一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法

本发明属于水处理领域，特别涉及一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法。

目前国内外污水处理厂普遍采用活性污泥工艺进行脱氮除磷，短程硝化-反硝化技术因可以有效节省碳源、曝气能耗、减少污泥产量和反应器占地面积，极富应用价值，成为目前世界污水处理领域研究热点。污水处理系统活性污泥中涉及脱氮除磷的功能菌浓度和反应速率成正比，直接影响污水处理工艺的脱氮除磷效果。提高短程反硝化细菌的浓度，以促进短程反硝化功能的发挥。相关报道显示一些反硝化细菌同时具备除磷功能。此外与纯种细菌相比，复合菌因具有生物多样性而更易适应实际污水复杂的水质情况。

影响反硝化细菌生长的主要因素包括温度、pH、溶解氧(DO)、碳氮比(C/N)、亚硝酸盐负荷等。反硝化气体产物主要为N，可能产生NO，NO属于温室气体，对大气环境产生不利影响，因而需要尽量避免反硝化过程NO的生成。以往研究表明温度低于15℃，反硝化速率显著降低。pH值小于6.5，易生成NO。大多数反硝化细菌属于异养细菌，碳源不足导致反硝化过程停止。DO对反硝化有抑制作用，DO的存在降低了反硝化速率，且微氧环境导致NO产量增加。此外高浓度亚硝酸盐的存在抑制亚硝酸盐还原酶(Nir)的活性，导致亚硝酸盐反应速率降低，同时也抑制了氧化亚氮还原酶(Nos)的活性，导致了系统NO释放量增加。

针对上述问题，开发出一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法，可以在短期内获得在总细菌中占有数量优势同时实现以亚硝酸盐为电子受体的高反硝化速率，同时具备以硝酸盐为电子受体进行反硝化的能力，为进行工业化短程反硝化细菌菌培养提供指导，在水处理生物脱氮(除磷)领域具有广泛的应用前景。

本发明的目的在于开发出一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法，利用该方法富集培养的短程反硝化细菌菌，应用于水处理生物脱氮(除磷)领域，可以实现以亚硝酸盐为电子受体的高反硝化速率，同时具备以硝酸盐为电子受体进行反硝化的能力，短程反硝化细菌菌在总细菌中占有数量优势、短程硝化-反硝化节省碳源和曝气能耗等实际应用价值。为了实现上述状态，本发明采用了以下技术方案。

一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法，其特征在于：培养后短程反硝化细菌菌在总细菌中占有数量优势并且可以实现以亚硝酸盐为电子受体的高反硝化速率，同时具备以硝酸盐为电子受体进行反硝化的能力。

一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法的技术方案如下：

1、一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法，具体实施步骤如下：

(1)以含有短程反硝化细菌的活性污泥为接种污泥，一次性投加亚硝酸盐和有机物(本发明采用NaNO提供亚硝酸盐，CHCOONa提供有机物)作为反应底物间歇运行，体系中初始NO-N浓度[NO-N]、NO-N浓度[NO-N]、初始COD浓度[COD]，反应时间t，反应结束NO-N浓度[NO-N]、NO-N浓度[NO-N]、COD浓度[COD]，使得[NO-N]为[NO-N]的0.1～0.6倍，[NO-N]＝[NO-N]+[NO-N]，计算此反应段的接种污泥的反硝化速率DNR和碳氮比[COD]/[NO-N]；

(2)然后采用底物(亚硝酸盐和有机物)流加-间歇式运行方法，进行进水、反应、污泥沉淀、排水的间歇式运行模式，具体实施步骤如下：

1)采用底物(亚硝酸盐和有机物)流加-间歇式运行方法是每个周期亚硝酸盐和有机物投加分为两种方式，即进水时先通过投加亚硝酸盐和有机物作为反应初始底物，反应开始时再通过流加方式向反应器中连续补充亚硝酸盐和有机物；进水后反应体系内初始NO-N浓度记为[NO-N]；

2)开启温度控制、pH、搅拌装置进行本周期反应、污泥沉淀、排水；

3)底物(亚硝酸盐和有机物)流加即配制亚硝酸盐和有机物流加液于一储备器中、在每个间歇式运行周期连续不断地滴加供应于反应器内，即随着乙酸钠作为有机碳源进行以亚硝酸盐为电子受体的反硝化，连续不断地补充亚硝酸盐和有机物；

