一株嗜吡啶红球菌RL-GZ01菌株及其应用

一株嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，更具体地，涉及一株嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株及其应用。

背景技术：

2.增塑剂是塑料制备过程中常用的添加剂，主要有邻苯二甲酸酯类(phathalic acid esters，paes)等种类，paes中又有多种不同的物质，如邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二正辛酯和邻苯二甲酸丁基苄酯，这些化学物质与聚合物连接是通过弱的次级键实现的，因此容易从塑料制品脱离、渗透到环境中。塑料制品因具有良好的物理化学特性和较低的使用成本被广泛应用于人类生产生活中的各个领域，但是随着填埋或丢弃在环境中的塑料越来越多，更多的增塑剂被释放到环境中。据研究，paes能干扰生物的内分泌系统，引起精子数量减少、精子形成中止、生殖能力下降、子宫粘膜组织增生等疾病的发生；如邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯具有较强的发育毒性，还具有神经毒性、致多器官癌变等毒性，可见增塑剂的残留给人类和自然界的其它生物都会造成不小的危害。
3.paes因其在自然环境中的光解、水解效率很低，其降解主要通过好氧与厌氧细菌的生物降解进行。目前，已经从包括红树林、土壤、人工湿地、河流与废水处理厂的活性污泥、堆肥修复样品、重金属污染土壤等各类环境中分离得到大量高效的paes降解菌株，这些菌株主要有鞘氨醇菌、戈登氏菌、分枝杆菌、红球菌等。如cn111575197a公开了一种对邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二正辛酯具有清除能力的嗜吡啶红球菌xb，但该菌株对邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二正辛酯的清除能力分别仅有27.5％和21.2％，清除效果并不理想。且目前分离得到的paes降解菌株绝大部分来源于陆地，仅有少数几株属于海洋微生物，对于海洋生态系统中paes命运归趋及生态修复研究相对较少。分离获得可高效降解paes的海洋微生物对于了解paes在海洋生态系统中的转化机制、建立paes污染海域生物修复技术意义重大。
4.此外，环境中的氮污染主要是由无机氮和有机氮引起的，无机氮主要包括氨氮(nh
4+-n)、硝态氮(no
3-‑
n)、亚硝态氮(no
2-‑
n)，主要来源于城市生活污水经处理后排放的废水、制肥厂排放的废水等；有机氮主要包括尿素、蛋白质、有机碱等，主要来源于制革工业、印染工业、农业生产过程中农药的流失和牲畜的类便等。目前主要通过生物脱氮技术进行脱氮，根据工艺技术以及脱氮菌的不同分为传统生物脱氮技术和新型生物脱氮技术。传统生物脱氮工艺中，一般将硝化、反硝化这两个过程分开进行，即将养殖废水经过氨化作用后，先进入好氧区进行硝化作用，然后再流入具有反硝化细菌的缺氧区进行反硝化作用。近年来，涌现出了越来越多的新型生物脱氮技术，如短程硝化反硝化脱氮、厌氧氨氧化、同步硝化-反硝化脱氮等，相比于传统生物脱氮具有许多优点，如可以在同一个空间实现硝化与反硝化等。现有技术提供了一株具有同步硝化和反硝化作用的、可应用于新型生物脱氮技术的嗜吡啶红球菌cpz-24菌株，但是该菌株对硝态氮的清除能力仅为66.74％。选出新型脱
氮微生物异养硝化好氧反硝化菌，对脱氮及环境保护相当重要，有利于生境的可持续发展。
5.总磷也会对环境造成严重污染，总磷分为无机磷和有机磷，无机磷包括磷酸盐、聚磷酸盐等，有机磷则主要指的是包含在蛋白质等生物成分中的磷元素。环境中氮磷的积累均会造成水体富营养化，进而严重影响生态平衡，甚至威胁人类和水生动物的健康，增加水处理的成本。生物处理法被广泛地应用于环境中总磷的清除，相对于传统物理法和化学法，生物处理法具有成本低、高效和次生污染少等优点。生物处理法主要是通过微生物自身生长代谢吸收污水中的磷，在短时间内聚集超过自身生长所需要的磷并储存于细胞内，达到除磷的目的。现有技术提供了一种对磷酸盐具有清除能力的赤红球菌hdrr2y菌株，该菌株对磷酸盐的平均去除率为36.3～44.9％，对磷酸盐的降解效果不理想，因此除磷菌的分离、开发以及实际应用对富营养化水体的修复至关重要。
6.因此，寻一种不仅能降解paes，还能清除氮磷的微生物菌株，对于修复环境具有相当的必要性。

技术实现要素：

7.本发明针对现有技术的不足，旨在提供一株嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株及其应用，同时实现对环境中邻苯二甲酸酯类物质、总氮、总磷的高效清除，修复被污染的环境。
8.本发明的首要目的在于提供一株嗜吡啶红球菌(rhodococcuspyridinivorans)rl-gz01菌株。
9.本发明的另一目的是提供所述嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在降解邻苯二甲酸酯类物质和/或修复邻苯二甲酸酯类物质污染的环境中的应用。
10.本发明的又一目的是提供所述嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在清除总氮和/或修复氮污染的环境中的应用。
11.本发明的又一目的是提供所述嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在清除总磷和/或修复磷污染的环境中的应用。
12.本发明的又一目的是提供所述的嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在制备降解邻苯二甲酸酯类物质和/或清除总氮和/或清除总磷的产品中的应用。
13.本发明的又一目的是提供一种菌剂。
14.本发明的又一目的是提供一种生物清洁剂。
