非酒精性脂肪性肝炎体外模型、构建方法及其应用与流程

1.本技术属于生物医药领域，具体涉及一种非酒精性脂肪性肝炎体外模型、构建方法及其应用。

背景技术：

2.非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，nash)病人总数在世界范围内不断增长，正在迅速成为一个世界性的公共卫生问题。其主要的特征在于脂肪变性、肝细胞气球样变、炎症反应、伴纤维化。nash疾病不断发展恶化严重会导致肝硬化和肝细胞癌(hcc)的发生。由nash恶化导致的肝硬化和hcc的比例在不断提升，逐渐成为肝移植的最常见诱因。现有体外、体内模型无法较好的模拟nash的病理特征和病理微环境是导致药物开发频繁失败的重要原因之一。
3.nash疾病动物模型是研究疾病致病机制和筛选药物的常用工具，而目前实验动物模型由于种属差异、造模周期长、经济成本高，不利于高通量筛选等原因限制了疾病致病因素的研究和药物的筛选。体外模型，特别是3d体外疾病模型是一种实验动物模型的替代方法，可以在细胞类型、空间结构、疾病发展等方面更精确的模拟人类体内nash疾病状态，可以成为研究nash疾病的发病机制及药物筛选等应用的理想研究工具，有助于提高nash药物的临床前研究获得更准确的数据，避免种属差异带来的临床试验风险，并且可以大幅缩短研究、研发周期。
4.由于nash致病因素复杂、涉及细胞类型多，因此体外模型较难建立。目前已建立的nash体外3d模型使用3d细胞微球培养技术，组成细胞为随机分布，能够模拟脂肪病变和炎症反应，但是无法避免脂肪病变造模试剂对成纤维细胞增殖的影响，因此其对纤维化增生的模拟水平有限。并且无法重现肝内肌成纤维细胞的病理分布，无法模拟纤维化病变对肝实质细胞的养分摄入和药物吸收的影响。因此，需要开发一种既可以模拟非酒精性脂肪性肝炎病理特征，又可以模拟病理微环境的非酒精性脂肪性肝炎体外模型。

