一种提高工程P450过加氧酶过氧化氢催化能力的方法及其应用

一种提高工程p450过加氧酶过氧化氢催化能力的方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及基因改造，具体的说是一种提高工程p450过加氧酶过氧化氢催化能力的方法及其应用。

背景技术：

2.细胞素p450单加氧酶(p450s)是一个庞大的超家族氧化酶，在甾醇和次级代谢产物的生物合成以及肝脏的解毒中发挥着重要的作用。p450酶的催化过程中都需要辅因子还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(还原型辅酶i，nadh)或者还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原型辅酶ii，nadph)提供两个电子，经由还原伴侣蛋白传递到反应活性中心，与来自蛋白质外部的两个质子一道，还原活化氧分子而生成反应活性中间体compound i，由后者负责底物氧化。但昂贵的辅因子和复杂的电子传递体系导致了其体外催化的低效，制约其在生物化工和有机合成上的进一步应用。
3.虽然在p450的催化循环中有过氧化氢支路(h2o
2 shunt)的存在，但也仅有少数p450酶(如属于cyp152亚族的一些酶)可以利用此催化途径。由于过氧化氢路径不需要辅因子nad(p)h和还原伴侣蛋白(酶)，可极大地简化催化路径，提高催化效率。另外过氧化氢价格便宜、反应中仅生成水作为副产物具有环境友好性，因此开发基于过氧化氢的p450酶催化体系可以极大地释放p450酶在生物化工和有机合成上的应用潜力。鉴于p450-h2o2催化体系的巨大潜在应用价值，尽管由于蛋白结构上的原因，绝大多数p450酶不能直接利用过氧化氢作为氧源。科学家已经尝试利用定点突变和定向进化的方法构建过氧化氢依赖的p450过加氧酶(peroxygenase)。研究发现bmp-f87a可以利用过氧化氢羟化肉豆蔻酸，最高催化活性可达162nmol/min/nmol p450；f87v可以将吲哚转化为靛蓝(indigo)。cirino等以f87a为模板用定向进化技术得到的突变体21b3，把对硝基酚氧基月桂酸的氧化活性提高18倍。bell等利用定点突变技术将保守氨基酸苏氨酸突变为谷氨酸(t252e)，将4-甲氧基苯甲酸羟化为4-羟基苯甲酸的活性提高6倍。定点突变和定向进化的策略在p450-h2o2人工催化体系开发中取得一定进展，但其催化活性普遍较低。

技术实现要素：

4.本发明目的是针对h2o2不容易通过p450酶的底物通道进入其疏水性活性中心，提供一种提高工程p450过加氧酶过氧化氢催化能力的方法及其应用。
5.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
6.一种提高p450酶过氧化氢催化能力的方法，以p450酶的血红素辅因子为起点，利用caver web 1.0软件识别p450酶的通道；选择通道长度在弯曲度在0-2，直径在作为目标通道，而后在目标通道的入口或瓶颈处选择侧链朝向通道的氨基酸即为关键氨基酸，而后对上述一个或多个关键氨基酸进行特定突变，进而获得至少一条能够提高p450酶过氧化氢催化能力的通道使其在过氧化氢催化下提高其催化能力。
7.所述利用caver web 1.0软件识别时设计参数为探针半径为壳半径为壳体深度为聚类阈值为3.5，而后根据以上参数计算p450酶的晶体结构(pdb)，即获得出p450酶的多条通道。
8.所述通道瓶颈处为距离通道
9.所述关键氨基酸为在距离通道的范围内氨基酸，并且侧链朝向通道的氨基酸残基。
10.所述将关键氨基酸残基突变为侧链较小或者带有极性的特定氨基酸；所述特定氨基酸为丙氨酸(a)、丙氨酸(g)、丝氨酸(s)或苏氨酸(t)。
11.所述获得多个突变的氨基酸通道与野生型p450酶进行催化对比，催化活性最高即为能够提高p450酶过氧化氢催化能力的通道。
12.一种所述方法的在提高p450酶过氧化氢催化能力中的应用。
13.一种提高过氧化氢催化底物能力的p450酶突变体，突变体为cyp199a4酶中f182、f298、p90中至少一个位点进行突变；其中，f182突变为a、g、s或t；f298突变为a、g或s；p90突变为a、g或s；
14.或，f182位点与下述p71、l175、p176、y177、f185、l25o、t298、v355、v363中任意一个位点进行突变；其中，f182位点突变为a，上述记载的下述位点分别突变为a。
15.一种提高过氧化氢催化底物能力的p450酶突变体，突变体为cyp153a
m.aq
酶中v456、d226、d310、n309中至少一个位点进行突变；其中，上述位点突变为a、g、s、或t。
