一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法及试剂包

本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法。本发明还涉及一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定用试剂包。

ABO血型系统是目前已知的39个红细胞血型系统中最具临床意义的血型系统，对ABO血型抗原系统进行准确分型和诊断可以明确个体血型基因型。

ABO血型系统基因定位于9号染体，基因组全长19514b，(未计算5’UTR和3’UTR区域)，由7个外显子和6个内含子组成。目前ABO血型系统基因分型技术有PCR-SSP、PCR-SSO、PCR-SBT、实时荧光PCR技术、基因芯片等。上述方法中除PCR-SBT方法外，其他几种方法是基于已知的多态性位点进行设计，测定的碱基序列范围有限；尽管PCR-SBT方法克服了上述缺陷，但是该方法也仅仅是对编码区序列进行检测，加之操作过程繁琐，难以实现高通量检测。研究发现ABO亚型标本的突变点或其形成机制涉及的序列范围广，需覆盖ABO全长序列的范围才能鉴别出亚型，明确可能形成的机制，然而现有的分子诊断方法难以满足该类需求。因此，从血液安全的角度，迫切需要建立ABO血型系统基因全长序列测定的方法，实现对所有样本ABO血型的精准鉴定和科学研究。

新一代测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)采用并行测序的理念，可以同时对多个样本多个目标区域进行高通量测序分析，可实现对基因全长序列的测定分析。建立一种基于NGS技术的ABO血型基因高通量检测方法，可以实现ABO全长序列测定，获取ABO基因全长多态性特征，对于提升ABO血型分型的准确性有重要意义。

针对现有ABO基因分型技术的缺陷，本发明的第一个目的在于提供了一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，以覆盖ABO外显子和内含子全部序列，并对ABO基因全长序列进行测序分析，获得ABO基因全长序列的多态性特征，为解决ABO血型标本的鉴定提供一种全新的方法。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法，其特征在于：所述方法对ABO基因全长序列包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子序列进行长片段PCR扩增、扩增产物文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析，并包括以下步骤：

(1)针对ABO基因序列的特异性，设计并合成长片段PCR扩增引物；

(2)制备人基因组DNA；

(3)分两组PCR反应扩增人基因组DNA中ABO基因包括5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子和全部内含子区域序列；

(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行磁珠法纯化；

(5)通过Qubit DNA双链定量测定试剂将步骤(4)得到的两组纯化产物进行准确定量分析，并将两组纯化产物进行等摩尔混合；

(6)将步骤(5)得到的等摩尔混合产物进行文库制备，包括扩增产物采用转座子酶法片段化、片段化产物磁珠法纯化、Index序列扩增和文库扩增后片段选择；

(7)将步骤(6)获得的文库通过Aligent 4200电泳仪进行质量检测，分析文库的片段大小，并通过Qubit DNA双链定量测定试剂准确定量后进行文库混合；

(8)采用Illumina测序试剂，将步骤(7)获得的混合文库进行Illumina Miseq平台测序上机；

(9)将步骤(8)得到的FASTQ原始数据，采用CLC Main Workbench 12.0software专用软件进行生物信息学分析，指定个体ABO基因型。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

作为本发明的优选技术方案：所述步骤(1)中长片段PCR扩增引物序列分别为：

ABO基因5’UTR部分区域、第1号外显子至第1号内含子的扩增引物：

ABO1longF 5'-GCTTCCAGCTTTTGGCTATG-3'

ABO1longR 5'-GTGACCACGGAGCGATTTAT-3'

ABO基因第1号内含子至第7号外显子的扩增引物：

ABOe27longF 5'-GGATTAACAATGGCGTGCTT-3'

ABOe27longR 5'-GGACGGACAAAGGAAACAGA-3'。

作为本发明的优选技术方案：所述步骤(3)中两组PCR反应体系包括：

第1组扩增ABO基因5’UTR部分区域、第1号外显子至第1号内含子的反应体系：5×GLX PCR缓冲液5.0μl；2.5mM dNTP 2.0μl；引物浓度25μM，ABO1 longF和ABO1 longR各0.2μl；1.25U/μl GLX-Taq酶0.5μl；50-100ng/μl DNA 4.0μl；以H2O 13.1μl补足至25μl，其中：ABO1 longF的序列为GCTTCCAGCTTTTGGCTATG，ABO1 longR的序列为GTGACCACGGAGCGATTTAT；