技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本技术提供一种非酒精性脂肪性肝炎的体外模型、构建方法及其应用。本技术所公开的非酒精性脂肪性肝炎体外模型由至少包含肝实质细胞在内的内核和成纤维细胞外层组成，既可以模拟非酒精性脂肪性肝炎病理特征，又可以模拟病理微环境。其构建方法包括多步组装过程；首先利用细胞连接材料将至少包含肝实质细胞在内的一种或以上细胞组装成内核结构，使用nash培养基对组装完成的内核进行脂肪病变诱导；完成脂肪病变诱导后，再利用细胞连接材料将在体外激活的成纤维细胞组装到内核结构外层，形成纤维化外层结构。此方法能更加精准的模拟nash病理条件下肝内肌成纤维细胞的分布，形成模拟假小叶的结构；能够避免脂肪病变诱导试剂对成纤维细胞增殖的影响，模拟更严重的纤维化等级；以及模拟肌成纤维细胞增生对肝实质细胞养分、药物摄入的影响；并更好的模拟肝实质细胞损伤。构建方法不需要特殊设备，无复杂操作，可大幅降低研
究成本，可用于高通量研究。并且造模周期短，可大幅提高效率。另外，本技术公开的非酒精性脂肪性肝炎体外模型适用于药效、安全性的深入验证。
6.本技术一方面提供一种非酒精性脂肪性肝炎体外模型。所述体外模型包括由内核以及至少一个外层构成的双层结构，所述内核由至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞组成，所述外层由成纤维细胞构成。
7.在一些实施例中，所述内核由肝实质细胞、内皮细胞以及枯否细胞组成，所述成纤维细胞包括成纤维细胞本身，或由原代肝星状细胞激活获得的成纤维细胞。
8.在一些实施例中，构成所述内核的至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞之间、构成所述外层的成纤维细胞之间、和/或所述内核与所述外层之间通过细胞聚合相互聚集和/或连接。
9.在一些实施例中，所述细胞聚合基于水凝胶、基质胶或细胞连接材料实现。
10.在一些实施例中，构成所述内核的肝实质细胞为经过脂肪变性诱导的细胞。
11.本技术另一方面提供一种非酒精性脂肪性肝炎的体外模型的构建方法。所述方法包括以下步骤。基于细胞聚合操作将至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞组装成所述体外模型的内核；转移所述内核至细胞培养部件中培养，以获取目标培养物；利用非酒精性脂肪性肝炎造模培养基对所述目标培养物进行脂肪变性诱导；基于细胞聚合操作，利用肝星状细胞或成纤维细胞对经过脂肪变性诱导后的目标培养物进行至少一次包覆，以获取预体外模型；利用非酒精性脂肪性肝炎造模培养基对所述与体外模型进行培养，获取所述非酒精性脂肪性肝炎的体外模型。
12.在一些实施例中，构成所述内核的至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞包括内皮细胞和枯否细胞。
13.在一些实施例中，所述细胞聚合操作基于水凝胶、基质胶或细胞连接材料实现。
14.在一些实施例中，所述细胞培养部件包括96孔或384孔超低吸附培养板或悬滴培养板。
15.本技术又一方面提供了上述非酒精性脂肪性肝炎体外模型在药物筛选中的应用。
16.本技术中构建非酒精性脂肪性肝炎体外模型采用分步组装方法，先完成脂肪病变诱导，再形成纤维化外层结构。能更加精准的模拟nash病理条件下肝内肌成纤维细胞的分布，形成模拟假小叶的结构；模拟更严重的纤维化等级；模拟肌成纤维细胞增生对肝实质细胞养分、药物摄入的影响；更好的模拟肝实质细胞损伤；适用于药效、安全性的深入验证；
17.本技术整合了参与疾病发展进程的肝实质细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞及成纤维细胞，更符合nash疾病致病因素复杂、涉及细胞类型多的特征；
18.本技术的构建不需要特殊设备，无复杂操作，可大幅降低研究成本，可用于高通量研究；
19.本技术能够应用于药物筛选、实验动物替代等，为临床药物开发、科研项目研究提供有利模型工具。
20.参考以下详细说明更易于理解本技术的上述以及其他特征、方面和优点。
附图说明
21.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本技术的其它特征、
目的和优点将会变得更显著。
22.图1是根据本技术一些实施例所示的非酒精性脂肪性肝炎体外模型的示例性结构图；
23.图2是根据本技术一些实施例所示的非酒精性脂肪性肝炎体外模型的构建方法的示例性流程图；
24.图3是根据本技术一些实施例所示的成纤维细胞按照不同比例构建非酒精性脂肪性肝炎体外模型的荧光图；