16.一种提高过氧化氢催化底物能力的p450酶突变体，突变体为p450bm3酶中f87g/t268v基础上的d182、a410、h100、m185、l272、t411中至少一个位点突变；其中，d182、a410位点突变为g；h100、m185位点突变为s；l272、t411位点突变为g或s。
17.所述突变体进行催化，催化体系为将0.01μm～1mm权利要求7、8或9的突变体与0.1μm～300mm底物加入至ph4～10的缓冲溶液中，和1μm～600mm h2o2，在0℃～60℃反应1min～24h来实现底物(4-甲氧基苯甲酸、月桂酸、吲哚、苯乙烯、乙苯、苯甲硫醚)的催化氧化。
18.所述底物类型为
[0019][0020]
本发明所具有的优点：
[0021]
本发明创新性的利用caver软件预测出cyp199a4、cyp153a
m.aq
和p450bm3的多条通道，从多条通道中选取目标通道，并结合半理性设计策略，将目标通道的入口或瓶颈处选择侧链朝向通道的氨基酸进行定点饱和突变，所获得的多个突变体与野生酶进行催化活性对比，催化活性高的所在的通道为h2o2通道。此方法的应用能够提高p450酶利用过氧化氢的能力，进而提高其催化底物的活性。
具体实施方式：
[0022]
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
[0023]
申请人研究发现与天然p450过加氧酶相比，工程p450过加氧酶需要更高浓度的h2o2(h2o2浓度的数百几倍以上)才能发挥其催化功能。
[0024]
例如：利用引入酸碱催化基团改造的人工p450过加氧酶与天然p450过加氧酶分别在过氧化氢的存在下催化苯乙烯环氧化活性进行对比，具体为：
[0025]
催化体系为酶、苯乙烯、h2o2、ph 7.4pbs缓冲溶液(将催化体系成分描述清楚)；酶为工程p450过加氧酶与天然p450过加氧酶，其中，工程p450过加氧酶为p450bm3
[1]
、p450
cam[2]
或cyp119
[2]
；天然p450过加氧酶为aaeapo
[3]
或mthupo
[4]
，过氧化氢使用量参见下表。
[0026][0027]
综上可见通过引入酸碱催化基团将其改造为可利用h2o2作为末端氧化剂的p450过加氧酶，但我们发现通过该策略获得的人工p450过加氧酶与天然p450过加氧酶催化苯乙烯环氧化添加h2o2的量相比，其所需h2o2是其60倍以上。研究表明过量的h2o2的浓度会导致p450酶的失活，进而抑制p450酶的催化反应。
[0028]
由此本发明利用caver软件预测出工程p450酶的通道，并结合半理性设计策略，对通道内瓶颈处或者入口处的关键氨基酸残基进行突变，获得最优突变体，并以最优突变体所在的通道为h2o2通道，成功的提高工程p450酶的催化活性，进而该方法获得突变工程酶在生物催化、合成化学和合成生物学等领域的应用具有积极地推广。
[0029]
实施例1
[0030]
cyp199a4的突变体的获得：
[0031]
将来自rhodopseudomonas palustris haa家族的cyp199a4，由通用生物系统有限公司根据蛋白序列进行了核苷酸密码子偏好性的优化，优化后cyp199a4的序列为seq id no1。
[0032]
利用caver web 1.0服务器识别cyp199a4的通道，以cyp199a4酶的晶体结构(pdb)进行计算，以p450酶的血红素辅因子为起点，探针半径为壳半径为壳体深度为聚类阈值为3.5。根据以上参数计算出11条通道。根据通道长度为弯曲度在0-2，直径在等指标选取四条目标通道。从四条目标通道内选取位于通道范围内的氨基酸且侧链朝向通道的为关键氨基酸残基，其中关键氨基酸残基为f182、p90或f298，关键氨基酸至少一个突变为a、g、s或t。或以f182为模板，接下以任何一个位点p71、l175、p176、v181、v355或v363进行突变，上述位点突变为a。以cyp199a4的野生型(或、单突变、双突变)为模板，利用不同突变位点的引物序列进行pcr扩增获得单突变；而后再以单突变为模板获得双突变。以上突变体的获得如下所示。
[0033]
以cyp199a4野生型序列为模板，制备f182a/g/s/t突变体
[0034]
1)f182a的突变引物如表1所示
[0035]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1f182a-fgcaaatgcctttggcccgccg2f182g-fggtaatgcctttggcccgccg3f182s-fagcaatgcctttggcccgccg4f182t-faccggcccgccgaatgaactgc5f182-rcaccagacctgcatacggcagc
[0036]
表2 pcr体系
[0037]
名称体积primestarmix25μl正向引物(f)1μl反向引物(r)1μl模板1μlddh2o22μl总体积50μl