第2组扩增ABO基因第1号内含子至第7号外显子的反应体系：5×GLX PCR缓冲液5.0μl；2.5mM dNTP 2.0μl；引物浓度25μM，ABOe27longF和ABOe27longR各0.2μl；1.25U/μlGLX-Taq酶0.5μl；50-100ng/μl DNA 4.0μl；以H2O 13.1μl补足至25μl；其中：ABOe27longF的序列为GGATTAACAATGGCGTGCTT，ABOe27longR的序列为GGACGGACAAAGGAAACAGA。

作为本发明的优选技术方案：所述步骤(3)中两组PCR反应程序均为：

94℃预变性1min，98℃变性10s，68℃退火加延伸10min，30个循环，68℃延伸10min，然后冷却至12℃。

作为本发明的优选技术方案：所述步骤(4)中磁珠法纯化所需的磁珠为 XP磁珠。

作为本发明的优选技术方案：所述步骤(5)中Qubit DNA双链定量试剂为QubitdsDNA高灵敏分析试剂。

作为本发明的优选技术方案：所述步骤(6)中文库制备试剂为TransNGS Tn5 DNAlibrary prep kit for Illumina和TransNGS Tn5 Index Kit for Illumina，TransNGSTn5 DNA library prep kit for Illumina的规格为for 50ng DNA。

作为本发明的优选技术方案：所述步骤(7)中文库质量检测试剂为HighSensitivity D1000电泳试剂。

作为本发明的优选技术方案：所述步骤(8)中Illumina测序试剂为MiSeqSequencing Reagent Kit，其规格为v2,300cycles。

作为本发明的优选技术方案：所述步骤(9)中生物信息学分析软件为CLC MainWorkbench 12.0software。

本发明还有一个目的在于，提供一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定的试剂。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定用试剂包，所述试剂包包括用于扩增ABO基因5’UTR部分区域、第1号外显子至第7号外显子的4条PCR扩增引物、用于文库制备的试剂和用于测序上机的试剂；

所述PCR扩增引物序列分别为：

ABO基因5’UTR部分区域、第1号外显子至第1号内含子的扩增引物：

ABO1longF 5'-GCTTCCAGCTTTTGGCTATG-3'

ABO1longR 5'-GTGACCACGGAGCGATTTAT-3'

ABO基因第1号内含子至第7号外显子的扩增引物：

ABOe27longF 5'-GGATTAACAATGGCGTGCTT-3'

ABOe27longR 5'-GGACGGACAAAGGAAACAGA-3'

所述文库制备的试剂为： XP磁珠、Qubit dsDNA高灵敏分析试剂、TransNGS Tn5 DNA library prep kit for Illumina和TransNGS Tn5 Index Kitfor Illumina，其中：TransNGS Tn5 DNA library prep kit for Illumina的规格为for50ng DNA；

所述测序上机的试剂为：MiSeq Sequencing Reagent Kit，其规格为v2,300cycles。

与现有技术相比，本发明的创新点和积极效果是：

(1)本发明中4条扩增引物序列均避开突变点，以免因为等位基因的漏检而导致分型错误。ABO基因包括7个外显子和6个内含子，全长19514bp。本发明采取分段重叠扩增的策略，将全长序列分为2组进行扩增，由于第1内含子序列较长约12kb，因此我们在第1内含子中采用两条引物序列，分别扩增了5’UTR部分区域和第1号外显子至第1号内含子末端的片段、第1号内含子至第7外显子下游的3’UTR的片段，通过2对扩增引物实现了ABO基因全长序列的扩增，第一个扩增片段长度约12.8kb，第二个扩增片段约8.7kb，两个片段有近450bp的重复，这种重叠扩增可以保证ABO基因全长的有效拼接。