15.本发明的又一目的是提供一种生物降解剂。
16.本发明提供了一株嗜吡啶红球菌(rhodococcuspyridinivorans)rl-gz01菌株，该菌株于2022年4月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：62401，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
17.嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株为革兰氏阳性菌株；菌体为杆状，无鞭毛，无芽孢；菌落形态呈橙、圆形，边缘光滑，表面有突起；硫化氢反应表现为阳性；反硝化实验出现明显蓝，呈阳性；接触酶试验中产生大量气泡，表现为阳性；脲酶试验也表现为阳性；v-p、甲基红、吲哚、明胶、葡萄糖发酵试验均表现为阴性；对amp、kan、四环素均不具有抗性。
18.本发明从广东省湛江市海滨公园的潮间带红树林收集的淤泥中分离得到嗜吡啶红球菌(rhodococcuspyridinivorans)rl-gz01菌株，该嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株能够在12小时内将100mg/l的邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸丁基苄酯、邻苯二甲酸二乙酯和邻
苯二甲酸二甲酯彻底降解，在24小时内将100mg/l的邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二正辛酯彻底降解。基于此，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在降解邻苯二甲酸酯类物质和/或修复邻苯二甲酸酯类物质污染的环境中的应用也在本发明的保护范围内。
19.优选地，所述邻苯二甲酸酯类物质为邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二正辛酯、邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸丁基苄酯、邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二甲酯中的一种或几种。
20.嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株具备有氧异养硝化氨氮(nh
4+-n)的能力，和好氧反硝化硝态氮(no
3-‑
n)、亚硝态氮(no
2-‑
n)的能力：在只含有氨氮、亚硝态氮或者硝态氮的氮源培养基中培养嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株72小时后，nh
4+-n、no
2-‑
n、no
3-‑
n的脱氮率分别可达到93.6％、77.3％、77.0％。在含有100mg/l dehp的含氮培养基中，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株可彻底清除dehp，且对nh
4+-n、no
2-‑
n的脱氮率高达95.0％、100％。基于此，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在清除总氮和/或修复氮污染的环境中的应用也应在本发明的保护范围内。
21.优选地，所述氮为无机氮。
22.进一步优选地，所述无机氮为nh
4+-n、no
2-‑
n或no
3-‑
n的一种或几种。
23.在同时含有dehp、氮磷的城市废水中培养12h后，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株可将浓度为5mg/l的dehp彻底清除；培养84h后，对城市废水中总氮的清除率达到95.4％，总磷从10.89mg/l降至2.37mg/l左右，表明嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株不仅可以有效降解paes，还可以有效清除环境中的氮和磷；在降解nh
4+-n的过程中，没有出现no
2-‑
n或no
3-‑
n的积累，表明嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株具有同步硝化和反硝化的能力，能有效修复同时被paes和氮磷污染的环境，因此，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在清除总磷和/或修复磷污染的环境中的应用，以及嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在制备降解邻苯二甲酸酯类物质和/或清除总氮和/或清除总磷的产品中的应用均应在本发明的保护范围内。
24.优选地，所述总磷为无机磷。
25.优选地，所述产品为菌剂、生物清洁剂、生物降解剂中的一种或多种。
26.因此，本发明还提供了一种菌剂、生物清洁剂、生物降解剂，含有所述的嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株和/或其菌液。
27.本发明具有以下有益效果：
28.本技术筛选分离得到嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株，该菌株能够在12小时内彻底降解100mg/l的dbp、bbp、dep、dmp，在24小时内彻底降解100mg/l的dehp、dchp、dnop，对邻苯二甲酸酯类物质具有优异的降解能力；对nh
4+-n、no
2-‑
n、no
3-‑
n的脱氮率分别可达到93.6％、77.3％、77.0％，在含有的dehp的含氮培养基中，对nh
4+-n、no
2-‑
n的脱氮率提升至了95.0％、100％，并且同时保持对dehp的彻底降解能力；嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株具有同步硝化和反硝化的能力，能有效修复同时被paes和氮磷污染的环境。