[0038]
表3 pcr反应条件
[0039][0040][0041]
pcr后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完后在紫外灯下分别切下目的条带，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段。
[0042]
将胶回收的不同突变体的序列末端进行磷酸化处理，磷酸化体系如表4所示；
[0043]
表4目的序列末端磷酸化体系
[0044]
名称体积磷酸酶1μlbuffer2μlpcr回收片段17μl总体积20μl
[0045]
将磷酸化后的不同突变体的序列进行连接，连接体系如表5所示
[0046]
表5连接体系
[0047]
名称体积磷酸化体系20μlt4dna连接酶1μl总体积21μl
[0048]
16℃过夜连接。
[0049]
将10μl连接体系转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，冰浴5min；加入600μl新鲜lb液体培养基，37℃、200rpm震荡培养1h；取200μl菌液涂布到含50μg/ml kana的lb平板上，37℃过夜培养。
[0050]
待平板上长出单菌落，测定分析基因序列。
[0051]
测序成功的质粒即是不同的cyp199a4突变体。
[0052]
而后按照上述突变方式制备不同位点突变为不同氨基酸的突变体，具体引物详见表中记载。
[0053]
2)p90a/g/s的突变引物如表6所示
[0054]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1p90a-fcgatggcgtccgccgagtc2p90g-fggttggcgtccgccgagtc3p90s-facgtggcgtccgccgag4p90-rtttttcttttttaaaatcgctcaggccc
[0055]
3)f298a/g/s的突变引物如表7所示
[0056][0057][0058]
4)在f182a的基础上，构建f182a-x的双突变体，具体为f182a/l175a、f182a/p176a、f182a/p71a、f182a/p71g、f182a/k89a、f182a/90a、f182a/f185g、f182a/v355a、f182a/v363a引物如表8所示
[0059]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1l175a-facatctggcaccgtatgcaggtctggtgttta2l175a-rcatacggtgccagatgttcacgaccttcctgtt3p176a-ftctgctggcatatgcaggtctggtgtttaatgcc4p176arctgcatatgccagcagatgttcacgaccttcc5y177a-faacatctgctgccggcagcaggtctggtgtttaatgcct6y177a-rtgccggcagcagatgttcacgaccttcctgtt7p71a-fgcaaccaccttttgtagtagccg8p71a-ratcattcagcacggcatgaacttc9p71g-fggtaccaccttttgtagtagccg10k89a-fgcaccgtggcgtccgccgag11k89a-rttcttttttaaaatcgctcaggccc12p90a-fcgatggcgtccgccgagtc13p90a-rtttttcttttttaaaatcgctcaggccc14f185g-fggtggcccgccgaatgaac
15f185g-rggcattaaacaccagacctgcatacg16v355a-fgcacatatgtgtgttggtcagc17v355g-rgccgctgccaaagcccactggccgctgg18v363a-fttggtcagctggcagcccgcctggaaggtgaa19v363a-rggctgccagctgaccaacgcacatatga
[0060]
利用上述突变体，通过比较其与cyp199a4野生型催化4-甲氧基苯甲酸脱甲基化的活性，确定最优突变体，以最优突变体所在的通道为h2o2通道。上述突变体催化4-甲氧基苯甲酸的反应如实例2和3所示。
[0061]
实施例2：
[0062]
将上述获得的cyp199a4单突变体参与下表9，利用10mm h2o2催化4-甲氧基苯甲酸的过程：
[0063]
