发酵乳杆菌LF028在产γ-氨基丁酸及其在制备改善睡眠、缓解焦虑产品中的应用的制作方法

发酵乳杆菌lf028在产
γ-氨基丁酸及其在制备改善睡眠、缓解焦虑产品中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物工程领域，涉及一种乳杆菌的应用，具体地说是发酵乳杆菌lf028在产γ-氨基丁酸及其在制备改善睡眠、缓解焦虑产品中的应用。

背景技术：

2.由于生活压力的增加与各种疾病的影响，失眠已成为一个严重的健康问题并长期困扰着人们。全球范围内大约10％至15％的人受到失眠的困扰，约25％至35％的人会出现短暂或偶尔的失眠。2007年中国慢性病和危险因素监测结果显示，15～69岁的中国居民中有35.7％的人睡眠质量较差；2017年cao x l等人使用随机效应模型研究发现总样本量为115988的中国普通人失眠症的合并时点患病率为15.0％，明显低于许多西方国家，与其他亚洲国家的调查结果相类似。
3.失眠总和焦虑、抑郁等疾病相伴而生，40％的失眠患者有一种或几种精神障碍，其中焦虑障碍占到24％。失眠和焦虑存在中等程度的相关性。其中在失眠与焦虑共病的患者中，焦虑障碍先于失眠的情况占73％，而失眠先于焦虑的占69％。因此失眠是焦虑发作的常见症状之一，也是焦虑发病的主要因素，反过来，焦虑也可以是慢性失眠的危险因素。所以，缓解焦虑也是失眠的一个重要手段。
4.由于药物失眠和焦虑具有见效快、效果好的特点，所以目前失眠和焦虑的临床上应用最广泛的仍然是药物疗法，较常用的失眠的药物有苯二氮类和非苯二氮类药物；临床常用的抗焦虑药主要分为以下几类:苯二氮卓类、三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂和单胺氧化酶-可逆性抑制剂、选择性5-9胺再摄取抑制剂、螺环酮(buspirone)等。但是现在应用的物或缓解焦虑的药物均有着不同程度的副作用，患者长期服用会产生依赖性和耐受性，一旦停止使用，还可能会产生戒断反应。
5.γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，gaba)作为一种抑制性神经递质，在人体中可以产生镇静安神、改善睡眠的作用。近年来有一些研究表明，能够产生γ-氨基丁酸的乳杆菌及其发酵产品可以发挥出良好的改善睡眠功效，且该方法无成瘾性或耐药性、无副作用，但是已报道的乳杆菌产γ-氨基丁酸的能力普遍偏低。

技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题，是要提供发酵乳杆菌lf028在产γ-氨基丁酸中的应用，通过优化培养基成分以提高发酵乳杆菌lf028产γ-氨基丁酸的能力；
7.本发明的另一目的，旨在提供发酵乳杆菌lf028在制备具有改善睡眠和/或缓解焦虑作用的发酵上清液或益生菌菌粉中的应用，并通过改进菌粉制备工艺，可提高货架期内菌粉中的益生菌的活性，为更好地应用发酵乳杆菌lf028制备相关产品奠定基础；
8.本发明的第三个目的，旨在提供发酵乳杆菌lf028在制备具有改善睡眠作用的发酵食品中的应用，进一步拓宽发酵乳杆菌lf028的应用范围，同时为失眠患者提供健康、安
全、有效的食品。
9.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
10.本发明提供了发酵乳杆菌lf028在产γ-氨基丁酸中的应用，所述应用中发酵乳杆菌lf028的发酵培养基中硫酸锌的浓度为0.01％～0.05％。
11.其中，所述发酵乳杆菌lf028是从贵州省贵阳市的农家酸汤中分离筛选出来的，拉丁文名称为lactobacillusfermentum，该菌株已于2021年7月6日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为cgmccno.22833，保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
12.本发明还提供了发酵乳杆菌lf028在制备具有改善睡眠和/或缓解焦虑作用的发酵上清液或益生菌菌粉中的应用，因在实际应用中，菌悬液具有不易贮存及运输等弊端，因此本发明未对菌悬液的应用进行叙述。
13.作为对上述应用的限定，所述益生菌菌粉包括发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉和包含发酵乳杆菌lf028的复配型益生菌菌粉。
14.作为对上述应用的进一步限定，所述益生菌菌粉的制备方法包括依次进行的以下步骤：
15.s1.将发酵乳杆菌lf028发酵液离心，制得菌泥；
16.s2.将菌泥与保护剂a混匀制得混合物c，混合物c与保护剂b混匀，制得混合物d；
17.s3.将混合物d滴入定型液中形成晶珠，冷冻干燥，即得所述益生菌菌粉。
18.作为对上述益生菌菌粉制备方法的限定，所述保护剂a为10％脱脂乳溶液；
19.保护剂b由0.4％海藻酸钠、10％海藻糖、5％麦芽糊精、6％蔗糖、0.5％维生素c和0.2％聚乙烯比咯烷酮复配而成；
20.定型液为20％氯化钙溶液。
21.作为对上述应用的另一种限定，所述菌粉的活菌数3
×
10
10
～6
×
10
11
cfu/g。
22.本发明还提供了发酵乳杆菌lf028在制备具有改善睡眠作用的发酵食品中的应用。
23.由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
24.①
本发明提供的发酵乳杆菌lf028在产γ-氨基丁酸中的应用中，发现硫酸锌对菌株产γ-氨基丁酸能力具有调节作用，当发酵乳杆菌lf028种液以3％接种量接种于硫酸锌浓度为0.05％的发酵培养基，于37℃静置培养18h后，发酵液中γ-氨基丁酸的含量为387mg/l，适宜浓度的硫酸锌可显著提高发酵乳杆菌lf028的产γ-氨基丁酸的能力；