附图说明
29.图1为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在电镜下的形态结构图。
30.图2为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株的菌落形态。
31.图3为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株的系统发育树。
32.图4a为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对不同paes的降解情况，图4b为不加菌对照组的paes浓度。
33.图5为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对不同氮源的脱氮情况。
34.图6为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在含100mg/l dehp的不同氮源培养基中的脱氮情况。
35.图7为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在含100mg/l dehp的不同氮源培养基中对dehp的降解情况。
36.图8为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在20mg/l、60mg/l、200mg/l的nh
4+-n浓度下对不同浓度的dehp的降解曲线。
37.图9为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在500mg/l的nh
4+-n浓度下对不同浓度的dehp的降解曲线。
38.图10为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在不同浓度dehp的条件下对浓度为20mg/l的nh
4+-n的脱氮情况。
39.图11为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在不同浓度dehp的条件下对浓度为60mg/l的nh
4+-n的脱氮情况。
40.图12为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在不同浓度dehp的条件下对浓度为200mg/l的nh
4+-n的脱氮情况，图中ck1表示dehp浓度为5mg/l时不加菌的对照组，ck2表示dehp浓度为20mg/l时不加菌的对照组，ck3表示dehp浓度为50mg/l时不加菌的对照组。
41.图13为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在不同浓度dehp的条件下对浓度为500mg/l的nh
4+-n的脱氮情况，图中ck1表示dehp浓度为5mg/l时不加菌的对照组，ck2表示dehp浓度为20mg/l时不加菌的对照组，ck3表示dehp浓度为50mg/l时不加菌的对照组。
42.图14为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对实验城市废水中cod值影响的实验结果。
43.图15为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对实验城市废水中tp的降解情况。
44.图16为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对实验城市废水中tn、nh
4+-n、no
3-‑
n、no
2-‑
n的去除情况。
45.图17为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对实验城市废水中dehp的降解情况。
具体实施方式
46.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
47.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
48.无机盐培养基(msm)：1.0g/l nh4no3，20g/l nacl，0.5g/l(nh4)2so4，0.05g/l cacl2，0.5g/l kh2po4和1.5g/l k2hpo4，ph＝7.0
±
0.2。
49.lb培养基：10.0g/l蛋白胨，5.0g/l nacl，10.0g/l酵母提取物，ph＝7.0
±
0.2。
50.固体培养基为相应的培养基中加入按15g/l的比例加入琼脂制备得到。
51.异养硝化培养基(hnm)(每升蒸馏水)：(nh4)2so
4 0.66g，琥珀酸钠4.72g，kh2po
4 0.50g，na2hpo
4 0.50g，mgso4·
7h2o 0.20g，nacl 30.00g，微量元素溶液2.00ml，ph＝7.5。
52.亚硝酸盐反硝化培养基(ndm)(每升蒸馏水)：nano
2 0.28g，琥珀酸钠3.16g，
mgso4·
7h2o 0.20g，cacl
2 0.01g，edta 0.07g，kh2po
4 0.50g，na2hpo
4 0.50g，feso
4 0.01g，微量元素溶液2.00ml，ph＝7.5。
53.反硝化培养基(dm)(每升蒸馏水)：kno
3 1.00g，琥珀酸钠4.68g，mgso4·
7h2o 0.20g，cacl
2 0.01g，edta 0.07g，kh2po
4 0.50g，na2hpo
4 0.50g，feso
4 0.01g，nacl 30.00g，微量元素溶液2.00ml，ph＝7.5。
54.微量元素溶液(每升蒸馏水)：edta
·
2na 57.10g，znso4·
7h2o 3.90g，cacl2·
2h2o 7.00g，mncl2·
4h2o 1.00g，feso4·