反应体系如下：将1μm的cyp199a4单突变体，2mm的4-甲氧基苯甲酸(2％dmso作为助溶剂)，30℃孵育2min后，加入10mm h2o2到终体积为1ml的ph7.4的tris-hcl(50mm)中，30℃水浴反应60min后，加入20μl的hcl(1m)终止反应后，用乙酸乙酯(1ml)萃取4min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，取萃取液等比例的用bsfta：tmcs(99：1)进行衍生，75℃的金属浴中衍生30min后，进行gc测定。
[0064]
反应结果如表9所示：
[0065]
4-甲氧基苯甲酸的脱甲基化反应
[0066][0067][0068]
由表9可知cyp199a4 182位的苯丙氨酸(f)突变为丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、苏氨酸(t)和丝氨酸(s)后催化4-甲氧基苯甲酸的活性提高了17倍以上，其中f182a突变体将4-甲氧基苯甲酸的脱甲基化活性提高163倍。
[0069]
实施例3：
[0070]
以上述获得的cyp199a4双突变体参与下表10，利用10mm h2o2催化4-甲氧基苯甲酸的过程：
[0071]
反应体系如下：将1μm的cyp199a4双突变体，2mm的4-甲氧基苯甲酸(2％的dmso作为助溶剂)，30℃孵育2min后，加入10mm h2o2到终体积为1ml的ph7.4的tris-hcl(50mm)中，30℃水浴反应60min后，加入20μl的hcl(1m)终止反应后，用乙酸乙酯(1ml)萃取4min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，取萃取液等比例的用bsfta:tmcs(99：1)进行衍生，75℃的金属浴中衍生30min后，然后进行gc测定。
[0072]
反应结果如表10所示：
[0073]
4-甲氧基苯甲酸的脱甲基化反应
[0074][0075][0076]
由表10可知f182a组合不同通道和相同通道内的的关键氨基酸，筛选出最优突变f182a/p90a，将4-甲氧基苯甲酸的ton提升至1100，比野生型的活性提高183倍。
[0077]
实施例4
[0078]
cyp153a
m.aq
的突变体的获得：
[0079]
将来自marinobacter aquaeolei cyp153a家族的cyp153a
m.aq
，由通用生物系统有限公司根据蛋白序列进行了核苷酸密码子偏好性的优化，优化后cyp153a
m.aq
的序列为seq id no2。
[0080]
利用caver web 1.0服务器识别cyp153a
m.aq
的通道，以cyp153a
m.aq
酶相应的晶体结构进行计算，以cyp153a
m.aq
酶的血红素辅因子为起点，探针半径为壳半径为壳体深度为聚类阈值为3.5。根据以上参数计算出8条通道。根据通道长度为弯曲度在0-2，直径在等指标选取5条目标通道。从5条目标通道内选取位于通道
范围内的氨基酸且侧链朝向通道的为关键氨基酸残基，其中关键氨基酸残基为v456、d226或d310关键氨基酸至少一个突变为a、g、s或t。接下来以上述突变体的任意两个为模板进行组合突变。以cyp153a
m.aq
的野生型(或、单突变、双突变)为模板，利用不同突变位点的引物序列进行pcr扩增获得单突变；而后再以单突变为模板获得双突变。以上突变体的获得如下所示。
[0081]
以cyp153a
m.aq
野生型序列为模板，制备v456a/g/s/t突变体1)v456a/g/s/t的突变引物如表11所示
[0082][0083][0084]
表12 pcr体系
[0085]
名称体积primestarmix25μl正向引物(f)1μl反向引物(r)1μl模板1μlddh2o22μl总体积50μl
[0086]
表13 pcr反应条件
[0087]
步骤温度(℃)时间1945min29415s35715s4724min5步骤2-427循环67210min
[0088]
pcr后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完后在紫外灯下分别切下目的条带，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段。
[0089]
将胶回收的不同突变体的序列末端进行磷酸化处理，磷酸化体系如表14所示；
[0090]
表14目的序列末端磷酸化体系
[0091]
名称体积磷酸酶1μl
buffer2μlpcr回收片段17μl总体积20μl
[0092]
将磷酸化后的不同突变体的序列进行连接，连接体系如表5所示
[0093]
表15连接体系
[0094]
名称体积磷酸化体系20μlt4dna连接酶1μl总体积21μl
[0095]
16℃过夜连接。
[0096]
将10μl连接体系转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，冰浴5min；加入600μl新鲜lb液体培养基，37℃、200rpm震荡培养1h；取200μl菌液涂布到含50μg/ml kana的lb平板上，37℃过夜培养。