25.②
本发明还发现发酵乳杆菌lf028具有良好的改善睡眠和缓解焦虑的作用，可将该菌所得的发酵上清液或益生菌菌粉可进一步用于制备具有改善睡眠和(或)缓解焦虑作用的食品、保健食品、膳食补充剂或药品制备；本发明还通过改进菌粉的制备工艺，令制备出的菌粉在货架期内能够更好地保持菌活力，为该菌的进一步应用奠定了基础；
26.③
本发明将发酵乳杆菌lf028制备的发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品和发酵谷物制品具有很好地改善睡眠的作用，其中发酵乳制品组效果最好，改善睡眠的有效率达96.7％；
27.④
与普通市售常规的改善睡眠或缓解焦虑作用的药品相比，本发明提供的的产品无毒副作用，也不会产生依赖性或耐药性。
28.综上所述，本发明提供了发酵乳杆菌lf028在产γ-氨基丁酸中的应用，通过选择培养基中硫酸锌浓度，可显著提高发酵乳杆菌lf028的产γ-氨基丁酸的能力；本发明还发现发酵乳杆菌lf028具有良好的改善睡眠和缓解焦虑的作用，可将该菌用于制备改善睡眠和/或缓解焦虑的食品、保健食品、膳食补充剂或药品制备；同时本发明通过改进菌粉制备工艺，可提高货架期内菌粉中的益生菌的活性，为更好地应用发酵乳杆菌lf028制备相关产品奠定基础。
29.本发明提供的发酵乳杆菌lf028在产γ-氨基丁酸及其在制备改善睡眠、缓解焦虑产品中的应用，可应用于生产γ-氨基丁酸以及改善睡眠和/或缓解焦虑的益生菌产品的制备。
附图说明
30.图1为本发明实施例1中发酵乳杆菌lf028发酵液uhplc-qe-ms正离子模式下的tic图；
31.图2为本发明实施例1中发酵乳杆菌lf028发酵液uhplc-qe-ms负离子模式下的tic图；
32.图3为本发明实施例1中空白对照组的uhplc-qe-ms正离子模式下的tic图；
33.图4为本发明实施例1中空白对照组的uhplc-qe-ms负离子模式下的tic图；
34.图5为本发明实施例1中发酵乳杆菌lf028发酵液γ-氨基丁酸二级质谱图；
35.图6为本发明实施例1中发酵乳杆菌lf028发酵液中五羟基氨酸二级质谱图；
36.图7为本发明实施例1中发酵乳杆菌lf028发酵液中褪黑素二级质谱图；
37.图8为本发明实施例1中发酵乳杆菌lf028发酵液hplc-ms谱图；
38.图9为本发明实施例2中发酵乳杆菌lf028益生菌菌粉活菌数统计图；
39.图10为本发明实施例2中小鼠旷场实验活动时间统计图；
40.图11为本发明实施例2中小鼠旷场实验活动频率统计图；
41.图12为本发明实施例2中小鼠开臂停留时间统计图；
42.图13为本发明实施例2中小鼠进入开臂次数统计图；
43.图14为本发明实施例2中不同组别小鼠的不动时间统计图；
44.图15为本发明实施例8中匹斯堡睡眠质量指数(psqi)调查问卷结果统计图。
具体实施方式
45.下面通过具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
46.本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
47.实施例1发酵乳杆菌lf028在产γ-氨基丁酸中的应用
48.本实施例首先通过对发酵乳杆菌lf028发酵液进行非靶标代谢组学检测，初步确定发酵乳杆菌lf028发酵液中包含的功效成分，然后应用hplc-ms进一步测定了发酵乳杆菌lf028发酵液中功效成分含量，最后考察了不同培养基对发酵乳杆菌lf028产γ-氨基丁酸能力的影响。
49.(1)发酵乳杆菌lf028发酵液的非靶标代谢组学检测
50.代谢组学是一种对代谢物进行全面分析的研究思想，通过代谢物分析对象之间的相关性，对代谢物进行重要性排列，寻不同样本间的差异以及影响分类的关键标标记化合物，从而挖掘分析对象和代谢物间的潜在规律。非靶标代谢组学致力于分析研究样品中所有能检测到的小分子化学物质，这使得对仪器的要求更高，对数据分析更加严格，但是由于测定的全面性，有助于对未关注或未发现化合物的分析，使非靶标代谢组学的概括性更高，发展更为迅速。本实施例中对发酵乳杆菌lf028发酵液基于uhplc-qe-ms进行非靶标代谢组学检测，该部分实验由上海百趣生物医学科技有限公司协助完成。其检测过程如下：
51.①
样品的制备
52.空白对照组样品的制备：为了排除培养基成分对发酵乳杆菌lf028发酵代谢产物的影响，本实施例以mrs液体培养基制备空白对照组(记为ck组)，mrs液体培养基在37℃、静置培养18h，与接种发酵乳杆菌lf028同步。
53.发酵乳杆菌lf028发酵液样品的制备：将发酵乳杆菌lf028，以3％接种量接种到mrs液体培养基中，在37℃、静置培养18h，得发酵液，记为lf028组；
54.其中，mrs液体培养基ph为6.8，其配比表见表1。
55.表1mrs液体培养基配比表
[0056][0057][0058]
②
样品的处理
[0059]
将上步所得培养基或发酵液发酵液在4℃、8000r/min条件下离心15min，取上清液，分别记为分别为ck组和lf028组，各组对应的生物学重复均为2例；
[0060]
移取50μl样品至ep管中，加入200μl提取液(甲醇：乙腈体积比为1：1，含同位素标记内标混合物)，涡旋混匀30s；在冰水浴中超声处理10min；-40℃静置1h后，于4℃、12000rpm条件下离心15min，将所得上清液置于进样瓶中，待检；
[0061]
③
上机检测
[0062]
本发明使用vanquish(thermo fisher scientific)超高效液相谱仪，通过watersacquity uplc behamide(2.1mm
×