25.图4是根据本技术一些实施例所示的非酒精性脂肪性肝炎体外模型甘油三酯含量变化；
26.图5是根据本技术一些实施例所示的非酒精性脂肪性肝炎体外模型脂质代谢相关基因表达量变化；
27.图6是根据本技术一些实施例所示的非酒精性脂肪性肝炎体外模型炎症因子相关基因表达量变化；
28.图7是根据本技术一些实施例所示的非酒精性脂肪性肝炎体外模型纤维化相关基因表达量变化；
29.图8是根据本技术一些实施例所示的非酒精性脂肪性肝炎体外3d模型与非二次组装模型纤维化程度比较；
30.图9是根据本技术一些实施例所示的非酒精性脂肪性肝炎体外模型与非二次组装模型对药效的反应比较；
31.图10是根据本技术一些实施例所示的利用10种药物处理非酒精性脂肪性肝炎体外模型后甘油三酯含量及il-6、a-sma表达量变化。
具体实施方式
32.如本技术和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，也可能包含其它的步骤或元素。用于本技术的数值范围是为了简明扼要表述包括在该范围的每一个数值。
33.本技术公开了一种非酒精性脂肪性肝炎体外模型，包括由内核以及至少一个外层构成的多层结构，例如，两层、三层、四层或更多层。所述内核可以由至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞组成。在一些实施例中，内皮细胞、枯否细胞也可以参与构成所述内核。示例性的内皮细胞可以包括血管内皮细胞、淋巴内皮细胞、肝窦内皮细胞等或其任意组合。
34.在一些实施例中，组成所述内核的一种或以上细胞可以通过细胞聚合相互聚集和/或连接以形成所述内核。所述细胞聚合可以基于水凝胶、基质胶或细胞连接材料实现。示例性的水凝胶可以包括透明质酸、胶原蛋白、海藻酸钠、聚丙烯酰胺、聚乙二醇等。例如，所述一种或以上细胞可以包裹在水凝胶中，并通过控制/改变水凝胶的特性例如力学、热学等以实现细胞的聚合。所述细胞连接材料可以是市售的或人工合成的用于细胞间连接的生物材料，例如，人工合成的核酸生物材料(在本技术中可以被称为nac-linker)。将细胞与细胞连接材料共同孵育后，可以得到细胞膜表面固定有细胞连接材料的细胞。将这些细胞混
合后共同培养，不同的细胞可以在细胞连接材料的作用下发生聚集，或相互连接。
35.在一些实施例中，构成所述内核的肝实质细胞是经过脂肪变性诱导的。对细胞进行脂肪性变形诱导可以使用本领域内常规手段。例如，使用非酒精性脂肪性肝炎造模培养基对细胞进行培养诱变，将普通细胞培养基全部移除后，加入高脂、高糖并添加细菌脂多糖的培养基培养，通过细胞内甘油三酯的含量可以确认细胞的脂肪病变诱导是否成功。又例如，使用油酸、棕榈酸组合，添加入细胞培养基中，培养2-5天进行可对细胞实现脂肪病变诱导。
36.在一些实施例中，所述外层可以由成纤维细胞构成。所述成纤维细胞可以包括成纤维细胞本身，或由原代肝星状细胞激活获得的成纤维细胞。成纤维细胞本身可以是指该细胞类型就是成纤维细胞，其可以具有增殖能力。所述外层可以通过多个成纤维细胞单体经过细胞聚合和/或细胞连接后形成。例如，类似于所述内核的形成过程，通过细胞聚合材料或细胞连接材料相互聚集或相互连接。所述外层可以使用未激活的原代肝星状细胞，在包覆完成后通过培养将其激活分化成为具有增殖活性的肝内及成纤维细胞，也可以先将肝星状细胞激活成为肝内肌成纤维细胞再进行包覆，也可以是通过细胞培养成得到的成纤维细胞层。
37.在一些实施例中，所述内核与所述外层之间也可以相互聚集或相互连接。相同的或类似的，所述内核和所述外层之间也可以通过细胞聚合相互聚集或相互连接。可以理解，肝实质细胞、内皮细胞(例如，肝窦内皮细胞)、枯否细胞及成纤维细胞是参与肝脏病变发展的细胞。而每种细胞发生病变都有可能导致肝脏病变。因此，使用这些细胞参与构造非酒精性脂肪性肝炎体外模型，可以满足nash疾病致病因素复杂、涉及细胞类型多的特征。
38.图1是根据本技术一些实施例所示的非酒精性脂肪性肝炎体外模型的示例性结构图。如图1所示，非酒精性脂肪性肝炎体外模型100可以包括内核110和外层120。内核110可以由包括肝实质细胞的一种或以上细胞构成。图1中的圆形标识可以用于表示细胞，不同灰度可以用于表示不同的细胞。由此，该示例性非酒精性脂肪性肝炎体外模型100的内核110可以是由三种不同的细胞构成。这些细胞通过细胞聚合操作相互聚集和/或连接，形成了内核110。外层120可以是由成纤维细胞构成。外层120可以包覆内核110，例如，聚集于内核110的表面，或与内核110的表面相互连接，最终形成非酒精性脂肪性肝炎体外模型100。
39.本技术同时公开一种上述非酒精性脂肪性肝炎体外模型的构建方法。所述方法的描述可以参考图2。图2是根据本技术一些实施例所示的非酒精性脂肪性肝炎体外模型的构建方法的示例性流程图。如图2所示，流程200可以包括以下操作。