[0097]
待平板上长出单菌落，测定分析基因序列。
[0098]
测序成功的质粒即是不同的cyp153a
m.aq
突变体。
[0099]
而后按照上述突变方式制备不同位点突变为不同氨基酸的突变体，具体引物详见表中记载。
[0100]
2)d226a/g/s/t的突变引物如表16所示
[0101]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1d226a-fggtcgatggcaggtgcag2d226a-rgctccattcaaccagtttatgacg3d226g-faatggagcggtcgtatggcaggtgcagccagc4d226g-rcatacgaccgctccattcaaccagtttatgacg5d226s-facgcgtccgccgagtc6d226s-rgcaccgccgagtctgattc7d226t-faatggagcacccgtatggcaggtgcagccagc8d226t-rcatacgggtgctccattcaaccagtttatgacg
[0102]
3)d310a/g/s/t的突变引物如表17所示
[0103]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1d310a-fgcaaccacccgtaatagcatgag2d310a-rattgccgccaacaatcagcagggtc3d310g-fggtaccacccgtaatagcatgag4d310g-rattgccgccaacaatcagcagggtc5d310s-fcaatagcaccacccgtaatagcatgagtggtg6d310s-rtacgggtggtgctattgccgccaacaatcagc7d310t-fcaataccaccacccgtaatagcatgagtggtg8d310t-rtacgggtggtggtattgccgccaacaatcagc
[0104]
4)在v456a的基础上，构建v456a-x的双突变体，具体为v456a/d226a、v456a/d226t
引物如表18所示
[0105]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1d226a-fggtcgatggcaggtgcag2d226a-rgctccattcaaccagtttatgacg3d226t-faatggagcacccgtatggcaggtgcagccagc4d226t-rcatacgggtgctccattcaaccagtttatgacg
[0106]
4)在v456g的基础上，构建v456g-x的双突变体，具体为v456g/d226a、v456g/d226t、v456g/d266s引物如表19所示
[0107][0108][0109]
5)在v456s的基础上，构建v456s-x的双突变体，具体为v456s/d226t引物如表20所示
[0110]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1d226t-faatggagcacccgtatggcaggtgcagccagc2d226t-rcatacgggtgctccattcaaccagtttatgacg
[0111]
利用上述突变体，通过比较其与cyp153a
m.aq
野生型催化月桂酸羟基化的活性，确定最优突变体，以最优突变体所在的通道为h2o2通道。上述突变体催化月桂酸的反应如实例5和6所示。
[0112]
实施例5：
[0113]
以上述获得的cyp153am.aq单突变体参与下表21，利用60mm h2o2催化月桂酸的过程：
[0114]
反应体系如下：将3μm的cyp153am.aq突变体，1mm的月桂酸(1％的dmso作为助溶剂)，30℃孵育2min后，加入60mm的h2o2到终体积为0.5ml的ph7.4的pbs(50mm)中，30℃水浴反应60min后，加入20μl的hcl(1m)终止反应后，用乙酸乙酯(0.5ml)萃取4min，取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，取萃取液等比例的用bsfta∶tmcs(99∶1)进行衍生，75℃的金属浴中衍生30min后，然后进行gc测定。
[0115]
反应结果如表21所示
[0116]
月桂酸的羟化反应
[0117]
bmp f87g/t268v的基础上进行突变。从四条目标通道内选取位于通道范围内入口或者瓶颈处的关键氨基酸，其中关键氨基酸残基为突变体为d182、a410、h100、m185、l272、t411在p450 bmp f87g/t268v的基础上至少一个位点突变；其中，d182、a410位点突变为g；h100、m185位点突变为s；l272、t411位点突变为g或s，获得了一系列以f87g/t268v的基础上的三突变体。以f87g/t268v为模板，利用不同突变位点的引物序列进行pcr扩增获得三突变，以上突变体的获得如下所示。