100mm，1.7μm)液相谱柱对目标化合物进行谱分离；液相谱a相为水相，含25mmol/l乙酸铵和25mmol/l氨水，b相为乙腈；样品盘温度：4
℃，进样体积：2μl；
[0063]
本发明使用的thermo q exactive hfx质谱仪能够在控制软件(xcalibur，thermo)控制下进行一级、二级质谱数据采集；详细参数如下sheath gas flow rate：30arb，aux gas flow rate:25arb,capillary temperature:350℃,full ms resolution:120000，ms/ms resolution：7500，collision energy:10/30/60innce mode,sprayvoltage:3.6kv(positive)或-3.2kv(negative)。
[0064]
④
数据处理方法
[0065]
原始数据经proteowizard软件转成mzxml格式后，使用自主编写的r程序包(内核为xcms)进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与biotreedb(v2.1)自建二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的cutoff值设为0.3；
[0066]
⑤
结论
[0067]
发酵乳杆菌lf028发酵液uhplc-qe-ms正离子模式(pos)下的tic图如图1所示；发酵乳杆菌lf028发酵液uhplc-qe-ms负离子模式(neg)下的tic图如图2所示；空白对照组培养基uhplc-qe-ms正离子模式(pos)下的tic图如图3所示；空白对照组培养基uhplc-qe-ms负离子模式(neg)下的tic图如图4所示；结合图1-4及二级质谱数据库匹配，进行物质分析和非靶标代谢组学检测分析，得知发酵乳杆菌lf028代谢产物中含有γ-氨基丁酸、五羟基氨酸和褪黑素。
[0068]
其中γ-氨基丁酸二级质谱图图如图5所示；五羟基氨酸二级质谱图如图6所示；褪黑素二级质谱图如图7所示。
[0069]
依据上述结果，本发明应用液相谱-质谱联用技术(hplc-ms)对发酵乳杆菌lf028发酵液中的三种代谢产物进一步测定其含量。
[0070]
(2)发酵乳杆菌lf028发酵液功效成分含量的测定
[0071]
本发明采用hplc-ms对发酵乳杆菌lf028发酵液中三种功效成分进行检测，该检测部分由青岛科创质量检测有限公司协助完成，其检测γ-氨基丁酸和五羟基氨酸的过程如下：
[0072]
①
样品的处理
[0073]
将发酵乳杆菌lf028，以3％接种量接种到mrs液体培养基中，在37℃、静置培养18h，得发酵液；
[0074]
取5ml上述发酵液样品，纯水超声提取后，加70％甲醇稀释沉淀蛋白，离心，取上清液过0.22μm滤膜，置于进样瓶中，用于hplc-ms分析。
[0075]
②
上机检测
[0076]
本发明使用thermo高效液相谱仪，通过uplc acquity beh amide column(2.1mm
×
100mm，1.7μm)谱柱进行分析，检测γ-氨基丁酸及五羟基氨酸含量的液相谱条件如下：
[0077]
其中，流动相a相为0.15％甲酸/水(10mmol/l甲酸铵)，b相为85％乙腈/水(10mmol/l甲酸铵)；采用洗脱梯度，流速为0.4ml/min，柱温为40℃，进样量为2μl；洗脱程序如表2所示。
[0078]
表2发酵乳杆菌lf028发酵液γ-氨基丁酸及五羟基氨酸含量测定洗脱程序
[0079][0080]
检测γ-氨基丁酸及五羟基氨酸含量的质谱条件如下：
[0081]
电喷雾离子源(electrospray ionization，esi)，正离子模式，扫描范围50～400m/z，检测模式prm模式，喷雾电压3.50kv，capillarytemp为20℃，每个离子对是根据优化的去簇电压(declustering potential，dp)和碰撞能(collision energy，ce)进行扫描检测。
[0082]
③
数据处理方法
[0083]
本实施例中计算游离氨基酸含量时按公式1计算：
[0084][0085]
式中：
[0086]
w——试样中目标物含量，单位为mg/kg；
[0087]
c——试样测定液中目标物的浓度，单位mg/l；
[0088]
c0——空白对照中目标物的浓度，单位mg/l；
[0089]
v——定容体积，单位ml；
[0090]
n——稀释倍数；
[0091]
m——试样的取样量，单位为g
[0092]
④
结论
[0093]
采用hplc-ms对发酵乳杆菌lf028发酵液进行检测，其谱图如图8所示，经计算发现发酵液中γ-氨基丁酸的含量为222.45mg/l；五羟基氨酸在检出限以下，并未检测出五羟基氨酸含量，其中五羟基氨酸的的检出限为10.00mg/l；
[0094]
本发明还对发酵液中的褪黑素含量进行了测定，测定方法依据刘定公开的方法(刘定,赵大球,陆春良,等.采用高效液相谱-串联质谱法检测芍药中褪黑素含量[j].分子植物育种，2017,15(4):8)，但是褪黑素在检出限以下，并未检出褪黑素的实际含量，其中褪黑素的检出限为5.00μg/l。
[0095]
(3)培养基中硫酸锌对发酵乳杆菌lf028产γ-氨基丁酸能力的影响
[0096]
为了使发酵乳杆菌lf028产γ-氨基丁酸能力增强，本实施例还考察了培养基中的硫酸锌浓度对发酵乳杆菌lf028产γ-氨基丁酸能力的影响，具体方法如下：
[0097]
采用mrs液体培养基对发酵乳杆菌lf028进行活化，活化好的发酵乳杆菌lf028种液以3％接种量接入到下述a、b、c、d、e五种培养基中，37℃静置培养18h后依次制得a、b、c、d、e五种发酵液，依据本实施例(2)部分记载的方法检测四种发酵液中的γ-氨基丁酸并计