4)第n个周期的亚硝酸盐反硝化速率记为DNR，第n个周期反应体系中的亚硝酸盐流加速率[NO-N]按照[NO-N]＝(0.8～2.0)×DNR进行计算，第n个周期流加液碳氮比[COD]/[NO-N]按照[COD]/[NO-N]＝(0.8～1.5)×{[COD]/[NO-N]}进行计算；

5)步骤(1)中间歇运行的亚硝酸盐反硝化速率计算如下：

式中DNR：亚硝酸盐反硝化速率，mg/(L·h)；

[NO-N]：初始NO-N浓度，[NO-N]＝[NO-N]+[NO-N]，mg/L；

[NO-N]：反应结束NO-N浓度，mg/L；

t：反应时间，h；

6)步骤(2)底物(亚硝酸盐和有机物)流加-间歇式运行的亚硝酸盐反硝化速率和COD利用速率计算如下：

式中R：每个周期C反应速率，mg/(L·h)；

[C]：每个周期初始C浓度，mg/L；

[C]：每个周期C流加速率至反应液，mg/(L·h)；

[C]：每个周期反应结束C浓度，mg/L；

t：每个周期C流加时间也即反应时间，h；

注：此公式可通用于计算各种反应底物流加-间歇式运行的底物反应速率，C为具体反应底物，公式中各参数与结果图中各参数对应；

本发明具体为：C＝NO-N或COD

式中DNR：每个周期亚硝酸盐反硝化速率，mg/(L·h)；

[NO-N]：每个周期初始NO-N浓度，mg/L；

[NO-N]：每个周期亚硝酸盐流加速率至反应液，mg/(L·h)；

[NO-N]：每个周期反应结束NO-N浓度，mg/L；

t：每个周期亚硝酸盐流加时间也即反应时间，h；

式中CUR：每个周期COD利用速率，mg/(L·h)；

[COD]：每个周期初始COD浓度，mg/L；

[COD]：每个周期有机物流加速率至反应液，mg/(L·h)；

[COD]：每个周期反应结束COD浓度，mg/L；

t：每个周期有机物流加时间也即反应时间，h；

7)步骤(2)底物(亚硝酸盐和有机物)流加-间歇式运行的各周期反应的实际碳氮比[COD]/[NO-N]计算如下：

式中[COD]/[NO-N]：每个周期实际碳氮比；

CUR：每个周期COD利用速率，mg/(L·h)；

DNR：每个周期亚硝酸盐反硝化速率，mg/(L·h)。

8)步骤(2)底物(亚硝酸盐和有机物)流加-间歇式运行的每个周期所用底物的总质量根据以下公式计算：

式中m：每个周期所用可提供C的物质的总质量，g；

[C]：每个周期亚硝酸盐流加速率至反应液，mg/(L·h)；

t：每个周期亚硝酸盐流加时间也即反应时间，h；

V：反应液体积，L；

S：[C]基准值：可提供C的物质的质量(g)，为1L反应液提供C浓度，取100mg/L；

注：此公式可通用于计算各种反应底物流加-间歇式运行的底物流加液配制，C为具体反应底物，其中计算基准值S视具体反应底物而定，公式中各参数与结果图中各参数对应；

本发明具体为：C＝NO-N或COD

式中m：每个周期所用NaNO的总质量，g；

[NO-N]：每个周期亚硝酸盐流加速率至反应液，mg/(L·h)；

t：每个周期亚硝酸盐流加时间也即反应时间，h；

V：反应液体积，L；

S：[NO-N]基准值：NaNO(g)为1L反应液提供NO-N浓度，取100mg/L，计算方法本发明取0.493，即0.493gNaNO对应1L反应液的NO-N浓度100mg/L；

式中m：每个周期所用CHCOONa的总质量，g；

[COD]：每个周期有机物流加速率至反应液，mg/(L·h)；

t：每个周期有机物流加时间也即反应时间，h；

V：反应液体积，L；

S：[COD]基准值：CHCOONa(g)为1L反应液提供COD浓度，取100mg/L，因CHCOONa～2O，计算方法本发明取0.1281，即0.1281gCHCOONa对应1L反应液的COD浓度100mg/L。

2、所述的一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法，每个周期反应温度15～35℃、pH7.0～8.5、搅拌转速40～120rpm、DO0mg/L。

3、所述的一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法，同周期加入底物流加液的体积速率相同(所有周期的体积速率相同)，可通过改变储备器中底物流加液的浓度(每个周期内的浓度相同)，从而改变底物流加速率[NO-N]和[COD]。

