一种蛋白激酶的活性检测方法及其抑制剂筛选方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种RIP3蛋白激酶的活性检测方 法以及RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法。

受体相互作用蛋白家族(receptor-interacting proteins，RIPs)是蛋白激酶家 族的一个重要分支，其功能上具有特异的丝氨酸(Ser)/苏氨酸(Thr)激酶活性， 属于Ser/Thr蛋白激酶家族。，目前用于蛋白激酶活性检测的方法主要包括以 下几类：

1.基于抗原抗体原理的ELISA方法，通过用蛋白激酶底物包被多孔板 板底，加入激酶及反应液反应后，分别用针对磷酸化底物的抗体（一抗）以 及针对一抗的抗体（二抗）进行孵育，通过化学发光等方式检测激酶催化底 物磷酸化的程度，从而评价其活性并用于抑制剂筛选。但受蛋白纯化程度以 及底物自身磷酸化影响，无法排除非特异性磷酸化的干扰，影响激酶活性检 测和抑制剂活性检测的准确性。此外该方法价格昂贵、耗时长、操作步骤多， 制约了化合物的高通量筛选。

2.放射性同位素标记法，蛋白激酶可催化P32标记的ATP反应从而将 P32基团转移到底物对其进行标记，通过放射自显影检测底物被P32标记的程 度评价酶活及抑制剂对酶促反应的抑制程度。该方法特异性程度高，但缺点 显著，包括对研究场所有严格限制，易造成环境污染，对研究者健康有潜在 危害，且难以实现抑制剂的高通量筛选。

该方法是目前用于RIP3（受体相互作用蛋白-3）酶活检测及抑制剂筛选 的唯一方法。具体方法为从Jurkat细胞裂解液中用免疫沉淀法得到RIP3蛋 白，在反应液中和10μCi[32P]γ-ATP和5μg MBP在30℃孵育30分钟，随 后进行放射自显影。反应液成分为：20mM HEPES[pH7.5]，2mM DTT，1 mM NaF，1mM Na3VO4，20mMβ-glycerophosphate，20mM MgCl2，20 mM MnCl2，1mM EDTA，300μM ATP。

3.ATP消耗法，该方法主要包括两步反应，第一步反应是蛋白激酶催化 酶促反应消耗反应体系中的ATP用于磷酸化底物，该反应中部分ATP被转 化为ADP；第二步反应是利用荧光素酶消耗特定激酶酶促反应后剩余的ATP 氧化荧光素氧同时发出荧光。其作用原理如图1所示，将一定量的特定蛋白 激酶与底物置于反应缓冲液中，加入ATP后在一定条件下进行酶促反应，反 应一定时间后，终止激酶反应并启动荧光素酶消耗ATP的氧化反应以释放荧 光。在一定范围内酶促反应后ATP剩余量与荧光强度成线性正相关，而特定 激酶催化的酶促反应程度又与ATP剩余量成线性负相关。若荧光强度强，表 明激酶催化反应后体系中剩余ATP多，说明酶促反应消耗掉的ATP较少， 酶促反应程度弱。若荧光强度弱，表明激酶催化反应后体系中剩余ATP少， 说明酶促反应消耗ATP多，酶促反应程度强。因而荧光强度与酶促反应成线 性负相关，可通过检测荧光强度来评价酶促反应的程度。但由于蛋白纯化过 程中无法避免的会有非特异性蛋白残留，会在酶促反应中引入非特异性的 ATP消耗，影响激酶活性检测和抑制剂活性检测的准确性和精确性。

ATP消耗法被用于多种激酶检测，但目前针对RIP3蛋白(受体相互作用 蛋白-3)仍有以下问题未解决：1.RIP3蛋白属于RIP蛋白家族，为丝苏氨酸 激酶，与其它家族丝苏氨酸激酶相比，一级结构具有显著差异，并且目前晶 体结构未知。除放射性同位素法外，至今尚无其它酶活检测方法报道；2.ATP 消耗法方法本身存在一定局限性，如蛋白纯化过程中无法避免的会有非特异 性蛋白残留，会在酶促反应中引入非特异性的ATP消耗，此外包括底物浓度、 ATP浓度、反应温度、反应时间等因素，均会影响目标蛋白酶活，因而无法 直接用于抑制剂筛选；3.目前尚未发现针对RIP3的抑制剂。