算含量；
[0098]
其中，mrs液体培养基配比表如上表表1所示；
[0099]
a培养基调ph为6.8～7.0，其配比表如表3所示；
[0100]
b培养基为在a培养基基础上添加0.01％的硫酸锌，其余组分及含量不变；
[0101]
c培养基为在a培养基基础上添加0.05％的硫酸锌，其余组分及含量不变；
[0102]
d培养基为在a培养基基础上添加0.06％的硫酸锌，其余组分及含量不变；
[0103]
e培养基为在a培养基基础上添加0.07％的硫酸锌，其余组分及含量不变；
[0104]
5种发酵液中γ-氨基丁酸含量统计表如表4所示。
[0105]
表3 a培养基配比表
[0106][0107]
表4 5种发酵液中γ-氨基丁酸含量统计表
[0108]
发酵液名称a发酵液b发酵液c发酵液d发酵液e发酵液γ-氨基丁酸(mg/l)231316387364218
[0109]
由表4结果可知，与利用a培养基的发酵液相比，利用添加适量硫酸锌的b培养基所得发酵液的γ-氨基丁酸含量显著提高，当培养基中硫酸锌浓度达到0.05％时γ-氨基丁酸的产量达到387mg/l，随着硫酸锌浓度增高到0.07％时，γ-氨基丁酸产量降低到218mg/l。综上数据可知，在本发明实验范围内，硫酸锌对发酵乳杆菌lf028产γ-氨基丁酸能力具有调节作用，当硫酸锌浓度在0～0.05％范围内时，随着硫酸锌浓度的升高发酵乳杆菌lf028产γ-氨基丁酸能力逐渐提高；当硫酸锌浓度超过0.05％时，抑制发酵乳杆菌lf028产γ-氨基丁酸的能力；当硫酸锌浓度为0.07％时的γ-氨基丁酸产量比硫酸锌浓度为0.05％时γ-氨基丁酸产量降低了43.7％。
[0110]
发酵乳杆菌lf028通过谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase，gad)催化
底物谷氨酸(glutamic acid，glu)或谷氨酸盐进行脱羧反应生成γ-氨基丁酸，硫酸锌可能对发酵乳杆菌lf028中gad的活性有很大影响，在一定浓度条件下能促进gad的活性从而提高gaba产量，随着硫酸锌浓度增加到一定程度后则抑制gad活性从而减少γ-氨基丁酸产量。
[0111]
实施例2发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉
[0112]
本实施例提供了发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉的制备方法、发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉的稳定性研究，还考察了发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉对睡眠及焦虑症状的影响。
[0113]
(1)发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉的制备方法
[0114]
发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉制备方法包括依次进行的以下步骤：
[0115]
s1.将发酵乳杆菌lf028从冻存管中取出，以3％接种量接种到mrs液体培养基中，培养条件是37℃，静置，密闭，培养20h，得种子液；
[0116]
将培养好的活化种子液以3％接种量接种至发酵罐中，在37℃、30rpm条件下，在含有m15的发酵液体培养基中培养至对数末期收获，得发酵液；
[0117]
将发酵液进行在4℃、8000r/min条件下离心15min，得到发酵上清液和菌泥；
[0118]
其中，mrs液体培养基ph为6.8～7.0，其配比表见表5；
[0119]
含有m15的发酵液体培养基ph为6.8～7.0，其配比表见表6，其中硫酸锌的浓度为0.05％；
[0120]
表5 mrs液体培养基配比表
[0121][0122][0123]
表6含有m15的发酵液体培养基配比表
[0124][0125]
s2.发酵乳杆菌lf028菌泥与保护剂a在4℃条件下进行1:1混匀形成混合物c，混合物c再与保护剂b在4℃条件下进行1:1混匀形成混合物d；
[0126]
其中，保护剂a为10％脱脂乳；
[0127]
保护剂b由0.4％海藻酸钠、10％海藻糖、5％麦芽糊精、6％蔗糖、0.5％维生素c和0.2％聚乙烯比咯烷酮复配而成；
[0128]
s3.采用滴制方法把混合物d逐步滴入置于冰水浴中的由20％氯化钙制成的定型液中，形成直径大小为2mm～4mm的晶珠，晶珠在定型液中固定半小时后捞出控液，放入已预冷完备的冷冻干燥机中，预冻3h后进行冷冻干燥，冷阱温度为-50℃，冷冻干燥46～50h得到冻干粉，即为发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉，记为样品α。
[0129]
(2)发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉的保藏稳定性研究
[0130]
本实施例制备的发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉采用双层包埋工艺，利用海藻酸钠和氯化钙形成的胶体，再冻干形成保护层，为了考察本实施例制备的发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉的保藏稳定性，进行了以下实验：
[0131]
首先根据现有技术中制备益生菌菌粉的常规工艺，制备对照样品，对照样品具体制备方法如下：
[0132]
取本实施例s1步骤制备的发酵乳杆菌lf028菌泥，与保护剂e在4℃条件下进行1:2混匀混合物f；
[0133]