7h2o 5.00g，(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 1.10g，cuso4·
5h2o 1.60g，cocl2·
6h2o 1.60g，ph6.0，121℃灭菌30min获得。
55.nh
4+-n、no
3-‑
n、no
2-‑
n氮元素的测定与分析方法均参考于国标：nh
4+-n的测定与分析根据《水质-氨氮的测定-纳氏试剂分光光度法》(gb hj535-2009)；no
3-‑
n的测定与分析根据《水质-硝酸盐氮的测定-紫外分光光度法》(gb hj/t346-2007)；no
2-‑
n的测定与分析根据《水质-亚硝酸盐氮的测定-分光光度法》(gb 7493-87)。
56.总磷的检测方法用钼酸铵法；化学需氧量(cod)的检测方法用铬法；总氮(tn)的检测方法用纳氏试剂法。
57.以下实施例中邻苯二甲酸酯类物质浓度检测的步骤为：
58.(1)萃取：向样品中加入等体积正己烷，超声波振荡(40khz)抽提10min，静置1小时，取上层有机溶剂经0.22μm的有机系滤膜过滤。
59.(2)气相谱仪检测邻苯二甲酸酯类物质的浓度：
60.a.气相谱仪检测条件：
61.谱柱为wondacap 5谱柱(gl sciences inc，japan.25mm
×
30m
×
0.25μm)；
62.检测器为电子捕获检测器(electron capture detector，ecd)；
63.样品进样量为1μl，按分流比49：1分流进样；
64.进样室温度为300℃；
65.柱温恒定为280℃；
66.检测器温度为300℃；
67.载气为高纯氮气(99.999％)；
68.载气流速为2ml/min；
69.通过软件labsolutions(version 5.90，shimadzu，japan)获取并分析数据。
70.b.标准曲线的建立方法：
71.采用外标法建立邻苯二甲酸酯类物质浓度与检测峰面积之间关系的标准曲线。准确配制浓度为20mg/l、40mg/l、60mg/l、80mg/l和100mg/l的邻苯二甲酸酯类物质标准品，每个浓度各3份，按上述气相谱仪检测条件对每个浓度的标准品进行检测，从而建立标准品浓度与峰面积之间的标准曲线，拟合结果如表1所示。
72.表1标准曲线拟合结果
[0073][0074][0075]
(3)邻苯二甲酸酯类物质的降解率通过以下公式进行计算：
[0076][0077]
实施例1菌株的分离、鉴定和保藏
[0078]
一、菌株的分离
[0079]
步骤一：从广东省湛江市海滨公园的潮间带红树林采集污泥，采集后用棕样品瓶封装，做好标记，放4℃冰箱保存备用。
[0080]
步骤二：通过唯一碳源法富集细菌，具体为，以终浓度为100mg/l的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(dehp)为唯一碳源，从保存的淤泥中称取5g样品添加到50ml含100mg/l dehp的msm培养基中，置于摇床中于30℃、180rpm的条件下培养5天，得富集培养液1。
[0081]
步骤三：按10％(v/v)的比例取步骤二的富集培养液1接入10ml含有200mg/l的dehp的msm培养基中，置于摇床中于30℃、180rpm的条件下培养5天，得富集培养液2。
[0082]
步骤四：按10％(v/v)的比例取步骤三的富集培养液2接入10ml含有500mg/l的dehp的msm培养基中，置于摇床中于30℃、180rpm的条件下培养5天，得富集培养液3。
[0083]
步骤五：取步骤四的富集培养液3 1ml作为保留菌液，以保存菌种；剩余9ml用正己烷按1：1(v/v)的比例萃取，使用气相谱仪检测dehp浓度并计算dehp降解率，结果显示降解率大于95％。
[0084]
步骤六：将步骤五的富集培养液对应的保留菌液放置离心机，以5000rpm离心5min，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤细胞沉淀，重复三次离心和洗涤。将细胞重悬于1ml msm液体培养基中，然后，将细胞悬浮液涂布在含有500mg/l dehp和0.01g/l吐温80的固体msm培养基上，在30℃下培养，并每天检查菌落情况。
[0085]
步骤七：挑选固体msm培养基上具有水解晕圈的生长良好的单菌落分别至10ml的lb富集培养基中培养24小时，分别取1ml培养液于5000rpm的转速下离心5min，收集得到菌体，用pbs缓冲液冲洗，重复三次离心和洗涤后，将菌体接种至10ml含100mg/l dehp的msm培养基中，30℃、180rpm下震荡培养5天；
[0086]
步骤八：分别保留1ml菌液，剩下9ml用正己烷按1：1(v/v)的比例萃取，再次用气相谱仪检测dehp的降解率。
[0087]
步骤九：根据步骤八气相谱检测结果，取dehp降解率大于95％的样品的保留菌
液放置离心机，以5000rpm离心5min，用磷酸盐缓冲液(pbs)洗涤细胞沉淀，重复三次离心和洗涤。将细胞重悬于1ml msm液体培养基中，然后，将细胞悬浮液涂布在含有500mg/l dehp和0.01g/l吐温80的固体msm培养基上，在30℃下培养，并每天检查菌落情况。
[0088]
步骤十：先重复步骤七、八、九纯化两次菌株，再重复步骤七、八纯化一次菌株，从步骤八得到的结果中，发现有一株菌株在三次纯化平板中测得的dehp降解率均为100％，降解能力稳定，菌落单一，将其命名为菌株rl-gz01。
[0089]
二、菌株rl-gz01的形态学特征
[0090]
在电镜下观察菌株rl-gz01的形态学特征，结果如图1所示，可见，该菌菌体为杆状，无鞭毛，无芽孢。
[0091]
菌株rl-gz01的菌落形态如图2所示，可见，菌落呈橙、圆形，边缘光滑，表面有突起。
[0092]
三、菌株rl-gz01的生理生化特征
[0093]