4、所述的一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法，通过控制亚硝酸盐流加速率和实际亚硝酸盐反硝化速率的相互关系，可以控制整个反应周期内反应液的NO-N浓度。

5、所述的一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法，通过控制流加液碳氮比和实际反应碳氮比的相互关系，可以控制反应体系COD浓度。

6、所述的一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法，每个周期反硝化反应产生碱度，pH升高，反应期间设置加酸装置，根据设定pH值自动调节pH、补充酸度，加酸装置中添加的物质为HCl溶液，即可实现调节pH、补充酸度。

将富集培养的短程反硝化细菌菌应用于水处理生物脱氮(除磷)领域。

本发明所述的一种底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法的有益效果主要体现在：

1.底物(亚硝酸盐和有机物)流加-间歇式运行方法可以持续供应反硝化反应所需的反应底物亚硝酸盐和有机物；

2.采用底物(亚硝酸盐和有机物)流加-间歇式运行，通过控制亚硝酸盐流加速率和实际亚硝酸盐反硝化速率的相互关系，可以控制整个反应周期内反应液的NO-N浓度，以防止抑制亚硝酸盐还原酶(Nir)和氧化亚氮还原酶(Nos)的活性导致亚硝酸盐反硝化速率降低和NO生成；

3.采用底物(亚硝酸盐和有机物)流加-间歇式运行，通过控制流加液碳氮比和实际反应碳氮比的相互关系，可以控制反应液的COD浓度；

4.采用此方法富集培养的短程反硝化细菌菌为主要功能菌可以实现高亚硝酸盐反硝化速率，同时具备以硝酸盐为电子受体进行反硝化的能力；

5.采用此方法富集培养的短程反硝化细菌菌在总细菌中占有数量优势；

6.此方法富集培养的短程反硝化细菌菌保留了接种污泥(如污水处理厂A/O工艺回流污泥)反硝化细菌菌的菌组成，因具有生物多样性而较纯种细菌更具优势；

7.本方法可以用于指导工业化短程反硝化细菌菌富集培养，获得的菌种可用于生物填料及细胞固定化菌源、直接生物添加、制作菌剂添加至污水处理系统以提高污水、废水处理的反硝化速率，亚硝酸盐和硝酸盐均可以作为反硝化的电子受体。

图1为全自动细菌发酵罐示意图；

图中：1.显示屏 2.搅拌器 3.传热/冷却层 4.pH电极 5.温度电极 6.DO电极 7.取样口和盖子 8.HCl原液储备器 9.HCl进液泵 10.NaNO和CHCOONa流加液储备器11.NaNO和CHCOONa进液泵；

图2短程反硝化细菌菌富集培养期间各天每周期初始和反应结束NO-N、NO-N和COD浓度；

图3各周期的NO-N、COD流加速率和流加液碳氮比，计算得到的相应周期亚硝酸盐反硝化速率和实际碳氮比；

图4高通量测序结果(属(Genus)水平)：yrd2_1为接种污泥样品，yrd2_2为富集培养第5天污泥样品，yrd2_3为富集培养第12天污泥样品。

下面结合实施案例对本发明作进一步具体描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

1.接种污泥反硝化速率测定

以污水处理厂A/O工艺回流污泥为接种污泥(本发明优选污水处理厂A/O工艺回流污泥)，以全自动细菌发酵罐为试验装置，有效容积4L，如图1所示。图1中1为显示屏，其上有按键用于调节参数；2为搅拌器；3为传热/冷却层；4为pH电极用于监测反应液pH；5为温度电极用于监测反应液温度；6为DO电极用于监测反应液DO；7为取样口和盖子；8为HCl原液储备器，9为HCl进液泵，用于调节pH，补充酸度；10为NaNO和CHCOONa流加液储备器，11为NaNO和CHCOONa进液泵，用于流加液供给。

接种污泥的污泥浓度(MLSS)为5273mg/L。温度20±2℃，pH7.5±0.2，DO0mg/L，搅拌转速50rpm，HCl原液摩尔浓度1～5mol/L。一次性投加亚硝酸钠和乙酸钠间歇运行测定接种污泥的反硝化速率，初始NO-N浓度即[NO-N]为20.14mg/L、[NO-N]为4.45mg/L(本发明优选[NO-N]<5mg/L)、[COD]为114.35mg/L，[COD]/[NO-N]约为5(本发明优选[COD]/[NO-N]为4～10)，反应时间t为1h，反应结束NO-N浓度即[NO-N]为10.35mg/L、[NO-N]为0.93mg/L、[COD]为9.35mg/L，根据公式(1)计算接种污泥的反硝化速率DNR为13.31mg/(L·h)，实际C/N约为8。