40.步骤210，基于细胞聚合操作将至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞组装成所述体外模型的内核。
41.在一些实施例中，所述细胞聚合操作可以基于水凝胶、基质胶或细胞连接材料实现。例如，可以通过将至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞包裹在水凝胶，通过控制/改变水凝胶的特性实现细胞间聚合。又例如，可以通过细胞连接材料比如nac-linker与所述一种或以上细胞的共孵育，得到细胞膜表面连接有细胞连接材料的细胞。再将这些细胞混合培养，在细胞连接材料的作用下发生细胞聚集或细胞连接。
42.在一些实施例中，所述至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞还可以包括内皮细胞(比如，血管内皮细胞、淋巴内皮细胞、肝窦内皮细胞)、枯否细胞等或其组合。以上三种细
胞的数目比例可以参照人体肝脏包含的不同类细胞的数量确定。示例性的，肝实质细胞、内皮细胞比如肝窦内皮细胞以及枯否细胞的细胞数比例可以是5：1：2。以上三种细胞可以通过摇床等设备混合均匀后，再实现所述细胞聚合操作。
43.步骤220，转移所述内核至细胞培养部件中并在目标培养温度下培养，以获取目标培养物。
44.在一些实施例中，所述细胞培养部件可以包括培养瓶、培养皿、培养板等。可选地或优选地，所述细胞培养部件可以是多孔培养板。进一步地，所述细胞培养部件可以是超低吸附多孔培养板或悬滴培养板。孔数可以是6、12、24、48、96、384、1536等。可选地或优选地，所述超低吸附多孔培养板或悬滴培养板的孔数可以是96孔或384孔。加入每个孔中的细胞个数可以是1000-100000个。
45.在一些实施例中，所述目标培养温度可以是模拟人体体温而设置。例如，所述目标培养温度可以是36.5℃-37.3℃中的任意一个。例如，36.5℃、36.8℃、37℃、37.1℃、37.3℃等。可选地或优选地，所述目标培养温度可以是37℃。经过一段时间培养后例如24h的培养后，所述内核可呈现为一3d微球。该状态下的内核可以被称为所述目标培养物。
46.步骤230，利用非酒精性脂肪性肝炎造模培养基对所述目标培养物进行脂肪变性诱导；
47.在一些实施例中，所述非酒精性脂肪性肝炎造模培养基可以是含有高脂、高糖和细菌脂多糖的细胞培养基。利用所述非酒精性脂肪性肝炎造模培养基培养所述目标培养物，可以诱导细胞发生脂肪变性。例如，将普通细胞培养基全部移除后，加入高脂、高糖并添加细菌脂多糖的培养基培养，通过细胞内甘油三酯的含量确认脂肪病变诱导成功。诱导时间可以是1天、2天、3天、4天、5天、6天等。本技术不做具体限定。
48.步骤240，基于细胞聚合操作，利用成纤维细胞对经过脂肪变性诱导后的目标培养物进行至少一次包覆，以获取预体外模型。
49.类似于前述说明，可以通过使用水凝胶或基质胶等实现所述细胞聚合操作，也可以使用细胞连接材料实现细胞聚合操作。示例性的，可以利用水凝胶包裹经过脂肪变性诱导后的目标培养物以及成纤维细胞，比如内里为经过脂肪变性诱导后的目标培养物，外部为成纤维细胞，通过水凝胶的聚合作用完成成纤维细胞对经过脂肪变性诱导后的目标培养物的包覆，得到所述预体外模型。又例如，可以将细胞膜表面固定有细胞连接材料的成纤维细胞(例如，将细胞连接材料与成纤维细胞共孵育)，和表面连接有细胞连接材料的经过脂肪变性诱导后的目标培养物(例如，将经过脂肪变性诱导后的目标培养物与细胞连接材料共孵育)进行混合，通过各自连接的细胞连接材料的作用下发生细胞聚集或细胞连接，完成在经过脂肪变性诱导后的目标培养物的外侧包覆成纤维细胞的目的。以上两者之间的细胞数比例可以是内核细胞数量：成纤维细胞数量＝1:0.1-10。
50.在一些实施例中，所述包覆可以是一次或以上。例如，可以对经过脂肪变性诱导后的目标培养物进行多次的成纤维细胞包覆，以形成一个多层结构的预体外模型。
51.步骤250，利用所述非酒精性脂肪性肝炎造模培养基对所述预体外模型进行培养，获取所述非酒精性脂肪性肝炎的体外模型。在一些实施例中，所述预体外模型可以转移至一新的细胞培养部件中，或继续在原先的细胞培养部件中继续培养。通过施加非酒精性脂肪性肝炎造模培养基继续培养一段时间例如3天、5天、7天、10天、14天等，最终的产物即为
所述非酒精性脂肪性肝炎的体外模型。由于所述非酒精性脂肪性肝炎的体外模型所包括的内核可以是3d微球形，因此，在本技术中，所述非酒精性脂肪性肝炎的体外模型也可以被称为体外3d模型。
52.本技术所公开的非酒精性脂肪性肝炎的体外模型，可以应用于药物筛选。例如，可以使用待筛选药物处理该体外模型后，测定表征各类指标的数值变化，以确定药物是否具备药学用途。
