制备“人猪嵌合肝脏等器官”的方法

1.本发明与众不同的内容和创造性实验方案

1.1.世界研究现状

最近“人猪嵌合胚胎”的新闻轰动世界，但本发明认为该技术路线不可行。

曾溢滔院士和黄淑帧教授课题组：首次将人的造血干细胞移植到山羊身上，登上2006 年美国科学院报(PNAS同《科学》和《自然》杂志齐名)。据课题组介绍，美国科学家将人胎肝 造血干细胞通过开腹后宫内移植方法，移植到胎龄为49～54天的胎绵羊体内，建立了人/绵 羊异种移植嵌合体，移植的干细胞可以在山羊体内存活2年之久。也有科研人员将人可无限 增值的癌细胞已同样方法试验，但随着动物免疫系统逐渐完善，癌细胞全部死亡。

本人也曾在90年代从事了先天免疫耐受的实验，并申请过专利说明书中有这样一段 话……以求形成彻底的天然免疫耐受，导入兔子胚胎的正常细胞悬液可采用微型注射器， 并在B超的监视下进行。我这段话的目的在告诉从事胚胎期先天免疫耐受的科研工作者，我 们都犯了一个大错误，异种细胞或异种抗原是不可能在羊或猪的胚胎内建立起真正的天然 免疫耐受机制的。

理论和实践显示外来抗原在动物胚胎期有的能够建立天然免疫耐受，有的则不能。似 乎与动物胚胎“自我”抗原的模拟度有关。为此早在2001年我就与所崇敬的知识渊博的著名 老一辈免疫学家余传霖老师通过书信往来，在余老师铁血的事实根据面前，最终确认动物 胚胎期摄取动物胚胎“自身”抗原的APC细胞，存在着“自我”识别受体这一事实，这一发现表 明动物胚胎期“自我”识别机制的建立，是通过“自我”识别受体的功能完成对“自身”抗原的 检测和呈递，完成天然免疫耐受的。异种抗原不能通过“自我”识别受体被动物胚胎期APC细 胞所摄取和呈递的。也就是说外来抗原是很难在动物体内建立类似“自我”天然免疫耐受 的。遗憾的是有关动物胚胎期建立天然免疫耐受途径，这一有重大缺陷的理论一直应用和 影响到今天，这说明理论研究的滞后对科研研究的影响。

1.1.1.结论：

(1)本发明认为理论和时间表明“种抗原”是“天然免疫耐受”的分界线。

(2)如果将人的待移植器官细胞转换成猪或羊自身抗原，就可以在猪或羊身上真正 “种”出异种器官。

1.2.本发明理论依据：

1.2.1.抗体独特型与抗独特型抗体模拟抗原理论

数字庞大的Id或AId抗体可以摸拟整个外来抗原世界，这是构建“Ab2β抗体库”的主要 理论基础。利用这一理论，特别是通过创造性应用相关理论和免疫学实验技术，就可以制备 模拟本发明人肝脏细胞膜表面全部抗原分子的易接触的空间结构，的全部Ab2β抗体。

1.2.2.天然免疫耐受理论

1.2.2.1.在免疫系统发育成熟前如胚胎期接触某种抗原，出生后当再次遇到相同抗原 时，表现对该抗原的特异性无反应性，称天然免疫耐受。其中中枢耐受：指胚胎期及出生后， T和B细胞未成熟时遇到自身抗原所形成的耐受。

1.2.2.2.大量试验证明同种外来抗原在动物胚胎期能够建立天然免疫耐受(即“自我 与非我”识别系统)，原因存在种抗原的“自我识别受体”。

1.2.3多态性MHC免疫识别理论

多态性MHC的生物学功能和意义，决定了同种动物不同品系特别是某些品系动物具有 更广和更深的免疫识别功能，应用多态性MHC免疫识别理论，就是为最大限度增加免疫识别 能力，并以此制备模拟靶细胞膜表面全部抗原的Ab2β抗体，构建Ab2β抗体库。多态性MHC免 疫识别理论同样是构建“Ab2β抗体库”的重要理论基础。

1.2.4.模拟人肝脏细胞表面抗原所需要的“Ab2β抗体”