其中保护剂e为现有技术中常规冻干保护剂，具体为：10％脱脂乳、10％海藻糖、5％麦芽糊精、6％蔗糖、维生素c和0.2％聚乙烯比咯烷酮；
[0134]
将混合物f立即放入已预冷完备的冷冻干燥机中，预冻3h后进行冷冻干燥，冷阱温度为-50℃，冷冻干燥46～50h得到冻干粉，所得冻干粉即为对照样品，记为对照样品β。
[0135]
收集样品α和对照样品β，进行活菌计数，菌粉活菌数在3.0
×
10
11
～6.0
×
10
11
cfu/g范围内即符合要求。
[0136]
依据《t/cnfia 001食品保质期通用指南》对样品α和对照样品β在25℃进行为期24
个月的稳定性试验跟踪研究，跟踪结果如图9所示。
[0137]
由图9可知：在25℃条件下，发酵乳杆菌lf028两种冻干粉进行活菌数稳定性研究，样品α衰减较慢，24个月后存活率为63.13％；对照样品β衰减较快，24个月后存活率仅为39.52％。实验结果表明本发明制备益生菌菌粉制备工艺对发酵乳杆菌lf028冻干后的活菌有很好地保护作用。
[0138]
(3)发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉对小鼠睡眠的影响
[0139]
本实施例还考察了发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉(样品α)对小鼠睡眠作用的影响，具体实验方法参考《保健食品功能检验与评价方法(2022年版)》及《保健食品功能检验与评价技术指导原则》中记载的有助于改善睡眠的功效学检验方法并进行适应性的改良，具体包含以下内容：
[0140]
选取60只体重20
±
2g的健康雄性昆明白小鼠，正常饲养适应环境7d后，于每天固定时间模型组与组连续2d腹腔注射400mg/kg对氯苯丙氨酸(pcpa)混悬液，pcpa混悬液为粉末加水配成30mg/ml即得，对照组注射等体积生理盐水，2d后观察各组状态，除对照组外小鼠出现昼夜紊乱、相互攻击等现象，表明失眠模型建立成功。
[0141]
实验小鼠随机分为六组，每组10只，分别为对照组、模型组、阳性给药组、低剂量组(发酵乳杆菌lf028活菌数3.0
×
10
10
cfu/g bw)、中剂量组(发酵乳杆菌lf028活菌数1.5
×
10
11
cfu/g bw)、高剂量组(发酵乳杆菌lf028活菌数3.0
×
10
11
cfu/g bw)，其中高剂量组为人体推荐量的10倍；造模2d结束后，各组进行给药，对照组与模型组连续15d生理盐水灌胃；阳性对照组连续15d艾司唑仑(0.1mg/kg bw)灌胃；低剂量组、中剂量组和高剂量组连续15d灌胃，给药剂量根据动物与人给药剂量换算。
[0142]
于造模前后及最后一次给药30mi n后将小鼠按分组放于自主活动仪中，适应环境3mi n，测定小鼠5mi n内活动与站立次数；最后一次给药1h后，按小鼠体重腹腔注射45mg/kg的钠，记录小鼠睡眠潜伏期与睡眠时间，在试验期间需保持安静。
[0143]
使用spss22.0处理数据，组间采用单因素方差分析，p《0.05表示有显著性差异，p《0.01表示有极显著性差异，实验期内不同组别小鼠自主活动统计表如表7所示，实验期内不同组别小鼠睡眠潜伏期及睡眠时间统计表如表8所示。
[0144]
表7实验期内不同组别小鼠自主活动统计表
[0145]
[0146][0147]
注：与同组小鼠造模前比较：*p《0.05，**p《0.01；与同组造模后比较：#p《0.05，##p《0.01。
[0148]
由表7数据可知，对照组小鼠实验前后活动正常，未出现波动。造模后，与同组造模前相比较，除对照组其他各组失眠小鼠活动次数与站立次数均表现为极著差异(p《0.01)。给药后，模型组与造模后相比较失眠小鼠活动次数与站立次数差异不显著；低剂量组与造模后相比较失眠小鼠活动次数与站立次数差异显著(p《0.05)；阳组、中剂量组和高剂量组与同组造模后相比较失眠小鼠活动次数与站立次数差异极显著(p《0.01)。
[0149]
表8实验期内不同组别小鼠睡眠潜伏期及睡眠时间统计表
[0150]
组别睡眠潜伏期(min)睡眠时间(min)对照组4.38
±
0.6142.63
±
3.09模型组10.53
±
1.48
**
19.25
±
4.75
**
阳组3.27
±
0.26
##
53.08
±
2.64
##
低剂量组7.74
±
0.75
#
28.81
±
3.06
#
中剂量组5.31
±
0.52
##
37.49
±
2.95
##
高剂量组4.29
±
0.59
##
45.08
±
3.17
##
[0151]
注：与对照组相比：*p《0.05，**p《0.01；与模型组相比：#p《0.05，##p《0.01
[0152]
由表8实验结果可知：与对照组相比，模型组小鼠睡眠潜伏期极显著增加(p《0.01)，睡眠时间极显著降低(p《0.01)，表明造模成功；与模型组相比，低剂量组小鼠睡眠潜伏期显著降低(p《0.05)，睡眠时间显著增加(p《0.05)；其余阳组、中剂量组和高剂量组小鼠睡眠潜伏期与睡眠时间均出现极显著差异(p《0.01)。表明发酵乳杆菌lf028对失眠小鼠具有缩短睡眠潜伏期，延长睡眠时间的作用。
[0153]
(4)发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉对小鼠焦虑症状的影响
[0154]
本实施例考察了发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉对小鼠焦虑症状的影响，具体方法如下：
[0155]
本实验按照美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理与使用指南》进行，选取体重为20g
±