因此，本发明所要解决的技术问题是针对目前RIP3蛋白激酶活检测方 法较为局限，ATP消耗法方法无法直接用于RIP3蛋白激酶抑制剂筛选的问 题，提供了一种RIP3蛋白激酶活性检测方法，一种RIP3蛋白激酶抑制剂的 筛选方法以及一种筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之一为：一种RIP3蛋白 激酶抑制剂的筛选方法，其中所述筛选方法包括以下步骤：

（1）配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6.5～7.0，在该反应 缓冲液中加入RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，待测RIP3蛋白激酶抑制 剂，之后加入ATP，从而配制成反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性 蛋白浓度为15ng/μl～30ng/μl，RIP3蛋白激酶浓度为5U/μl，ATP浓度为 10μM～20μM，震荡或静置条件下进行反应，反应温度为20℃～30℃，反应 时间为60～90分钟；

（2）检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓 度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率。

其中步骤（1）所述反应缓冲液的组分更佳地为：3-(N-吗啉基）丙磺酸 5mM～10mM，MgCl22.5mM～5mM，MnCl22.5mM～5mM，EDTA0.4mM～ 1mM，EGTA0.4mM～1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM～5mM和二硫苏糖醇 0.02mM～0.1mM；较佳地为：3-(N-吗啉基）丙磺酸10mM，MgCl25mM， MnCl22.5mM，EDTA0.4mM，EGTA1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM，二硫 苏糖醇0.05mM，所述反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白的浓度更佳地为30 ng/μl，ATP的浓度更佳地为10μM。

其中步骤（1）所述反应体系溶液pH更佳地为7.0，反应温度更佳地为 25℃，震荡速度较佳地为50～100RPM，更佳地为100RPM，反应时间更佳 地为75分钟。

其中步骤（2）所述检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度的方 法为本领域常规方法，较佳地为利用荧光信号进行检测。所述的方法较佳地 包括以下步骤：向步骤（1）所得反应体系溶液中加入荧光素和荧光素酶并 检测发光信号。该检测方法可以利用各种市售荧光检测试剂盒检测，所述荧 光检测试剂盒较佳地为Promega公司的Kinase-Glo荧光检测试剂盒。根据所 得发光值计算特异性反应率，所得特异性反应率%=（无MBP时的发光值- 有MBP时的发光值）/无MBP时的发光值×100%。

步骤（2）所述根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率的 方法较佳地包括以下步骤：反应结束后将加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的 加药组特异性反应率与未加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的空白组特异性反 应率相比较，待测RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率%=（空白组特异性反应率 -加药组特异性反应率）/空白组特异性反应率×100%。

为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之二为：一种筛选RIP3 蛋白激酶抑制剂的试剂盒，其中所述试剂盒包括RIP3蛋白激酶、髓鞘碱性 蛋白、反应缓冲液、ATP、荧光素和荧光素酶。

其中所述反应缓冲液较佳地包括以下组分：3-(N-吗啉基）丙磺酸10mM， MgCl25mM，MnCl22.5mM，EDTA0.4mM，EGTA1mM，β-丙三醇-磷酸盐 2.5mM，二硫苏糖醇0.05mM，所述反应缓冲液pH较佳地为7.0。筛选RIP3 蛋白激酶抑制剂时，在缓冲液中加入RIP3蛋白激酶、髓鞘碱性蛋白和待测 RIP3蛋白酶抑制剂，之后加入ATP，从而制备反应溶液体系，该反应溶液 体系中ATP的浓度较佳地为10μM，髓鞘碱性蛋白的浓度较佳地为30ng/μl， RIP3蛋白激酶的浓度较佳地为5U/μl，25℃摇床反应75min后加入荧光素 和荧光素酶并检测发光值。发光值的检测方法为：利用各种市售荧光检测试 剂盒检测，所述荧光检测试剂盒较佳地为Promega公司的Kinase-Glo荧光检 测试剂盒，检测方法具体请参见该试剂盒的说明书内容。