(2)本发明建立了NGS技术平台实现对ABO基因全长的测序分析，该方法中扩增产物纯化、纯化产物等摩尔混合、文库的片段选择以及文库混合均可在自动化平台完成，具有高通量、快速、准确的特点。此外，该方法可以获得了ABO基因全长序列多态性特征，实现对样本ABO基因的精确分型。随着新一代测序平台的普及，NGS技术广泛应用于临床检测中，如ABO疑难血型的鉴定、造血干细胞移植前HLA、KIR测序分型等，获得的所有ABO基因全长序列精确信息在疑难血型基因分型、基因多态性检测、频率调查分析等方面的应用将会受到广泛重视。

(3)本发明所提供的方法可作为一种全新的ABO血型系统基因鉴定的方法，可以用于ABO基因的精准分型，发挥NGS方法对ABO基因分型大规模、高通量检测的优势，在输血医学研究和遗传学等领域的应用受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

图1为本发明对个体ABO基因分组PCR扩增的电泳图谱，M为DNA分子MarkerDL15000 bp。

图2为本发明中对个体ABO基因扩增产物制备文库的质量检测图谱；

图3a和3b的拼接为本发明中基于NGS技术的个体ABO基因全序列测序整体图谱；

图4为本发明中基于NGS技术的个体ABO基因全序列测序的包含起始序列位置的部分图谱；

图5为本发明中基于NGS技术的个体ABO基因全序列测序的包含终止序列位置的部分图谱。

以下结合实施例对本发明的内容作进一步详细说明。

本实施具体以献血者的血液为检测样本进行人类红细胞血型ABO基因分型为例对本发明内容做详细说明。

本发明的NGS方法包括以下步骤：

1、合成4条扩增引物

具体引物序列见发明内容和序列表中的基因序列，此处不再赘述，将扩增引物用纯水稀释至25μM。

2、制备标本基因组DNA，作为后续步骤的PCR扩增模板

取待检全血200μl，按照MagDNA Pure LC DNA Isolation Kit试剂盒说明书提取基因组DNA，并测定基因组DNA的浓度和纯度。本方案后续步骤以94个标本为例(实际工作中可根据测序芯片选择的情况调整标本数量)。

3、2组PCR扩增引物同时扩增ABO基因第1号外显子至第7号外显子

准备GXL-Taq酶(TaKaRa)、5×GXL buffer、dNTP(TaKaRa)、纯水，与步骤2所制备的基因组DNA模板，每个样本按表1所述体系配制2组PCR扩增体系。

表1

PCR扩增体系 1组(μl) 2组(μl) 5×GXL buffer 5.0 5.0 dNTP(2.5mM) 2.0 2.0 引物1 ABO1longF 0.2 ABO27longF 0.2 引物2 ABO1longR 0.2 ABO27longR 0.2 GXL-Taq酶(1.25U/μl) 0.5 0.5 DNA模板(50-100ng/μl) 4.0 4.0 H₂O 13.1 13.1 总体系 25 25

上表中，第1组PCR扩增ABO基因5’UTR部分区域、第1号外显子至第1号内含子(扩增片段长度为12.8kb)，第2组PCR扩增ABO基因第1号内含子至7号外显子下游3’UTR序列(扩增片段长度为8.7kb)。

用PCR仪(ABI9700)按以下程序扩增：

两组PCR反应程序均为：94℃预变性1min，98℃变性10s、68℃退火加延伸10min，30个循环，68℃延伸10min，然后冷却至12℃。PCR扩增产物的电泳结果如图1所示，图1为本发明检测2例样本的ABO基因PCR扩增的电泳图谱。从左到右，第1-2孔为2例DNA样本第1组引物PCR扩增产物，产物为ABO基因上游5’UTR部分区域至第1号内含子末端片段(扩增片段长度为12.8kb)、3-4孔为第2组引物PCR扩增产物，产物为ABO基因第1号内含子末端至7号外显子下游3’UTR序列(扩增片段长度为8.7kb)。第5孔为为DNA分子Marker DL 15000bp；