本发明相对于人民卫生出版社教科书《天然自身抗体》所阐述：“现代研究库容量10的7 次方可覆盖百分之99％自身抗原决定基，库容量超过10的8次方可得到相对亲和力较高自 身抗体”。可作为实验参考。

1.2.5.不同分子生态环境对同一个体或不同个体免疫系统的影响

提出这个理论旨在说明仅与本发明相关的认识，即经过特定抗原免疫和未经过特定抗 原免疫的同一个体或同一品系动物，除反应性和亲和力以及抗体效价区别之外，未必经过 特定抗原免疫的抗血清就是所需抗特定抗原特定表位的抗体(如肿瘤细胞免疫)，而且识别 抗原表位有限，原因在于优势克隆的作用。那么未经过特定抗原免疫的同一个体或同一品 系动物的血清抗体，则可能识别更多抗原表位这也是区别。那么不同分子生态环境针对不 同个体免疫系统的影响则更大。其理论丰富而复杂，但其相互作用机制都遵循和符合我们 肉眼所见到的大自然演化规律如各种物质(包括人)之间相互作用机制。这就是本发明即采 用经过免疫的抗血清又采用未经过免疫的血清的原因。

1.2.6.有关本发明自命标题“Ab2β抗体库”的相关理论问题

本发明提出这个理论问题的目的在于，(1).有的教科书根据Id与抗Id的血清学反应和 Ab2功能把Ab2分为d、β、γ和ε四种；也有的教科书直接把Ab2分为Ab2α和Ab2β两种。本发明 采用后一种教科书Ab2分型模式，即抗Ab1V区抗原结合部位即互不决定区(CDR)的抗体统称 Ab2β抗体，实际包括Ab2β抗体和Ab2γ抗体，原因在于这样可以使本发明说明书标题和内容 简单化，易理解不易混淆而且更加说明问题。(2).抗Id抗体模拟抗原的模式包括：高变抗Id 区与抗原间的同源性和基于拓扑相似性的模拟。而且结构上的模拟与功能模拟是一致的， 如Ab1的相同表面可与两种无关的结构结合，另外模拟的程度也有完全性模拟和部分模拟 之分别。(3).针对抗原结合部位的AId抗体称为Ab2γ型，其中有一类抗体能模拟外来抗原 (内在影像)称为Ab2β型。(4).Ab2γ型和Ab2β型都能抑制抗原与抗原受体的结合。

1.2.7.最关键理论：在免疫系统的胚胎发育期，Aid就能引起免疫耐受《抗体分子与肿 瘤》71页……。

1.3.实验方案

1.3.1.第一阶段试验

1.3.1.1.选择纯系母猪制备抗人肝脏细胞膜表面不同抗原表位的Ab1抗体。通过如下 两种途径：

1.3.1.1.1.应用保有天然正确空间结构的人肝脏细胞和相应肿瘤细胞(包括相应永生 化细胞)，分别免疫若干只同一纯品系母猪，从中分别提取抗人血清和其纯化的总抗体。然 后应用人肝脏细胞分别与这些抗人血清和其纯化的总抗体相互作用，接着以人肝脏细胞吸 附其中抗体，即抗人肝脏细胞抗体，并采用常规免疫学实验技术或新方法提取和纯化这些 抗体，本发明把这些专一抗人肝脏细胞的抗体称免疫“Ab1抗体”。

1.3.1.1.2.应用保有天然正确空间结构的人肝脏细胞分别与上述未经免疫的同一纯 品系母猪的血清和其血清中提取纯化的总抗体相互作用，接着以人肝脏细胞细胞吸附其中 抗体，即抗人肝脏细胞的抗体，并采用常规免疫学实验技术或新方法提取和纯化这些抗体， 本发明把这些专一抗人肝脏细胞的抗体称天然“Ab1抗体”。

1.3.2.第二阶段试验

1.3.2.1.构建模拟人肝脏细胞膜表面不同抗原表位的“Ab2β抗体库”

1.3.2.1.1.专一筛选结合“Ab1抗体”的同种不同品系的猪“Ab2β抗体”