2.底物(亚硝酸盐和有机物)流加-间歇式运行方法富集短程反硝化细菌菌

采用底物(亚硝酸盐和有机物)流加-间歇式运行方法富集培养短程反硝化细菌菌，每周期加入亚硝酸钠和乙酸钠流加液的体积速率为21mL/h，反应器共运行12天，每天运行2周期(即t分别为8h和12h)，第1周期为8h。基础培养液成分及浓度见表1：

每周期开始向反应器内加入自来水和计算好体积(KHPO；MgSO·7HO、CaCl溶液各50mL；微量元素溶液4mL)的基础培养液至4L(反应液体积V)，FeSO·7HO和NaNO现用现配，CHCOONa根据前一周期剩余情况决定本周期初始时是否加入；进水后使得体系中水质指标为：0～50mg/LNO-N即[NO-N]，30mg/LPO-P，30mg/LMgSO·7HO，15mg/LCaCl，30mg/LFeSO·7HO和1mL/L微量元素(0.5mg/LZnSO·7HO，0.5mg/LMnCl·4HO，0.4mg/LCoCl·6HO，0.4mg/LCuSO·5HO，0.2mg/LNiCl·6HO)。

表1基础培养液成分(以下成分不是混合物，是多个单独的溶液)

注：KHPO为单独的溶液；MgSO·7HO、CaCl为单独的混合溶液；微量元素为单独的混合溶液；此三种溶液为由去离子水配制的储备液，可供多个周期使用。

根据图2各周期初始浓度[NO-N]、[COD]和反应结束浓度[NO-N]、[COD]，采用公式(2-1)和(3)计算各周期的亚硝酸盐反硝化速率DNR和每个周期实际碳氮比C/N，考察短程反硝化细菌菌富集培养期间反应器运行效果，结果如图3所示。每个周期排水后补自来水搅拌后，再重复进行污泥沉淀、排水过程，进行“污泥清洗”，根据本周期亚硝酸盐或有机物剩余情况确定该过程次数以降低背景值。反应器运行至12天第12h周期(第24周期)亚硝酸盐流加速率[NO-N]采用300mg/(L·h)，计算得到亚硝酸盐反硝化速率达到275.35mg/(L·h)。亚硝酸盐反硝化速率约为接种时的21倍。通过运行周期数确定最终需要的活性污泥亚硝酸盐反硝化速率，结束短程反硝化细菌菌富集培养。此外，与接种污泥相比，短程反硝化细菌菌富集培养后，污泥浓度为9165mg/L，污泥沉降性显著提高，SVI由186mL/g降低至71mL/g，SVI由116mL/g降低至35mL/g。

根据高通量测序结果，在属(Genus)水平上，见图4，检测到富集培养后具有反硝化功能的Pseudomonas、Dechloromonas、flavobacterium、Thauera和Rhodobacter的比例分别为56.13％、5.19％、11.70％,7.76％和3.48％，总和高达84.26％(yrd2_3序号1、2、3、4、5)，显著高于接种时具有反硝化功能的Pseudomonas、Dechloromonas、flavobacterium、Thauera、Rhodobacter和Zoogloea的比例2.16％(yrd2_1序号1、2、3、4、5、6)。此外文献报道Pseudomonas和Dechloromonas具有反硝化除磷功能(yrd2_3序号1、2)。表明在富集培养期间短程反硝化细菌菌得以大量生长，其他细菌通过“污泥清洗”逐渐被淘洗出反应器，与反应器高亚硝酸盐反硝化速率(大于270mg/(L·h))的试验结果相符。3.以硝酸盐为电子受体的反硝化效果

反应初始[NO-N]和[NO-N]分别为202.41mg/L和133.14mg/L，C/N约为4。反应100min，反应结束[NO-N]和[NO-N]分别为0mg/L和8.69mg/L，具备以硝酸盐为电子受体的反硝化能力。

上述实例表明，本底物流加-间歇式运行的短程反硝化细菌富集方法可以在短期内富集培养短程反硝化细菌菌，实现高亚硝酸盐反硝化速率，并且可以利用硝酸盐为电子受体进行反硝化。本方法可以用于指导工业化短程反硝化细菌菌富集培养，获得的菌种可用于生物填料及细胞固定化菌源、直接生物添加、制作菌剂添加至污水处理系统，应用于水处理生物脱氮(除磷)领域，具有极其富有经济价值的应用前景。