特异性反应率的检测方法为：反应结束后将加入髓鞘碱性蛋白的反应组 发光值与未加入髓鞘碱性蛋白的空白组发光值相比较，特异性反应率=（空 白组发光值-反应组发光值）/空白组发光值×100%。

待测RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率的计算方法较佳地为：将加入待测 RIP3蛋白激酶抑制剂的加药组特异性反应率与未加入待测RIP3蛋白激酶抑 制剂的空白组特异性反应率相比较，待测RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率%= （空白组特异性反应率-加药组特异性反应率）/空白组特异性反应率× 100%。

为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之三为：一种RIP3蛋白 激酶活性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

（1）配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6.5～7.0，在该反应 缓冲液中加入待测RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，之后加入ATP，从而 配制成反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/μl～ 30ng/μl，ATP浓度为10μM～20μM，震荡或静置条件下进行反应，反应温度 为20℃～30℃，反应时间为60～90分钟；

（2）检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓 度计算RIP3蛋白激酶的活性。

步骤（1）所述反应缓冲液的组分更佳地为：3-(N-吗啉基）丙磺酸5mM～ 10mM，MgCl22.5mM～5mM，MnCl22.5mM～5mM，EDTA0.4mM～1mM， EGTA0.4mM～1mM，β-丙三醇-磷酸盐2.5mM～5mM和二硫苏糖醇 0.02mM～0.1mM。

其中步骤（2）所述检测步骤（1）所得反应体系溶液中ATP的浓度的方 法为本领域常规方法，较佳地为利用荧光信号检测ATP浓度。所述的方法较 佳地包括以下步骤：向步骤（1）所得反应体系溶液中加入荧光素和荧光素 酶，检测发光信号。该检测方法可以利用各种市售荧光检测试剂盒检测，所 述荧光检测试剂盒较佳地为Promega公司的Kinase-Glo荧光检测试剂盒，具 体步骤请参见该试剂盒的说明书。

步骤（2）所述根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶的活性的方法包括 以下步骤：反应结束后将加入髓鞘碱性蛋白的反应组发光值与未加入髓鞘碱 性蛋白的空白组发光值相比较，反映RIP3蛋白激酶活性的特异性反应率= （空白组发光值-反应组发光值）/空白组发光值×100%。

为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之四为：威罗菲尼或索拉 菲尼在制备RIP3蛋白激酶抑制剂中的用途。

其中所述威罗菲尼（Vemurafenib）的制备方法为本领域常规方法，或者 市售可得。

其中所述索拉菲尼的化学名为：4-{4-[3-（4-氯-3-三氟甲基-苯基）-酰脲]- 苯氧基}-吡啶-2-羧酸甲胺-4-甲苯磺酸盐。其分子式为：C21H16ClF3N4O3 分子量为：464.8249496，所述索拉菲尼的制备方法为本领域常规方法，或者 市售可得。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发 明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明所述筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的 方法具有无污染、安全性高、灵敏度高、通量高而且简便易操作的优点，本 发明所述RIP3蛋白激酶活性的检测方法具有特异性强，灵敏度高，信号检 出率高的优点。

与放射性同位素法相比，本发明所述筛选方法的优点在于：1.显而易见 的无污染性和高安全性。2.高通量，能够使用384孔微孔板筛选RIP3抑制 剂，单人人工操作2h内可实现300个化合物以上的筛选通量，而同等条件 下放射性同位素法化合物筛选量少于60个。