4、扩增产物磁珠法纯化

采用Agencourt AMPure XP磁珠对两组PCR扩增产物分别进行纯化。简要说明如下：96孔PCR扩增板上每孔加入12μl Agencourt AMPure XP试剂，振荡混匀后室温放置5分钟，将96孔PCR扩增板放置磁力架上直到溶液变清亮，弃去上清，每孔加入新鲜配制80％的酒精150μl洗两次，待酒精挥发完全后，每孔加入27μl TE溶液进行磁珠溶解，室温放置5分钟后放置磁力架上直到溶液变清亮，最后每孔吸取25μl上清至新的96孔PCR扩增板上。

5、纯化后产物准确定量后等摩尔混合

将纯化后的两组PCR扩增产物采用Qubit dsDNA高灵敏分析试剂盒分别进行定量，定量后两组PCR扩增产物按照总量为50ng进行等摩尔混合。

6、采用转座子酶的方法进行文库制备

采用TransNGS Tn5 DNA library prep kit for Illumina试剂对起始量为50ng的混合产物进行文库制备，严格按照说明书进行操作，通过Tn5转座子酶对产物进行片段化，片段化产物采用磁珠法进行纯化，操作同步骤4。采用TransNGS LibraryAmplification SuperMix试剂对纯化后产物进行Index序列扩增，每孔加入N5和N7两个不同的标签序列，一般控制在7个循环。最后利用不同浓度的磁珠对扩增后文库进行片段选择，其分选片段长度主峰控制在400-500bp。

7、获得的文库通过Aligent 4200电泳仪进行质量检测

将步骤6获得的文库采用High Sensitivity D1000电泳试剂，Aligent 4200电泳仪进行电泳，分析分选片段大小，其分选片段长度主峰为400bp左右，如图2所示。图2为个体ABO基因扩增产物文库制备后的质量检测图谱，从下往上，第一个峰为小分子片段(lowermarker)，中间第二个峰为目前片段，第三个峰为大分子片段(upper marker)。目的片段长度主峰为400bp左右，即筛选获得的大部分片段长度位于400bp左右，符合文库制备所需的片段大小要求。

8、混合文库定量后进行Illumina Miseq平台测序上机

将步骤6获得的文库进行Qubit定量后，取94个样本中浓度最低的值作为目标稀释值，取每个样本总量为14μl,计算出每个样本量及加TE溶液量，把94个样本混合为一管，计算最终文库的摩尔浓度，调整文库浓度为4nM，通过0.2N NaOH将双链文库变性为单链文库，最后利用4℃预冷的HT1将文库的上机浓度调整为20pM加入MiSeq Reagent Kit v2试剂盒的样品孔进行上机测序。

9、生物信息学分析

将导出的FASTQ原始数据，采用CLC Main Workbench 12.0software专用软件进行分析，根据测序数据质量评价，去掉质量低的序列和重复序列，将所有有效读长(reads)依据ABO基因标准序列进行拼接，然后对拼接序列进行重排，最后对测定序列的多态性进行分析。根据ABO基因多态性情况和参照ABO等位基因标准序列指定个体ABO基因型。由于数据信息量太大，将完整的测序图谱拆分为图3a和图3b两张图，图3a的顶部与图3b的底部拼接，即可以形成完整的测序图谱，如图3a和3b所示，通过软件分析，与标准参考序列A101比对，该发明可获得样本ABO基因的全长序列。图中NG_006669ABO GENOMIC(A101)为序列比对的标准参考序列，consensus-为所测序列与参考序列的一致性，consensus-下面的数字为片段测序的深度，coverage为所测片度的覆盖度。由于数据信息量太大，无法用图谱展示所有序列具体图谱，因此，仅展示图4、图5为样本ABO基因的起始密码子ATG位置图谱与终止密码子TGA位置图谱。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改、等同替换、改进等，都落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江省血液中心

<120> 一种基于NGS技术的ABO基因全长序列测定方法及试剂包

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcttccagct tttggctatg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgaccacgg agcgatttat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggattaacaa tggcgtgctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggacggacaa aggaaacaga 20