53.实施例
54.以下通过实施例进一步对本技术进行阐述，并提供本技术有益效果的数据支持。但本技术并不受这些实施例的限制。
55.实施例1非酒精性脂肪性肝炎体外模型的构建
56.(1)利用细胞连接材料分别与肝实质细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞进行孵育，使细胞连接材料固定于所述肝实质细胞、肝窦内皮细胞和枯否细胞膜表面；
57.(2)将步骤(1)中细胞膜表面固定有细胞连接材料的肝实质细胞、肝窦内皮细胞和枯否细胞按5：1：2的比例混合均匀；
58.(3)将步骤(2)中的混合液转移至96孔或384孔超低吸附培养板中，每孔1000-100000个细胞，将培养板于37℃培养24小时；
59.(4)步骤(3)中的细胞在细胞连接材料的作用下聚集形成3d球形培养物，将培养基更换成nash造模培养基对3d细胞微球进行脂肪变性诱导，诱导持续5天；
60.(5)步骤(4)中诱导完成的3d细胞微球表面孵育细胞连接材料，将其与孵育过细胞连接材料的成纤维细胞按1-10:1的比例混合，进行第二次组装，继续使用nash造模培养基培养至第10天，完成非酒精性脂肪性肝炎体外3d模型构建。
61.实施例2非酒精性脂肪性肝炎体外3d模型模拟不同程度纤维化中的应用
62.分别将6
×
105个hepg2与lx2细胞接种于6孔板，待细胞生长至60％～80％密度时，用慢病毒感染细胞获得稳定的绿荧光hepg2细胞株及稳定的红荧光lx2。在培养基中加入1μg/ml嘌呤霉素。使用稳定表达绿荧光hepg2细胞与lesc、thp1细胞按照5:1:2的比例构建成细胞总数为2000个细胞的内核模型。将三种细胞敷育nac-linker5 min，转移至超低吸附板中，于37℃培养24小时，更换为nash培养基进行nash疾病脂肪病变诱导，诱导时间为48h。使用nac-linker敷育稳定表达红荧光的lx2细胞，分别按照内核细胞与lx2细胞1:1，1:2，1:5，1:10的比例进行混合，进行第二次组装，继续使用nash培养基进行培养10天，对诱导完成3d模型纤维化程度进行荧光拍照鉴定。如图3所示，模型表面包裹不同厚度的lx2细胞，能够模拟nash疾病发展过程中的逐渐加重的纤维化病变。
63.实施例3非酒精性脂肪性肝炎体外3d模型在的模拟nash病变特征
64.使用hepg2、lesc、thp1细胞按照5:1:2的比例构建成细胞总数为5000个细胞的内核模型，将三种细胞敷育nac-linker5 min，转移至超低吸附板中，于37℃培养24小时，更换为nash培养基进行nash疾病脂肪病变诱导，诱导时间为48h。使用nac-linker敷育lx2细胞，按照内核细胞总数与lx2细胞1:2的比例进行混合，进行第二次组装，继续使用nash培养基进行培养10天，诱导完成3d模型。使用甘油三酯酶测定试剂盒(e1013，applygen)检测甘油三酯(tg)含量；采用bca检测试剂盒(p0012，beyotime)进行蛋白定量。收集培养不同时间点的3d细胞团，去除培养液后用pbs冲洗两次然后，使用试剂盒中提供的裂解物裂解细胞并提
取蛋白质和甘油三酯。将甘油三酯浓度除以蛋白浓度，得到每mg蛋白的最终甘油三酯含量。每个样本有3个独立的重复。
65.使用hepg2、lesc、thp1细胞按照5:1:2的比例构建成细胞总数为5000个细胞的内核模型，将三种细胞敷育nac-linker5min，转移至超低吸附板中，于37℃培养24小时，更换为nash培养基进行nash疾病脂肪病变诱导，诱导时间为48h。使用细胞连接材料敷育lx2细胞，按照内核细胞总数与lx2细胞1:2的比例进行混合，进行第二次组装，继续使用nash培养基进行培养10天，诱导完成3d模型。使用trizol试剂(invitrogen)从3d模型中分离总rna，进行qrt-pcr测定脂质代谢相关、炎症以及纤维化相关基因的mrna表达量。如图4-7所示，经nash培养基诱导后，甘油三酯含量明显增加，细胞团内脂质代谢、炎症以及纤维化相关基因的mrna表达量显著上调，表明模型能够模拟nash疾病发展过程中的脂质积累、炎症发生以及疾病后期的纤维化病变。
66.实施例4非酒精性脂肪性肝炎体外3d模型与非二次组装模型的对比
