⽽ Athlates 每次只能对⼀种分型进⾏鉴定。OptiType 只能⽤于 HLA I 型分型且精度为 4 位。如⽆特别说明，三者使⽤的数据库版本均为 IPD-IMGT/HLA，版本号 3.37.0。
表 2. 分析软件列表
HLA I 型和 II 型的标准品构建的双平台⽂库经 HLAtyping Panel 捕获，覆盖区域的平均深度均 >500x，平均中靶率均
>75%（图3）。由于 HLA 区域的多态性和⾼复杂度，在评估捕获数据时，我们仅选取主要染⾊体进⾏基因组⽐对。如果把参考基因组补丁纳⼊范围，将导致“脱靶”率较⾼。但⽆论哪种⽅式，均不影响后续的 HLA 分型。
果把参考基因组补丁纳⼊范围，将导致“脱靶”率较⾼。但⽆论哪种⽅式，均不影响后续的 HLA 分型。
图 3. HLAtyping Panel双平台捕获结果
04 Illumina平台HLA分型表现
我们⾸先使⽤ HLA-HD、Athlates 和 OptiType 对 HLA 的 I 型和 II 型共计 12 个标准品分析，具体结果见表 3。HLA-HD 和 Athlates ⽐ OptiType 的 HLA I 型分型更加准确，两者仅在 A 基因的 24 个 allele 上错误分型 1 个位点，⽽ OptiType 则在 A 和 C 基因上分型错误了 2 个和 1 个位点。⽽ HLA 的 II 型分型的结果来看 HLA-HD 和 Athlates 各有优劣，HLA-HD 在 DRB3/4/5 基因上分型上错误了 4 个位点，⽽ Athlates 则在 DPB1 基因上效果不佳，错误了 3 个位点的分型。
表 3. 12个标准品的HLA分型结果
进⼀步分析 HLA-HD 分型不准确的原因，我们发现主要原因在于使⽤ IMGT 数据库版本的差异。以 HLA I 型的 C1-106样本为例，A 基因的⼀个 Allele 位点跟标准品的 HLA-A*02:01 不⼀致，⽽是 HLA-A*02:642。但当使⽤更早的 IMGT 数据库版本（3.32.0）分析时，HLA-HD 的分型的结果为 HLA-A*02:01:01，与标准品的分型相⼀致。实际上 HLA-A*02:642在 IMGT 3.37 版中属于 HLA-A*02:01:01G group，也就是说 HLA-A*02:642 分型是正确的，只不过由于 IMGT 数据库新增分型产⽣了命名差异。存在此现象的还包括 C2-104、C2-112 样品，具体分型结果和说明见表 4。
由于 HLA-HD 未过滤去除⽐对质量低且局部深度较低的读长，C2-106 样本被错误判定为杂合⼦，增加了HLA-
DRB5*01:20 分型。Athlates 可对 C2-106 样本进⾏正确的分型，不存在误判，也从侧⾯证明了这⼀点。
HLA-HD 和 Athlates 软件均将 C2-105 中 HLA-DQA1*05:01 分型为 HLA-DQA1*05:05:01，原因在于后者的匹配度更⾼。对于这⼀偏差，我们认为应当使⽤⼀代测序验证相应突变位点，再次判别。
表 4. HLA-HD的“错误”分型原因
05 MGI平台的HLA分型表现
我们使⽤ HLA-HD 和 Athlates 对 HLA I 型的 24 个标准品分析，具体结果见表 5 和 6。整体⽽⾔，HLA-HD ⽐ Athlates 的 HLA I 型分型更加准确，前者仅在 C 基因的 48 个 allele 上“错误”分型 2 个位点，⽽ Athlates 则在 A 和 C 基因上分型错误了 3 个和 4 个位点。但当使⽤更早的 IMGT 数据库版本（3.32）的时候，HLA-HD 的分型的结果与标准品参考分型完全⼀致。因此，在使⽤ NGS 进⾏ HLA 分型时，需考虑 IMGT 数据库更新的影响。
表 5. 24个标准品的HLA分型结果
表 6. HLA-HD的“错误”分型原因
06 结束语
NGS已经被证明可以有效减少 HLA 分型的不准确性和检测成本，同时还能检测 HLA 基因的全部信息。但⾯对⽇益增多的测序数据和不断更新的 IMGT/HLA 的数据库，如何从 NGS 数据中得到正确的 HLA 分型变得越来越重要。
当使⽤多态性优化设计的 HLAtyping Panel 进⾏双平台捕获测序时，不同分析软件下的 Call rate 均能达到 100%，36种 HLA 标准品合计 72 个 Allele 的分型准确率也在 98.5% 以上。即使平均测序深度低⾄ 50x 时，也依然可以达到上述指标，这表明捕获数据均⼀性较好，不存在因某些 HLA 基因缺失或捕获质量差，导致⽆法分型的情形。
尽管 HLA-HD 软件在 HLA 分型时表现更好，但依然存在错误分型的可能。与此同时 HLA 数据库的不同版本也对软件判断分型的结果带来了巨⼤的影响。因此，在实际应⽤中，应根据 HLA 变异数据库的特定⼈频率和单倍型频率进⾏校正，进⼀步提⾼分型准确率。
部分⼚商的全外显⼦Panel 基于参考标准基因组设计，从⽽忽略了HLA 区域的⾼度多态性。当未进⾏针对性探针补充时，真实样本的HLA 区域捕获效果会显著差于其它区域。⽽纳昂达推出的全外显⼦Panel 均已包含多态性优化设计的HLAtyping Panel，有助于实现 HLA 分型。
07 订购信息
关于纳昂达科技
纳昂达科技成⽴于 2011 年，秉承 “Nano Trans More ”的核⼼理念和 “靶向精准，⽤⼼服务诊断”的奋⽃宗旨，致⼒于为科研院校、医疗机构、临检单位、产业公司、测序服务商等提供专业化和⾼质量的靶向测序产品与闭环解决⽅案。
公司深耕精准靶向领域，⽬前拥有MGI 和Illumina 双测序平台多款⽂库构建试剂盒和全套液相杂交试剂产品。明星产品还包括全外显⼦ Panel、泛实体瘤和⾎液肿瘤 Panel 以及呼吸道病毒 Panel 等，并提供全⾯完善的双平台捕获探针定制化服务。
⾯积 > 2,000 平⽶的⾼通量测序研发中⼼和 > 2,500平⽶的GMP级别（YY/T0287-2017idt ISO13485:2016）体外诊断试剂⽣产基地为产品创新与⽣产质量保驾护航。纳昂达的销售⽹络覆盖全国并已外延⾄海外地区。
公司将与客户共成长，对客户的需求全⼒以赴，为全球⽤户提供靶向测序解决⽅案和 IVD 试剂原料。
参考⽂献：
[2] Kawaguchi S, Higasa K, Shimizu M, et al. HLA‐HD: An accurate HLA typing algorithm for next‐generation sequencing data[J]. Human mutation, 2017, 38(7): 788-797.
[3] Liu C, Yang X. Using exome and amplicon-based sequencing data for high-resolution HLA typing with ATHLATES[M]//HLA Typing. Humana Press, New York, NY, 2018: 203-213.
[4] Szolek A, Schubert B, Mohr C, et al. OptiType: precision HLA typing from next-generation sequencing data[J]. Bioinformatics, 2014, 30(23): 3310-3316.
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