利用本发明所述RIP3蛋白激酶抑制剂筛选方法和试剂盒，筛选出索拉 菲尼和威罗菲尼具有很强的RIP3蛋白激酶抑制活性，可以用于制备RIP3蛋 白激酶抑制剂。

图1为ATP消耗法反应原理示意图。

图2为RIP3重组蛋白纯化的各组分SDS-PAGE检测结果示意图。其中 泳道a为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液；b为杆状病毒感染的Sf9 细胞的全细胞裂解液离心所得上清；c为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞 裂解液离心所得沉淀；d、e、f为清洗缓冲液；g、h、i为溶解缓冲液；M为 Marker。

图3为RIP3重组蛋白特异性抗体检测结果示意图。其中泳道a和c为 同一克隆表达的RIP3蛋白激酶和GST融合蛋白的western结果，泳道b和 d为另一克隆表达的RIP3蛋白激酶和GST融合蛋白的western结果。

图4为不同用量的RIP3重组蛋白进行反应所测得发光值检测结果示意 图。

图5为不同浓度的ATP进行反应发光值检测结果示意图。

图6为不同温度下进行反应发光值检测结果示意图。

图7为不同时间检测反应进行程度与特异性反应率检测结果示意图。

图8为不同pH值检测反应进行程度与特异性反应率检测结果示意图。

图9为不同化合物对RIP3抑制作用的检测结果示意图。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在 所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常 规方法和条件，或按照商品说明书选择。

主要实验材料和试剂：

质粒

RIP3全长cDNA载体质粒为pGEM-T，购自北京义翘神州生物技术有 限公司（货号HG11267-G）。PfastBac-GST表达载体购自Invitrogen公司， 该载体带有GST-Tag编码序列，编码产物位于融合蛋白N端。

菌种和细胞

大肠杆菌DH5α、大肠杆菌DH10Bac以及Spodoptera frugiperda9(sf9) 昆虫细胞均购自Invitrogen公司；

DNA引物由Invitrogen公司合成；

髓鞘碱性蛋白（MBP蛋白）、Bacmid抽提试剂盒（PureLinkTMHiPure  Plasmid DNA Miniprep Kit），IPTG，Glutathione，Bluo-gal，以及转染试剂 CELLFECTINTM购自Invitrogen公司；

DNA聚合酶（KOD–Plus）购自Toyobo公司；

质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶电泳DNA片段回收试剂盒和PCR产物纯 化试剂盒购自QIAGEN公司；

限制性内切酶Sal I-HF及Hind III购自New England Biolabs公司；

连接酶DNA Ligation Kit购自Takara公司；

蛋白定量试剂盒GST tag ELISA Detection Kit购自Genescript公司；

TMN-FH培养基、酵母浸出膏（Yeast Extract）、胰蛋白胨（Tryptone） 购自Sigma-Aldrich公司；

anti-RIP3抗体购自R&D公司（货号MAB7604）；

anti-GST抗体购自Santa Cruz Biotech公司；

Glutathione Sepharose4B购自GE Healthcare公司；

Pierce ECL Western Blotting Substrate试剂（购自Thermo公司）；

MOPS，MnCl2，MgCl2，EDTA，EGTA，β-glycerol-phosphate，DTT （二硫苏糖醇）等普通分析纯化学试剂购自百灵威公司。

主要实验仪器

4℃高速离心机Centrifuge5810R（Eppendorf公司）；

PCR反应仪Mastercycler nexus X1（Eppendorf公司）；

紫外凝胶成像系统GelVue UV Transilluminator（Syngene公司）；

蛋白垂直电泳装置Mini-PROTEAN3Cell（Bio-Rad公司）；

微孔板（White Opaque384-well MicroPlate，PerkinElmer公司）；

微孔板酶标仪SpectraMax340PC384（Molecular Device公司）；

Envision多标记微孔板检测仪（2104Multilabel Reader，
PerkinElmer公司）。

实施例1RIP3重组蛋白的表达和检测以及RIP3蛋白激酶活性检测实 验条件优化

1、RIP3重组蛋白的表达和检测

以pGEM-T-RIP3质粒为模板，扩增RIP3的cDNA全长片段，使用引物 序列如下：

正向引物：5’-TACGTCGACTATGTCGTGCGTCAAGTTATG-3’(下划线 部分为Sal I-HF酶切位点)，其序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；