rl-gz01为革兰氏阳性菌株；硫化氢反应中呈现黑，表现为阳性；反硝化显平板中，出现明显蓝，呈现阳性；接触酶试验中产生大量气泡，也表现为阳性；脲酶试验也表现为阳性；v-p、甲基红、吲哚、明胶、葡萄糖发酵试验未出现对应的阳性反应现象，为阴性。在抗生素抗性试验中，将分别滴有amp、kan、四环素无菌圆形滤纸片放置于经涂布平板法涂满了菌株rl-gz01的lb培养基中间，平板放置于30℃恒温培养箱中培养数天，观察平板，绕圆滤纸片周围一圈未长菌，表明菌株对amp、kan、四环素均不具有抗性。菌株rl-gz01生理生化鉴定如表2所示。
[0094]
表2菌株rl-gz01生理生化鉴定结果
[0095][0096][0097]
四、菌株rl-gz01的16s rrna基因鉴定
[0098]
将菌株rl-gz01接种到lb培养基中，于30℃、180rpm条件下培养12h，取1ml菌液，离
心收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒(takaraminibest bacterial genomic dna extaction kit ver.3.0)提取细菌基因组dna，得到的基因dna用0.8％琼脂糖凝胶电泳进行检测，并用微量分光光度计(micro drop，bio-dl，中国)测定基因组dna浓度，将获得的基因组dna于-20℃保存备用。
[0099]
设计用于扩增16s rdna序列的一对通用引物：(27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r：5'-ggttaccttgttacgactt-3')。
[0100]
使用premix taqtm dna聚合酶(takara，日本)，以提取的菌株rl-gz01基因组dna为模板进行pcr扩增，pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用dna纯化回收试剂盒(takaraminibest agarose gel dna extaction kit ver.4.0)纯化，连接到pmd19-t载体上，转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中，涂布到含有0.1％(v/v)氨苄青霉素的lb固体培养基平板上，在37℃下培养12h，挑取白菌落至液体lb培养基中，在37℃、180rpm的条件下振荡培养12h，用质粒提取试剂盒(takaraminibest plasmid purification kit ver.4.0)提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。将测序结果在ncbi网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行blast比对分析，并利用mega软件(版本：7.0)构建系统发育树，结果如图3所示。
[0101]
综合菌体形态、生理生化特性、16s rrna基因序列，菌株rl-gz01被鉴定为嗜吡啶红球菌(rhodococcuspyridinivorans)，将该菌株命名为嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株。
[0102]
五、菌株保藏
[0103]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株于2022年4月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：62401，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
[0104]
实施例2菌株rl-gz01对邻苯二甲酸酯类物质的降解性能
[0105]
一、实验方法
[0106]
(1)制备种子液：从lb平板中挑取嗜吡啶红球菌rl-gz01单菌落至lb液体培养基中30℃振荡培养直到od
600
＝1.5，得到种子液。
[0107]
(2)邻苯二甲酸酯类物质的降解实验：
[0108]
取od
600
＝1.5的嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株种子液200μl，在5000rpm的条件下离心4min，收集细菌沉淀，再用200μl pbs充分悬浮，重复离心和悬浮操作3次，依次加入到以邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、邻苯二甲酸二环己酯(dchp)、邻苯二甲酸二正辛酯(dnop)、邻苯二甲酸丁基苄酯(bbp)、邻苯二甲酸二正丁酯(dbp)、邻苯二甲酸二乙酯(dep)、邻苯二甲酸二甲酯(dmp)中的其中一种为唯一碳源的10ml的msm培养基中，上述邻苯二甲酸酯类物质的终浓度均为100mg/l，随后在30℃恒温摇床，黑暗条件下培养60h。
[0109]
设置不加菌的对照组(以paes为唯一碳源的msm培养基)，所有试验都设置3个重复。
[0110]
每隔12h检测paes的浓度，并绘制paes浓度柱状图。
[0111]
二、实验结果
[0112]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对不同paes的降解情况如图4a所示，对照组的paes浓度如图4b所示，可见，培养12h时，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株可将100mg/l的邻苯二甲酸二正丁酯(dbp)、邻苯二甲酸丁基苄酯(bbp)、邻苯二甲酸二乙酯(dep)和邻苯二甲酸二甲酯(dmp)彻底降解；培养24h时，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株可将100mg/l的邻苯二甲酸二(2-乙
基已基)酯(dehp)、邻苯二甲酸二环己酯(dchp)、邻苯二甲酸二正辛酯(dnop)彻底降解。
[0113]