67.使用稳定的绿荧光hepg2细胞和红荧光lx2细胞分别进行二次组装模型及非二次组装模型构建。二次组装模型构建方法：用nac-linkers敷育hepg2细胞5min，敷育完成后将细胞转移至超低吸附板中，37℃培养24小时，去除原有培养基更换为nash培养基进行nash疾病脂肪病变诱导，诱导时间48小时，用nac-linkers分别敷育诱导完成的内核及红荧光lx2细胞5min，敷育完成后将细胞转移至超低吸附板中，继续37℃培养；非二次组装模型构建方法：用nac-linkers敷育绿荧光hepg2细胞和红荧光lx2细胞5min，敷育完成后将细胞转移至超低吸附板中，37℃培养24小时，去除原有培养基更换为nash培养基进行nash疾病脂肪病变诱导，完成模型构建。使用荧光显微镜对两种模型进行拍照记录。选用pparα激动剂gft505对两种模型进行药物处理，在构建完成的模型加入50μm的gft505处理，测定48h后药物对两种模型的甘油三酯含量及scd1、tnfα基因的表达水平的影响，如图8所示非二次组装模型中标记红荧光的lx2细胞明显少于二次组装模型，显示lx2细胞的增殖在非二次组装模型中受到了抑制，二次组装模型被致密的成纤维细胞包裹，能够模拟更高的纤维化平。图9结果表明，二次组装模型形成类似假小叶的结构，致密的成纤维细胞层及其分泌的胶原组织了肝实质细胞对药物的摄入，使得用药后甘油三酯含量的下调水平明显低于非二次组装模型，同时脂质合成相关基因scd1、tnfα的下调比例也显著低于非二次组装模型，证明二次组装模型能够更真实的模拟了疾病发展后期严重纤维化对药物摄入、吸收的影响。
68.实施例5非酒精性脂肪性肝炎体外3d模型在药物筛选中的应用
69.使用hepg2、lesc、thp1细胞按照5:1:2的比例构建成细胞总数为5000个细胞的内核模型，nac-linker敷育三种细胞5min，将敷育完成的细胞转移至超低吸附板中，于37℃培养24小时，更换为nash培养基进行nash疾病脂肪病变诱导，诱导时间为48h。使用nac-linker敷育lx2细胞，按照内核细胞总数与lx2细胞1:2的比例进行混合，进行第二次组装，继续使用nash培养基进行培养10天，诱导完成3d模型。对3d模型加入10种药物进行处理，分别测定各个药物处理后3d模型甘油三酯含量，il-6、a-sma基因表达水平的变化。10种药物包括经筛选流程确定的候选药物1；临床明确具有抗炎作用的药物2，药物3，药物4；具有抗脂肪变性作用的药物5，药物6，药物7；抗纤维化药物药物8，药物9，药物10。经分析结果得到各个药物的作用效果如图10所示，与其他各组药物处理效果相比，经筛选确定的药物1与临
床作用明确药物相比，能够起到抑制脂质积累、抗炎、抗纤维化的作用且在三个方面均有很好的作用效果。证明经我们筛选方法确定的候选药物，能够模拟临床药物作用效果，起到为临床药物开发工作从大量药物中筛选出有效候选药物的作用。
70.上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本技术的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本技术进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本技术中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本技术示范实施例的精神和范围。
71.同时，本技术使用了特定词语来描述本技术的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本技术至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一个实施例”、“一实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本技术的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
72.同理，应当注意的是，为了简化本技术披露的表述，从而帮助对一个或多个发明实施例的理解，前文对本技术实施例的描述中，有时会将多种特征归并至一个实施例、附图或对其的描述中。但是，这种披露方法并不意味着本技术对象所需要的特征比权利要求中提及的特征多。实际上，实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。
73.一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有
±
20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本技术一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
74.最后，应当理解的是，本技术中所述实施例仅用以说明本技术实施例的原则。其他的变形也可能属于本技术的范围。因此，作为示例而非限制，本技术实施例的替代配置可视为与本技术的教导一致。相应地，本技术的实施例不仅限于本技术明确介绍和描述的实施例。