反向引物：5’-GACAAGCTTTTATTTCCCGCTATGATTATACC-3’(下划 线部分为Hind III酶切位点)，其序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

用KOD-Plus多聚酶进行PCR反应；

PCR反应体系为（50μl）：10×KOD-Plus-缓冲液5μl，2mM dNTP加5 μl，25mM MgSO4加2μl，10μM正向引物1.5μl，10μM反向引物1.5μl， 质粒模板50ng，KOD-Plus DNA聚合酶1μl，ddH2O加38μl。

PCR反应程序为：

（1）94℃，2min（2）94℃，15sec，（3）60℃，30sec，（4）68℃， 1.5min，步骤（2）～（4）重复30个循环，（3）72℃，5min。反应产物 经过纯化后用内切酶Sal I-HF和Hind III进行双酶切，37℃反应2h，反应体 系为：

10×NEB缓冲液2 2μl

Hind III 1μl

Sal I-HF 1μl

PCR产物 16μl

ddH 2O -

pFastBac GST载体质粒用限制性内切酶Sal I-HF和Hind III进行双酶切， 37℃反应2h，反应体系为：

10×NEB缓冲液2 2μl

Hind III 1μl

Sal I-HF 1μl

质粒 2μl

ddH 2O 14μl

采用DNA Ligation Kit连接线性质粒片段和PCR产物片段（反应体系包 含5μl Solution I，4μl PCR酶切产物和1μl质粒酶切产物），16℃连接40min。

将10μl连接产物加入100μl DH5α菌株的感受态细胞，冰浴30min，42℃ 热激60s，冰浴2min，加入500μl无抗生素的LB培养液，37℃摇床150 rpm/min，40min后涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基上。37℃过夜，挑 选克隆菌落并测序，获得序列正确的pFastBac GST-RIP3重组质粒。

取2μl测序正确的pFastBac GST-RIP3重组质粒加入50μl DH10Bac感 受态细胞，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入500μl无抗生素的 LB培养液，37℃摇床250rpm/min，4h后涂布于LB固体培养基上（LB固 体培养基含50μg/ml卡那霉素，7μg/ml庆大霉素，10μg/ml四环素，100μg/ml Bluo-gal，和40μg/ml IPTG），37℃培养48h，蓝白斑筛选白克隆并鉴定。对 正确克隆进行扩增后用试剂盒（PureLinkTMHiPure Plasmid DNA Miniprep  Kit，按说明书进行操作）抽提重组Bacmid DNA。

将抽提的Bacmid DNA用CELLFECTINTM转染试剂转染Sf9细胞，收 集培液上清中的第一代昆虫杆状病毒，用其再次感染新鲜Sf9细胞，获得第 二代昆虫杆状病毒。Sf9细胞生长密度为1×106个/ml时加入适量第二代病 毒，72h后收集细胞并于-80℃保存，用于蛋白提取及纯化。

取108个Sf9细胞加入20ml4℃预冷的裂解液重悬细胞，裂解液成分为 0.88%NaCl，0.79%Tris.HCl，0.001%PMSF（苯），0.004%DTT， 0.004%EDTA(PH=7.5)。将细胞冰上超声破碎后于10000g离心30min(4℃)， 收集上清。

取Glutathione Sepharose4B用2倍体积的预冷PBS洗涤三次后，每10ml 上清中加入300μl Glutathione Sepharose4B，以100rpm/min旋转2h(4℃)， 充分混合均匀。将混合液以500g离心5min(4℃)，分别收集Glutathione  Sepharose4B离心沉淀和上清组分。用5倍体积预冷的洗涤液洗涤沉淀，洗 涤液成分为0.88%NaCl，0.79%Tris.HCl，0.001%PMSF，0.004%DTT， 0.004%EDTA(PH=7.5)。用800μl预冷洗脱液洗脱沉淀两次，洗脱液成分为 0.88%NaCl，0.79%Tris.HCl，0.31%glutathione，0.001%PMSF，0.004%DTT， 0.003%EDTA(PH=7.5)。收集重组蛋白并加入甘油（终浓度为25%体积百分 比），于-80℃冻存。