2.5g的spf级健康小鼠40只，将适应性喂养1周后开始进行实验；
[0156]
用随机数字表分组法进行分组，分为4组，每组10只，分别为：对照组、模型组、阳性对照组和lf028组；除对照组，其他组进行实施慢性不可预见性动物应激(cums)，每日施予1种刺激，并灌胃给予对应的干预药物。
[0157]
分组与剂量设计：对照组和模型组每天灌胃给予200μl生理盐水；阳物选择氟西汀，氟西汀每日用生理盐水溶解成浓度为1.8mg/ml，阳性对照组每日灌胃给予氟西汀剂量为18mg/kg bw；lf028组为每日用生理盐水来溶解发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉(样品α)，令最终浓度为3.0
×
10
10
cfu/ml，制得lf028菌液，lf028组每日灌胃给予200μl上述
lf028菌液。每日给药时间为上午8:00～9:00，连续给药28d。
[0158]
其中，慢性不可预见性动物应激模型(cums)构建焦虑抑郁小鼠模型方法为：28天(4周)内随机接受7种不同方法的刺激，包括：斜笼45
°
、禁食水、夹尾、昼夜颠倒、频闪、束缚和湿垫料，每天随机给予1种刺激，连续3天不能施加相同的刺激，保证动物无法预期。
[0159]
28d后，所有小鼠均进行了连续4d的行为学测试，进行旷场实验、高架十字迷宫测试和强迫游泳实验。
[0160]
(a)旷场实验(open fieldtest，oft)
[0161]
所用实验动物在进行行为学检测之前每天给每只小鼠熟悉适应操作者的手和操作，每天3min。实验在安静的环境下进行，每次试验后用75％酒精擦拭行为箱，以免上一只小鼠的大小便或气味影响下次测试结果。小鼠行为采集使用高清摄像头，利用行为学软件对小鼠的行为视频进行跟踪分析，小鼠旷场实验活动时间统计图如图10所示，小鼠旷场实验活动频率统计图如图11所示。
[0162]
由图10-11可知，小鼠旷场实验中，小鼠在中心区域停留时间和中心区域活动频率两个测试中，对照组与模型组差异性显著(p《0.05),说明小鼠慢性不可预见性动物应激模型(cums)造模成功；两个测试中，阳性对照组与lf028组可以逆转cums的影响，增加小鼠在中心区域停留时间和活动频率，二者对比无显著差异性，但与模型组相比差异性显著(p《0.05)。
[0163]
(b)高架十字迷宫(elevatedplus maze，epm)测试
[0164]
epm测试小鼠的焦虑行为，把小鼠放在开臂和闭臂交叉的中间区域，头朝向一侧闭臂，摄像与计时同步，一共记录10min，并统计分析小鼠进入开臂的次数以及停留在开臂的时间，小鼠开臂停留时间统计图如图12所示，小鼠进入开臂次数统计图如图13所示。
[0165]
由图12-13可知，小鼠在进入开臂次数和在开臂停留时间两项测试中，对照组与模型组差异性显著(p《0.05)。两个测试中，阳性对照组与lf028组可以逆转cums的影响，增加小鼠进入开闭次数和在开臂停留时间，阳性对照组与lf028组两组对比无显著差异性，但与模型组相比差异性显著(p《0.05)。
[0166]
(c)强迫游泳实验(forced swim test，fst)
[0167]
将小鼠放入一个装有清净水的透明圆柱型玻璃缸中，水温为23℃～25℃，给小鼠创造一种无法逃避的压迫环境，开始拼命游泳挣扎力图逃脱，经过一段时间的努力，小鼠放弃逃脱的希望，表现出典型的漂浮不动的状态，即行为绝望状态。每只小鼠单独测试，测试时将小鼠轻轻放入水中，用摄像机记录游泳行为6min，通过行为学软件进行追踪分析视频图像，统计出在测试的后4min内小鼠的不动时间，不同组别小鼠的不动时间统计图如图14所示。
[0168]
由图14可知，模型组中，小鼠的不动时间明显增加，与对照组、阳性对照组与lf028组具有差异性显著(p《0.05)，而对照组、阳性对照组与lf028组三组比较无显著差异，说明阳性对照组中的氟西汀和发酵乳杆菌lf028均可改善cums诱导的小鼠绝望行为。
[0169]
综上实验数据表明，小鼠在食用发酵乳杆菌lf028菌粉一段时间后，改善了其焦虑症状，且与模型组对比均出现显著差异性(p《0.05)。
[0170]
(5)发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉对人体的焦虑症状的影响
[0171]
本实施例考察了发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉对人体焦虑症状的影响，具体
方法如下：
[0172]
实验共募集各年龄段人共72名试验者，试验者入选标准为：近期未使用过抗焦虑、抑郁药物；汉密尔顿抑郁量表(hamiltondepression scale，hamd)评分≥21分，汉密尔顿焦虑量表(hamilton anxiety scale，hama)评分≥14分。
[0173]
本次实验采用汉密尔顿焦虑指数(hama)进行对比分析，hama总分能较好的反映焦虑症状的严重程度，hama总分可以用来评价焦虑和抑郁障碍患者焦虑症状的严重程度和对各种药物、心理干预效果的评估。按照我国量表协作组提供的资料，hama总分超过29分，可能为严重焦虑；超过21分，肯定有明显焦虑；超过14分，肯定有焦虑；超过7分，可能有焦虑；如小于7分，便没有焦虑症状。
[0174]
参与试验者食用发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉样品1，食用剂量为2g/次，一日三次，餐后半小时服用，为期2周，统计食用发酵乳杆菌lf028益生菌菌剂前后的hama总分。
[0175]
其中，样品1的制备方法为使用低聚果糖将本实施例制备的发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉(即样品α)稀释到活菌数为3.5