技术特征：

1.一种非酒精性脂肪性肝炎体外模型，其特征在于，所述体外模型包括由内核以及至少一个外层构成的多层结构，所述内核由至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞组成，所述外层由成纤维细胞构成。2.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于，所述内核由肝实质细胞、内皮细胞以及枯否细胞组成，所述成纤维细胞包括成纤维细胞本身，或由原代肝星状细胞激活获得的成纤维细胞。3.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于，构成所述内核的至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞之间、构成所述外层的成纤维细胞之间、和/或所述内核与所述外层之间通过细胞聚合相互聚集和/或连接。4.根据权利要求3所述的体外模型，其特征在于，所述细胞聚合基于水凝胶、基质胶或细胞连接材料实现。5.根据权利要求1所述的体外模型，其特征在于，构成所述内核的肝实质细胞为经过脂肪变性诱导的细胞。6.构建如权利要求1-5中任一项所述的非酒精性脂肪性肝炎的体外模型的方法，其特征在于，包括基于细胞聚合操作将至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞组装成所述体外模型的内核；转移所述内核至细胞培养部件中并在目标培养温度下培养，以获取目标培养物；利用非酒精性脂肪性肝炎造模培养基对所述目标培养物进行脂肪变性诱导；基于细胞聚合操作，利用肝星状细胞或成纤维细胞对经过脂肪变性诱导后的目标培养物进行至少一次包覆，以获取预体外模型；利用所述非酒精性脂肪性肝炎造模培养基对所述预体外模型进行培养，获取所述非酒精性脂肪性肝炎的体外模型。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，构成所述内核的至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞包括内皮细胞和枯否细胞。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细胞聚合操作基于水凝胶、基质胶或细胞连接材料实现。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞培养部件包括96孔或384孔超低吸附培养板或悬滴培养板。10.权利要求1-5中任一项所述的非酒精性脂肪性肝炎体外模型在药物筛选中的应用。

技术总结

本申请公开了一种非酒精性脂肪性肝炎体外模型、构建方法及其应用。该模型包括由内核以及至少一个外层构成的多层结构，所述内核由至少包括肝实质细胞的一种或以上细胞组成，所述外层由成纤维细胞构成。述外层由成纤维细胞构成。述外层由成纤维细胞构成。

技术研发人员：

宋光启

受保护的技术使用者：

苏州朴衡科技有限公司

技术研发日：

2022.09.01

技术公布日：

2022/11/25