试验步骤(1).应用常规免疫学实验技术，分别提取纯化同种大量不同品系猪的总B细 胞。(2).通过本发明简单的、独创性免疫学新试验技术，将(1)提取的猪总B细胞与第一阶段 试验获得的免疫和天然“Ab1抗体”，通过两者之间的相互作用，即从这些B细细中完全清除 掉与“Ab1抗体”本身的抗原结合部位不能结合的任何无关的B细胞，目的是保留其它剩余的 与本发明相关的B细胞。(3).将保留的与本发明相关的B细胞与“Ab1抗体”混合，再通过流式 细胞术(FCM)或免疫磁珠技术，筛选出专一结合“Ab1抗体”的B细胞，即本发明所需的“Ab2β 抗体”产生细胞。特别说明的是“Ab1抗体”本身既是抗体又是抗原，在免役学理论与实际结 合中不能忘记这一点，否则不能理解本试验——如何专一筛选出结合“Ab1抗体”的Ab2β抗 体产生细胞。

1.3.2.1.2.制备“Ab2β抗体库”的三条途径

第一条途径：将能够与Ab1抗体抗原结合部位结合的B细胞进行体外培养，在特定的不 同时间内，将体外培养的B细胞，通过噬菌体抗体库技术，制备和构建成模拟人肝脏细胞膜 表面抗原，来自猪源的噬菌体“Ab2β抗体库”。

第二条途径：将能够与Ab1抗体抗原结合部位结合的B细胞进行体外培养，在特定的不 同时间内，将体外培养的B细胞，通过体外培养B细胞技术，制备和构建成模拟人肝脏细胞膜 表面抗原，获得来自猪源分泌性“Ab2β抗体库”。

第三条途径：应用前二条途径的方法和理论，制备来自猪源的各种工程Ab2β抗体库”。

三条途径尽可能获得纯系猪免疫系统模拟人肝脏细胞膜表面不同蛋白分子不同表位 的全部“Ab2β抗体”，并以此构建初级“Ab2β抗体库”。

1.3.2.2.验证初级“Ab2β抗体库”的功能和效果

利用竞争性抑制试验：如ELISA和流式细胞术等试验，通过观察Ab2β抗体竞争性抑制肝 脏细胞与Ab1抗体结合的能力来进行判定。

1.3.3.第三阶段试验

1.3.3.1.理论和实践证明：在免疫系统的胚胎发育期，Aid就能引起免疫耐受。

1.3.3.2.应用上述选择的特定纯系已经怀孕母猪，在其胚胎特定时间里，将获得的 “Ab2β抗体”，通过如下两条途径导入母猪胚胎：

第一条途径：在猪母体胚胎，特定时间妊娠内，在B超监视下，将混合Ab2β抗体的人脐血 造血干细胞注射到胚胎腹腔内。

第二条途径：将获得的“Ab2β抗体”，注射到特定纯系已经怀孕母猪的血管内，“Ab2β抗 体”将通过母体胎盘进入母体胚胎。

1.4.预期结果：

1.4.1.在猪母体胎儿出生并长大后，由于人肝脏细胞膜表面不同抗原，被纯系猪免疫 系统识别为自身抗原而不会遭受免疫排斥。因此，成为唯一真正可在特定猪体内生长的人 猪嵌合肝脏器官供人类器官移植用。

1.4.2.人猪嵌合肝脏器官在移植人体后，猪肝脏细胞会被人免疫系统识别和消灭，其 空缺将被人肝脏细胞取而代之，成为真正的人肝脏。

2.根据权利要求1所诉的本发明是一种制备“人猪嵌合胚眙-肝脏等器官”的唯一方法， 其特征在于实验方案所述的制备“人猪嵌合胚眙-肝脏等器官”，可被制备“人和其它动物嵌 合胚胎-肝脏等器官”所代替。

3.根据权利要求1所诉的本发明是一种制备“人猪嵌合胚胎-肝脏等器官”的唯一方法， 其特征在于实验方案所述的制备“人猪嵌合胚胎-肝脏等器官”，可被制备“人猪嵌合胚胎- 人其它器官如心、肾和肺等”所代替。

4.根据权利要求1所诉的本发明是一种制备“人猪嵌合胚胎-肝脏等器官”的唯一方法， 其特征在于实验方案所述的纯系猪，可被不同种属的同种其它纯系动物所代替。

5.根据权利要求1所诉的本发明是一种制备“人猪嵌合胚胎-肝脏等器官”的唯一方法， 其特征在于实验方案所述的猪同种不同个体B细胞，可被不同种属的同种不同个体B细胞所 代替。