常规SDS-PAGE蛋白电泳后，用考马斯亮蓝R-250染，与标准品比较 鉴定重组蛋白分子量大小，其结果如图2所示（其中泳道a为杆状病毒感染 的Sf9细胞的全细胞裂解液；b为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液 离心所得上清；c为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液离心所得沉淀； d、e、f为清洗缓冲液；g、h、i为溶解缓冲液；M为Marker9+-）。

用常规蛋白免疫印记(Western Blot)方法，使用针对RIP3蛋白的特异性 抗体和针对GST蛋白的特异性抗体检测带GST标签的重组RIP3蛋白，所 得结果如图3所示（其中泳道a和c为一克隆表达的RIP3蛋白激酶和GST 融合蛋白的western结果，泳道b和d为另一克隆表达的RIP3蛋白激酶和 GST融合蛋白的western结果）。所用方法为常规Western Blot法，具体步骤 如下：

（1）用含十二烷基磺酸钠和二硫苏糖醇的裂解液混合蛋白纯化洗脱液， 95℃加热10min，收集蛋白样品；

（2）10%SDS-PAGE凝胶电泳后蛋白转至硝酸纤维素膜；

（3）10%脱脂牛奶封闭1h；

（4）R&D公司RIP3抗体（货号MAB7604）1∶500比例，GST抗体按 1:4000比例，4℃孵育过夜或室温孵育4h；含3‰吐温20的TBS洗涤5次， 每次5min；

（5）二抗（Goat Anti-Mouse IgG和Goat Anti-Rabbit IgG均购自R&D 公司）按1∶2000比例室温孵育1h；含3‰吐温20的TBS洗涤5次，每次5 min；

（6）用Pierce ECL Western Blotting Substrate试剂处理3-5min，X胶片 暗室显影。

用蛋白定量试剂盒GST tag ELISA Detection Kit测定纯化获得的重组蛋 白中融合标签蛋白GST-Tag浓度，即获得RIP3重组蛋白，蛋白浓度为100 μg/ml。

2、RIP3蛋白激酶活性检测实验条件优化

将上述步骤制备所得的含有RIP3蛋白的酶混合液定义为溶液A（RIP3 蛋白浓度为100μg/ml），将不含RIP3蛋白的空白昆虫细胞中获得的阴性对 照溶液定义为溶液B，将所述溶液用于后续酶活反应条件优化及抑制剂筛选 实验。反应结束后用Promega公司Kinase-Glo试剂盒(货号：V6711)按使用 说明在Envision多标记微孔板检测仪检测发光值。

（1）确定RIP3重组蛋白的适宜用量

采用以下条件检测RIP3重组蛋白酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS （pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mM β-glycerol-phosphate，0.05mM DTT，在所得缓冲溶液中加入底物MBP，不 同浓度的RIP3重组蛋白（RIP3重组蛋白的浓度见表1所示）和ATP进行反 应，其中MBP浓度为50ng/μl，ATP浓度为10μM；30℃摇床反应 100RPM，反应90min。

待RIP3酶促反应90分钟后，使用试剂盒（购自promega，
货号V6711）检测ATP浓度，按试剂盒使用说明书操作。具体步骤为：使用
试剂盒提供的缓冲液溶解试剂盒提供的底物，混匀后按10μl/孔加入RIP3酶
促反应液中，5-10min后使用Envision多标记微孔板检测仪检测发光值。所
测发光值（2104Multilabel Reader）如图4所示。根据发光值计算
RIP3特异性酶促反应发生程度，特异性反应率%=（无MBP时的发光值-有
MBP时的发光值）/无MBP时的发光值×100%。根据上述公式计算RIP3蛋
白用量所对应的信号值，结果如表1所示：