上述结果表明，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株具有彻底降解邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二正辛酯、邻苯二甲酸丁基苄酯、邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、邻苯二甲酸二甲酯的能力。
[0114]
实施例3菌株rl-gz01的脱氮性能
[0115]
一、实验方法
[0116]
(1)制备种子液：从lb平板中挑取单菌落至lb液体培养基中30℃振荡培养直到od
600
＝1.5，得到种子液。
[0117]
(2)脱氮实验：
[0118]
取od
600
＝1.5的嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株种子液200μl，在5000rpm的条件下离心4min，收集菌体，再分别用1ml hnm培养基、ndm培养基、dm培养基充分悬浮，重复离心和悬浮操作3次，再分别补充200ml相应培养基，在30℃恒温摇床，黑暗条件中培养72h。
[0119]
设置三组不加菌的对照组(分别为hnm培养基、ndm培养基、dm培养基)，所有试验都设置3个重复。
[0120]
每隔12h检测各培养基中nh
4+-n、no
2-‑
n、no
3-‑
n的浓度，并绘制氮含量柱状图。
[0121]
二、实验结果
[0122]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对不同氮源的清除情况如图5所示，可见，培养72小时，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对nh
4+-n、no
2-‑
n、no
3-‑
n的脱氮率分别达到93.6％、77.0％、77.3％，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在分别以nh
4+-n、no
2-‑
n、no
3-‑
n为唯一氮源的培养基中均表现出了良好的脱氮能力，表明嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株具有良好的硝化与反硝化能力，能对不同形式的氮具有高效清除能力，可用于修复被氮污染的环境。
[0123]
实施例4菌株rl-gz01同时脱氮和降解dehp的性能
[0124]
一、实验方法
[0125]
(1)制备种子液：从lb平板中挑取单菌落至lb液体培养基中30℃振荡培养直到od
600
＝1.5，得到种子液。
[0126]
(2)dehp降解实验及脱氮实验：
[0127]
取od
600
＝1.5的嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株种子液200μl，在5000rpm的条件下离心4min收集菌体，再分别用200μl hnm培养基、ndm培养基、dm培养基充分悬浮，重复离心和悬浮操作3次，再分别补充10ml含有100mg/l dehp相应的培养基，在30℃、180rpm、黑暗条件下摇床培养60小时。
[0128]
设置三组不加菌的对照组(分别为含有100mg/l dehp的10ml的hnm培养基、ndm培养基、dm培养基)，所有试验都设置3个重复。
[0129]
每隔12小时检测各培养基中dehp的降解情况以及nh
4+-n、no
2-‑
n、no
3-‑
n的浓度，并绘制氮含量柱状图和dehp降解曲线图。
[0130]
二、实验结果
[0131]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在含有100mg/l dehp的不同氮源培养基中对不同氮源的脱氮情况如图6所示，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在含有100mg/l dehp的不同氮源培养基中对dehp的降解情况如图7所示。
[0132]
可见，在添加有dehp的培养基中培养嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株72h，no
3-‑
n的脱氮
率达到60％以上，nh
4+-n、no
2-‑
n的脱氮率分别达到了95.1％、100％，100mg/l dehp的降解率达到了100％，可见，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株具有同时降解dehp和脱氮的能力。
[0133]
此外，与实施例3不含dehp的hnm培养基或ndm培养基相比，对nh
4+-n、no
2-‑
n的脱氮率均得到了提高，其原因是dehp的添加增加了培养基中的碳源，改变了原本培养基中的碳氮比，从而影响菌株脱氮的情况。
[0134]
实施例5菌株rl-gz01对不同浓度的nh
4+-n和dehp的清除性能
[0135]
一、实验方法
[0136]
(1)制备种子液：从lb平板中挑取单菌落至lb液体培养基中30℃振荡培养直到od
600
＝1.5，得到种子液。
[0137]
(2)dehp降解实验及脱氮实验：
[0138]
配制不同nh
4+-n和dehp浓度的hnm培养基：首先制备nh
4+-n终浓度分别为20mg/l、60mg/l、200mg/l、500mg/l的hnm培养基，每个浓度设置3个平行样，每个平行样分别加入dehp，使dehp的终浓度为5mg/l、20mg/l、50mg/l，最终得到12组培养基。
[0139]
取od
600
＝1.5的嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株种子液200μl，在5000rpm的条件下离心4min收集细菌沉淀，再单独分别使用200μl上述12组hnm培养基充分悬浮，重复离心和悬浮操作3次，再分别补充10ml相应培养基，在30℃、180rpm、黑暗条件下摇床培养60小时。具体试验设计如表3所示：
[0140]
表3
[0141][0142]