×
10
10
cfu/g，即得样品1；
[0176]
食用发酵乳杆菌lf028益生菌菌剂前后hama总分统计表如表9所示。
[0177]
表9食用发酵乳杆菌lf028益生菌菌剂前后hama总分统计表
[0178][0179]
由表可知，参与试服的72名试验者中有65名有显著体感，焦虑指数下降，总体有效率达90.28％。所有试服者食用前焦虑指数(hama)均值为23.06，食用后焦虑指数(hama)均值为11.35，说明发酵乳杆菌lf028能缓解焦虑症状，提高人们生活质量。
[0180]
实施例3～7发酵乳杆菌lf028复配型益生菌菌粉
[0181]
实施例3～7分别为一种发酵乳杆菌lf028复配型益生菌菌粉，其制备方法如下：首先制备植物乳杆菌lz010纯种益生菌菌粉、鼠李糖乳杆菌gs014纯种益生菌菌粉、乳双歧杆菌br001纯种益生菌菌粉，其制备方法依照实施例2中发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉(样品α)的制备方法，不同之处在于所活化的菌种依次为植物乳杆菌lz010、鼠李糖乳杆菌gs014、乳双歧杆菌br001，制得的植物乳杆菌lz010纯种益生菌菌粉、鼠李糖乳杆菌gs014纯种益生菌菌粉和乳双歧杆菌br001纯种益生菌菌粉依次记为样品2、样品3和样品4，其中植物乳杆菌lz010、鼠李糖乳杆菌gs014和乳双歧杆菌br001的菌种均为市售产品；另外，根据实施例2提供的方法再次制备发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉，记为样品5。经检测计数，样品2～5的活菌数依次为8.0
×
10
11
cfu/g、1.0
×
10
10
cfu/g、3.0
×
10
11
cfu/g和4.0
×
10
11
cfu/g。
[0182]
选择样品2～4中的至少一种，与样品5复配，制得发酵乳杆菌lf028复配型益生菌菌粉。实施例3～7制备的发酵乳杆菌lf028复配型益生菌菌粉的原料配比表如表10所示。
[0183]
表10实施例3～7中原料配比表
[0184][0185][0186]
实施例3～7制得的发酵乳杆菌lf028复配型益生菌菌粉的总活菌数依次为6.0
×
10
11
cfu/g、2.7
×
10
11
cfu/g、1.2
×
10
11
cfu/g、5.0
×
10
11
cfu/g和3.0
×
10
10
cfu/g。
[0187]
实施例8发酵乳杆菌lf028在发酵食品中的应用
[0188]
本实施例提供了以发酵乳杆菌lf028为发酵剂制备发酵食品的方法，所述发酵食品包括发酵乳制品、发酵豆制品、发酵果蔬制品和发酵谷物制品，具体制备方法如下。
[0189]
(1)发酵乳杆菌lf028在发酵乳制品中的应用
[0190]
发酵乳杆菌lf028在制备凝固型发酵乳制品时按照以下步骤进行：
[0191]
s1.称取生牛乳10kg，进行标准化，加入5g硫酸锌、0.8kg阿拉伯糖混合均匀后至于调配罐中，制得物料1；
[0192]
s2.将物料1在70℃、20mpa条件下均质10min，在90～95℃杀菌5～10min，制得物料2；
[0193]
s3.将物料2迅速降温至35～39℃，按0.01％接种量接入样品α，灌装，加盖，在37℃下发酵至凝乳，凝乳状态良好、ph至4.2～4.5时为发酵终点，停止发酵，迅速放入2～6℃冷藏室，后熟12h，即得以发酵乳杆菌lf028为发酵剂制备的凝固型发酵乳(即酸奶)，记为样品γ。
[0194]
(2)发酵乳杆菌lf028在发酵豆制品中的应用
[0195]
发酵乳杆菌lf028在制备发酵豆制品时按照以下步骤进行：
[0196]
s1.取豆浆粉原料2.3kg，加入纯净水7.7kg，硫酸锌5g，与1.0kg阿拉伯糖混合均匀，制得物料4；
[0197]
s2.将物料4在70℃、20mpa条件下均质10min，在90～95℃杀菌5～10min，制得物料5；
[0198]
s3.将物料5迅速降温至37℃，按0.01％的接种量接种样品α，灌装，加盖，在37℃发酵室发酵16h后，迅速冷却降温4℃后熟保持12h左右，制得以发酵乳杆菌lf028为发酵剂制备的酸豆奶，记为样品δ。
[0199]
(3)发酵乳杆菌lf028在发酵果蔬制品中的应用
[0200]
本实施例以果蔬(胡萝卜、梨等)为原料，使用发酵乳杆菌lf028发酵菌剂制备发酵果蔬制品，具体方法如下：
[0201]
s1.取果蔬原料5kg，加入纯净水5kg，硫酸锌5g，与1.0kg阿拉伯糖混合均匀，制得物料6；
[0202]
s2.将物料6在70℃、20mpa条件下均质10min，在90～95℃杀菌5～10min，制得物料6；
[0203]
s3.将物料6迅速降温至37℃，按接种量0.01％接种样品α，灌装，加盖，在37℃发酵室发酵16h后，迅速冷却降温4℃后熟保持12h左右，制得以发酵乳杆菌lf028为发酵剂制备的发酵果蔬制品，记为样品ε。
[0204]
(4)发酵乳杆菌lf028在发酵谷物制品中的应用
[0205]
本实施例以谷物(大米、小米等)为原料，使用发酵乳杆菌lf028发酵菌剂制备发酵谷物制品，具体方法如下：
[0206]
s1.取大米粉、小米粉按照质量比为1:1混合而成的谷物1kg，加入纯净水8kg，硫酸锌5g，与1.0kg阿拉伯糖混合均匀熬制成粥，制得物料7；
[0207]
s2、将发酵乳杆菌lf028纯种发酵菌剂左右接种至物料7中，灌装，加盖，在37℃发酵室中，发酵16h，迅速冷却降温4℃后熟保持12h左右，制得发酵粥；
[0208]
s3.将物料7在无菌条件下降温至37℃，按0.01％的接种量接种样品α，灌装，加盖，在37℃发酵室发酵16h后，迅速冷却降温4℃后熟保持12h左右，制得以发酵乳杆菌lf028为发酵剂制备的发酵粥，记为样品ζ。