表1RIP3重组蛋白反应率

表1结果说明：RIP3蛋白激酶在酶促反应液中的浓度为0.5ng/μl～4ng/μl 时其酶促反应率大于30%，从经济角度考虑选择0.5ng/μl～1.5ng/μl为适宜 用量。下述酶促反应液中的RIP3蛋白激酶的浓度均为1ng/μl。

(2)确定底物MBP的适宜用量

采用以下条件检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS （pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mM β-glycerol-phosphate，0.05mM DTT，在反应缓冲液中加入RIP3蛋白、不同 浓度的底物MBP和ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度均为1ng/μl，ATP的 浓度为10μM，摇床震荡速度50RPM，30℃反应90min。

选取不同用量的底物MBP（MBP用量分别为：30ng、60ng、150ng、300ng、 600ng和900ng）进行反应，反应进行90min后利用上述方法检测荧光值， 结果表明：发光值变化量随MBP用量增加而增加，表明酶促反应程度随MBP 用量增加而增加，呈线性动力学关系。在MBP用量为30ng/μl时达到最大， 在大于30ng/μl用量时酶促反应程度不再显著增加，因此选择15ng/μl～ 30ng/μl的蛋白用量为适宜底物用量。

(3)确定ATP的适宜用量

采用以下条件检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS （pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mM β-glycerol-phosphate，0.05mM DTT，在反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶， 底物MBP，和不同浓度的ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度为1ng/μl，底物 MBP的浓度为25ng/μl，摇床震荡速度为100RPM，30℃反应90min。

选取不同浓度ATP进行反应（ATP浓度分别为：1.25μM，2.5μM，5μM，
10μM，20μM，40μM和80μM）。反应90min后，使用试剂盒
（购自promega，货号V6711）检测ATP浓度≤10μM时的反应，使用
Plus试剂盒（购自promega，货号V3771）检测ATP浓度大于
10μM且≤100μM时的反应，按试剂盒使用说明书操作。具体步骤为：待
RIP3酶促反应90min后，使用试剂盒提供的缓冲液配制底物，混匀后按10μl/
孔加入RIP3酶促反应液中，5-10min后使用多标记微孔板检测仪检测发光
值。结果如图5所示，在上述条件下达最大反应速率一半时的ATP浓度约为
15μM(Km值)，此时ATP浓度值与发光值变化值间存在线性相关且处于线
性中段，对抑制剂作用敏感。对不同ATP浓度的特异性反应率进行计算，结
果如表2所示：

表2ATP特异性反应率

ATP(μM) 1.25 2.5 5 10 20 40 80

特异性反应率(%) 80.9 68.1 54.2 47.9 45.6 19.4 15.5

该结果显示在ATP浓度为10～20μM时其特异性反应率接近50%，鉴 于promega试剂盒在不同ATP浓度时有应用局限性，并且较低浓度ATP时 对抑制剂较为敏感，因而确定10μM为适宜浓度。

(4)确定适宜反应温度

采用以下条件检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS （pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mM β-glycerol-phosphate，0.05mM DTT。在反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶， 底物MBP和ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度为1ng/μl，底物MBP的浓度 为25ng/μl，ATP浓度为10μM，选取不同温度进行反应，摇床震荡速度为 50RPM，反应90min。

选取不同温度进行反应（16℃，20℃，25℃，30℃和37℃），利用上述
用试剂盒检测反应液荧光值，结果如图6所示，不同温度下特
异性酶促反应率有显著差异：其中温度在20℃～30℃时反应率≥40%，在
25℃时达到最大反应率，约为50%；在30℃时反应率约为45%，与25℃时
反应率接近；温度在37℃时反应率已不足25%。因此，该酶促反应适宜温
度为20℃～30℃。考虑到25℃为室温而无需其它特殊温控仪器设备，易于
开展抑制剂筛选，因而推荐使用25℃。