设置以上12组试验的不加菌的对照组，所有试验都设置3个重复。
[0143]
每12小时检测dehp的降解情况以及nh
4+-n浓度，绘制dehp降解曲线图和氮含量柱状图。
[0144]
二、实验结果
[0145]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在20mg/l、60mg/l、200mg/l的nh
4+-n浓度下对不同浓度(5mg/l、20mg/l、50mg/l)的dehp的降解曲线如图8所示，可见，图中仅有3条实验组的曲线，即不同nh
4+-n浓度下，同浓度dehp降解曲线出现了重合，表明当nh
4+-n浓度为20mg/l、60mg/l、200mg/l时，菌株rl-gz01对dehp的降解能力不受nh
4+-n浓度的影响，在培养24h后dehp的浓度均下降至0；此外图中也只有三条对照组的曲线，这是因为检测发现，dehp初始浓度相同的对照组，dehp在实验过程中的浓度也相当接近，因此在进行数据处理时，将初始浓度相同的dehp的对照组的dehp降解结果通过求均值的方式绘制成一条曲线，以方便从图中读取数据。
[0146]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在500mg/l的nh
4+-n浓度下对不同浓度(5mg/l、20mg/l、
50mg/l)的dehp的降解曲线如图9所示，可见，在培养24h后，浓度为5mg/l、20mg/l的dehp浓度下降至0；在培养36h后，浓度为50mg/l的dehp浓度下降至0。表明嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在500mg/l的nh
4+-n浓度下保持对dehp的彻底降解能力。
[0147]
图8、9的结果表明，在不同nh
4+-n浓度的条件下，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对浓度为5mg/l、20mg/l、50mg/l的dehp均具有彻底的降解能力，但nh
4+-n的浓度会影响dehp的降解速率，具体来说，在nh
4+-n的浓度达到500mg/l及以上，随着nh
4+-n浓度的提高，dehp的降解速率也会变慢。
[0148]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在不同浓度(5mg/l、20mg/l、50mg/l)dehp的条件下对浓度为20mg/l的nh
4+-n的脱氮情况如图10所示，可见，在dehp存在的情况下，浓度为20mg/l的nh
4+-n在24小时后浓度基本达到稳定，趋于0；表明在20mg/l的nh
4+-n环境中，不同浓度dehp的加入对嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株降解nh
4+-n的性能没有明显影响。
[0149]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在不同浓度(5mg/l、20mg/l、50mg/l)dehp的条件下对浓度为60mg/l的nh
4+-n的脱氮情况如图11所示，可见，在dehp浓度为5mg/l、20mg/l的条件下，浓度为60mg/l的nh
4+-n 24小时后浓度基本接近于0；在dehp浓度为50mg/l的条件下，浓度为60mg/l的nh
4+-n 24小时后浓度为15mg/l左右，在36h后浓度接近于0。
[0150]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在不同浓度(5mg/l、20mg/l、50mg/l)dehp的条件下对浓度为200mg/l的nh
4+-n的脱氮情况如图12所示，可见，在不同浓度dehp的条件下，培养72小时后，浓度为200mg/l的nh
4+-n浓度降为20mg/l左右。
[0151]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在不同浓度(5mg/l、20mg/l、50mg/l)dehp的条件下对浓度为500mg/l的nh
4+-n的脱氮情况如图13所示，可见，在不同浓度dehp的条件下，培养72小时后，浓度为500mg/l的nh
4+-n浓度降为65mg/l左右。
[0152]
图10、11、12、13的结果表明，在不同浓度的(5mg/l、20mg/l、50mg/l)dehp条件下，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对浓度为20mg/l、60mg/l、200mg/l、500mg/l的nh
4+-n均具有优异的清除能力，但是dehp的浓度会影响脱氮效率，具体来说在nh
4+-n浓度较低时(20mg/l)，不同浓度dehp的添加对脱氮几乎没有影响；当nh
4+-n浓度较高时(60mg/l)，随着dehp浓度达到50mg/l，脱氮速率会随之变慢；但是当nh
4+-n浓度很高时(200mg/l和500mg/l)，脱氮情况也不会因为dehp浓度变化而出现明显变化。这是因为碳氮比的变化会影响脱氮效率。
[0153]
实施例6菌株rl-gz01在城市废水中同时降解paes、脱氮、除磷的性能
[0154]
一、实验方法
[0155]
(1)制备种子液：从lb平板中挑取单菌落至lb液体培养基中30℃振荡培养直到od
600
＝1.5，得到种子液。
[0156]
(2)共降解实验：
[0157]
城市废水从湛江霞山废水厂采样，初始ph为7.13，总磷浓度为10.89mg/l，总氮浓度为74.51mg/l，氨氮浓度为70.91mg/l，dehp浓度为0.13mg/l，cod为622.4mg/l。进行实验前，通过人工添加dehp的方式将城市废水中dehp的浓度调至5mg/l，其他不变，得到实验城市废水，放至4℃冰箱备用。
[0158]
取od
600