[0209]
(5)人睡眠实验
[0210]
为了考察本实施例发酵乳杆菌lf028发酵制备的发酵食品改善睡眠的作用，进行了人睡眠实验，具体方法如下：
[0211]
选取睡眠障碍试验者150例；其中睡眠障碍试验者入选标准为：年龄20～75岁，有睡眠障碍的身体健康的人员；
[0212]
将试验者随机分为对照组、酸奶组、酸豆奶组、发酵果蔬制品组、发酵谷物制品组，其中对照组正常饮食，晚饭后食用200ml纯牛奶，酸奶组、酸豆奶组、发酵果蔬制品组、发酵谷物制品组每天晚饭时各依次食用样品γ、样品δ、样品ε和样品ζ各200克(约为一粥碗量)。食用2周后对试验者进行回访，其结果如表11、表12所示。
[0213]
表11发酵乳杆菌lf028发酵食品对失眠人的影响
[0214]
组别试服人数有效人数有效率对照组30930％酸奶组302996.7％酸豆奶组302790％发酵果蔬制品组302686.7％发酵谷物制品组302893.3％
[0215]
由表11数据可知：对照组有效率为30％，其他各试验组有效率均达到85％以上；其中，酸奶组效果最好，有29人出现明显效果，有效率达96.7％；发酵果蔬制品组在四个实验组中效果相对较差，有4人没有效果，有效率为86.7％。上述实验表明，发酵乳杆菌lf028发酵食品对失眠人改善睡眠的效果总体较好，有效率在85.0％以上，最高有效率为96.7％。
[0216]
表12各试验组睡眠效果数据
[0217]
[0218][0219]
由表12数据可知：对照组未出现变化，其他各试验组通过发酵食品试吃，睡眠时间从原来的5小时左右增加到7小时以上，睡眠质量都有所改善，入睡时间缩短，起夜多梦现象减少；其中酸奶组效果最好，平均睡眠时间达到8.5小时，入睡时间块，无起夜多梦现象。
[0220]
本次试服试验进行一个月后，再次对各试验组试验者进行回访采用匹斯堡睡眠质量指数(psqi)调查问卷统计结果如图15所示。
[0221]
匹斯堡睡眠质量指数(psqi)反应了最近一个月的睡眠质量，入睡时间，睡眠时间，睡眠效率，睡眠障碍，催眠药物，日间功能障碍等指标的情况。
[0222]
评分等级：0-5分：睡眠质量很好；5-10分：睡眠质量还行；11-15分：睡眠质量一般；16-21分：睡眠质量很差。
[0223]
由图15可知：各组试验者在食用样品前psqi指数均偏高，在15以上；在食用样品一个月以后除对比组外，其他各组试验者psqi指数均下降，其中酸奶组的psqi指数下降了83.07％，酸豆奶组的psqi指数下降了76.27％，发酵果蔬组的psqi指数下降了71.42％，发酵谷物组的psqi指数下降了82.38。由此可知试酸奶组的食用效果最好，四组实验组对失眠人都能起到很好的作用。
[0224]
综上所述，发酵乳杆菌lf028发酵食品可以有效改善失眠人睡眠质量、缩短入睡时间、减少起夜多梦现象、降低psqi指数，具有较好的改善睡眠的作用。
[0225]
鉴于发酵乳杆菌lf028具有改善睡眠的功能，可将发酵乳杆菌lf028的发酵上清液及益生菌菌粉作为食品、保健食品、膳食补充剂或药品的原料，按照现有技术中益生菌的常规应用方法进一步用于制备保健食品、膳食补充剂或药品。
[0226]
鉴于发酵乳杆菌lf028具有缓解焦虑的功能，可将发酵乳杆菌lf028的发酵上清液及益生菌菌粉作为食品、膳食补充剂或药品的原料，按照现有技术中益生菌的常规应用方法进一步用于制备食品、膳食补充剂或药品。

技术特征：

1.发酵乳杆菌lf028在产γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，所述应用中发酵乳杆菌lf028的发酵培养基中硫酸锌的浓度为0.01%~0.05%。2.发酵乳杆菌lf028在制备具有改善睡眠和/或缓解焦虑作用的发酵上清液或益生菌菌粉中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述益生菌菌粉包括发酵乳杆菌lf028纯种益生菌菌粉和包含发酵乳杆菌lf028的复配型益生菌菌粉。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述益生菌菌粉的制备方法包括依次进行的以下步骤：s1.将发酵乳杆菌lf028发酵液离心，制得菌泥；s2.将菌泥与保护剂a混匀制得混合物c，混合物c与保护剂b混匀，制得混合物d；s3.将混合物d滴入定型液中形成晶珠，冷冻干燥，即得所述益生菌菌粉。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述保护剂a为10%脱脂乳溶液；保护剂b由0.4%海藻酸钠、10%海藻糖、5%麦芽糊精、6%蔗糖、0.5%维生素c和0.2%聚乙烯比咯烷酮复配而成；定型液为20%氯化钙溶液。6.根据权利要求3~5中任一项所述的应用，其特征在于，所述益生菌菌粉的活菌数为3
×
10
10
~6
×
10
11
cfu/g。7.发酵乳杆菌lf028在制备具有改善睡眠作用的发酵食品中的应用。

技术总结

本发明公开了发酵乳杆菌LF028在产γ-氨基丁酸及其在制备改善睡眠、缓解焦虑产品中的应用，本发明发现培养基中适宜的硫酸锌浓度，可显著提高发酵乳杆菌LF028的产γ-氨基丁酸的能力；本发明还发现发酵乳杆菌LF028具有良好的改善睡眠和缓解焦虑的作用，可将该菌的发酵上清液或益生菌菌粉进一步用于改善睡眠和（或）缓解焦虑相关食品、保健食品、膳食补充剂或药品的制备。同时本发明通过改进益生菌菌粉制备工艺，可提高货架期内菌粉中的益生菌的活性，为更好地应用发酵乳杆菌LF028制备相关产品奠定基础。本发明可应用于生产γ-氨基丁酸以及改善睡眠和/或缓解焦虑相关产品的制备。以及改善睡眠和/或缓解焦虑相关产品的制备。