(5)确定适宜反应时间

采用以下条件检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS （pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mM β-glycerol-phosphate，0.05mM DTT。在反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶， 底物MBP和ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度为1ng/μl，底物MBP的浓度 为25ng/μl，ATP浓度为10μM，25℃摇床震荡速度为50RPM，选取不同反 应时间的产物进行测量。

于不同时间（30～90分钟），利用上文所述用试剂盒检测
反应进行程度并比较特异性反应率大小，其结果如图7所示，结果显示特异
性反应率随反应时间增加而增加，75min内呈线性相关。反应时间少于45
min时特异性反应率低于40%，60min时约为45%，在90min时约为50%。
因此抑制剂筛选时反应时间在60～90min均适用，选择75min线性关系好
并节省时间。

(6)确定适宜反应pH值

采用以下条件检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS （pH=7.0），5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，0.4mM EDTA，1mM EGTA，2.5mM β-glycerol-phosphate，0.05mM DTT。在反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶， 底物MBP和ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度为1ng/μl，底物MBP的浓度 为25ng/μl，ATP浓度为10μM，摇床震荡速度为50RPM，25℃反应75min， 其间使用HCl或NaOH调节pH值至所需值。

于不同pH值反应液中（pH分别为6.5，6.75，7.0，7.25）检测反应进 行程度并比较特异性反应率大小，检测方法如前所述，所得结果如图8所示， 结果显示特异性反应率随反应液pH值上升而增加，pH值在6.5-7.0范围内 特异性反应率最为稳定，而当pH值高于7.0后特异性反应率显著下降，因 此抑制剂筛选时反应液适宜pH值为6.5-7.0。

（7）确定RIP3的活性单位以及抑制剂筛选反应条件

1个活性单位定义为在10μl反应液里，25℃下反应75min消耗100nM 的ATP所需要的酶量。抑制剂筛选模型的反应体系为：384孔板每孔10μl 的反应液里，含50单位（U）RIP3重组蛋白，底物MBP蛋白250ng，ATP 10μM，于25℃反应75min。

实施例2RIP3抑制剂的筛选

采用以下条件初步检测RIP3酶活，配制反应缓冲液：10mM MOPS， 2.5mMβ-glycerol-phosphate，5mM MgCl2，2.5mM MnCl2，1mM EGTA，0.4mM EDTA，0.05mM DTT。在反应缓冲液中加入RIP3蛋白激酶，底物MBP，待 测蛋白激酶抑制剂和ATP，其中RIP3蛋白激酶的浓度为5U/μl，底物MBP 的浓度为25ng/μl，ATP浓度为10μM，摇床震荡速度为100rpm，25℃反 应75min，所得反应液的pH值为6.8。

用不同浓度索拉菲尼（索拉菲尼浓度分别为：0.80μM，4μM，20μM和
100μM）、舒尼替尼（舒尼替尼浓度分别为：0.80μM，4μM，20μM和100μM）
和威罗菲尼（Vemurafenib，其浓度分别为：0.80μM，4μM，20μM和100μM）
分别加入反应体系，上述三种化合物均购买自Selleck Chemicals公司。反应
结束后与未加药反应组相比较，抑制率%=（空白组特异性反应率-加药组特
异性反应率）/空白组特异性反应率×100%。上述反应体系反应进行75min
后，利用上述试剂盒及检测方法检测反应液的发光值，测试结
果如图9所示，所得结果显示索拉菲尼显示出浓度依赖的抑制活性，显示出
阳性作用，半数抑制浓度约为20μM；Vemurafenib在100μM浓度下抑制率
约为90%，半数抑制浓度约为2.4μM；舒尼替尼在100μM浓度下抑制率不
足5%，显示出阴性作用。由于目前尚未发现RIP3蛋白激酶的抑制剂，应用
本发明首次发现多靶点抑制剂索拉菲尼和威罗菲尼（Vemurafenib）分子具有
RIP3蛋白激酶抑制活性，而多靶点抑制剂舒尼替尼未能产生抑制作用，上
述实验结果表明本发明所述针对RIP3蛋白激酶的抑制剂筛选方法具有选择
性和特异性。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发 明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。