＝1.5的嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株种子液200μl，在5000rpm的条件下离心4min收集菌体，再用200μl上述实验城市废水充分悬浮，重复离心和悬浮操作3次，再加入10ml实验城市废水，并放在30℃、180rpm、黑暗条件下摇床培养84小时。设置不加菌对照组
(实验城市废水)。
[0159]
每隔6h检测一次dehp浓度，每隔12小时检测一次cod、tp、nh
4+-n、no
3-‑
n、no
2-‑
n、tn、dehp浓度，每次检测均进行3次重复。
[0160]
二、实验结果
[0161]
实验城市废水cod值的变化情况如图14所示，可见，培养84小时，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株将实验城市废水的cod值从622.4mg/l降低至101.0mg/l，对照组的cod值在84小时内无明显变化。
[0162]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对实验城市废水tp的降解情况如图15所示，可见，培养84小时，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株可以将实验城市废水的总磷浓度从10.89mg/l降至2.37mg/l，除磷率达到78.23％。
[0163]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对实验城市废水tn、nh
4+-n、no
3-‑
n、no
2-‑
n的降解情况如图16所示，可见，培养84小时，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株可以将实验城市废水的氨氮浓度从70.91mg/l降至2.2mg/l，去除率达到96.9％；培养84小时，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株可以将实验城市废水的总氮浓度从74.51mg/l降至3.4mg/l，去除率达到95.4％。同时，硝态氮和亚硝态氮在实验城市废水中变化情况和对照组相同，并未出现明显的积累。表明嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株具有同步硝化和反硝化的能力。
[0164]
嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株对实验城市废水dehp的降解情况如图17所示，可见，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株可将实验城市废水中5mg/l的dehp彻底降解。
[0165]
上述结果表明，嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在城市废水中具有良好的适应性，并且具有同时降解paes、脱氮、除磷的能力，能有效修复复杂的被邻苯二甲酸酯类物质污染和/或被氮磷污染的环境。
[0166]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一株嗜吡啶红球菌(rhodococcuspyridinivorans)rl-gz01菌株，其特征在于，于2022年4月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：62401，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。2.权利要求1所述嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在降解邻苯二甲酸酯类物质和/或修复邻苯二甲酸酯类物质污染的环境中的应用。3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述邻苯二甲酸酯类物质为邻苯二甲酸二(2-乙基已基)酯、邻苯二甲酸二环己酯、邻苯二甲酸二正辛酯、邻苯二甲酸二正丁酯、邻苯二甲酸丁基苄酯、邻苯二甲酸二乙酯或邻苯二甲酸二甲酯中的一种或几种。4.权利要求1所述嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在清除总氮和/或修复氮污染的环境中的应用。5.权利要求1所述嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在清除总磷和/或修复磷污染的环境中的应用。6.权利要求1所述嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株在制备降解邻苯二甲酸酯类物质和/或清除总氮和/或清除总磷的产品中的应用。7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述产品为菌剂、生物清洁剂、生物降解剂中的一种或多种。8.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株和/或其菌液。9.一种生物清洁剂，其特征在于，含有权利要求1所述的嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株和/或其菌液。10.一种生物降解剂，其特征在于，含有权利要求1所述的嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株和/或其菌液。

技术总结

本发明提供了一株嗜吡啶红球菌(Rhodococcuspyridinivorans)RL-GZ01菌株及其应用。所述嗜吡啶红球菌RL-GZ01菌株于2022年4月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62401。该菌株能有效降解DBP、BBP、DEP、DMP、DEHP、DCHP、DNOP，在含有DEHP的含氮培养基中对NH