[0132]
在f87g/t268v的基础上，构建f87g/t268v-x三突变体
[0133]
1)h100s的突变引物如表23所示
[0134]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1h100s-f5
’‑
gagcaatatcttacttccaagcttcagtcag-3’2h100s-r5
’‑
gcttttttccaatttttttcatgcg-3’[0135]
表24 pcr体系
[0136]
名称体积primestarmix25μl正向引物(f)1μl反向引物(r)1μl模板1μlddh2o22μl总体积50μl
[0137]
表25 pcr反应条件
[0138]
步骤温度(℃)时间1945min29415s35715s4724min5步骤2-427循环67210min
[0139]
pcr后进行琼脂糖凝胶电泳，电泳完后在紫外灯下分别切下目的条带，然后利用胶回收试剂盒回收目的片段。
[0140]
将胶回收的不同突变体的序列末端进行磷酸化处理，磷酸化体系如表26所示；
[0141]
表26目的序列末端磷酸化体系
[0142]
名称体积磷酸酶1μlbuffer2μlpcr回收片段17μl总体积20μl
[0143]
将磷酸化后的不同突变体的序列进行连接，连接体系如表8所示
[0144]
表27连接体系
[0145][0146][0147]
16℃过夜连接。
[0148]
将10μl连接体系转入大肠杆菌dh5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；42℃热激90s，冰浴5min；加入600μl新鲜lb液体培养基，37℃、200rpm震荡培养1h；取200μl菌液涂布到含50μg/ml kana的lb平板上，37℃过夜培养。
[0149]
待平板上长出单菌落，测定分析基因序列。
[0150]
测序成功的质粒即是p450bm3 f87g/t268v/h100s突变体。
[0151]
而后按照上述突变方式制备不同位点突变为不同氨基酸的突变体，具体引物详见表中记载。
[0152]
2)d182g的突变引物如表28所示
[0153]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1d182g-f5
’‑
ggtgaagcaatgaacaagctgcag-3’2d182g-r5
’‑
cagtgcacggaccatacttgtaataaatg-3’[0154]
3)m185s的突变引物如表29所示
[0155]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1m185s-f5
’‑
caagcaacaagctgcagcgag-3’2m185s-r5
’‑
cttcatccagtgcacggaccatac-3’[0156]
4)l272g/s的突变引物如表30所示
[0157]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1l272g-f5
’‑
gtggtttatcatttgcgctgtatttcttag-3’2l272s-f5
’‑
gtagcttatcatttgcgctgtatttcttagtg-3’3l272-r5
’‑
cacttgtcacttcgtgtcccgc-3’[0158]
5)a410g的突变引物如表31所示
[0159]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1a410g-f5
’‑
ggtacgctggtacttggtatgatgctaaaac-3’2a410g-r5
’‑
ctcatgaagagcgaactgctgacc-3’[0160]
6)t411g/s的突变引物如表32所示
[0161]
entryprimersequence(5
’‑3’
)1t411g-f5
’‑
gcaggtctggtacttggtatgatgctaaaac-3’2t411s-f5
’‑
gcaagcctggtacttggtatgatgctaaaac-3’3t411-r5
’‑
ctcatgaagagcgaactgctgacc-3’[0162]
利用上述突变体，通过比较其与f87g/t268v催化吲哚羟基化的活性，确定最优突变体，以最优突变体所在的通道为h2o2通道。上述突变体催化吲哚的反应如实例8所示。另外，进一步降低h2o2浓度探究最优突变体的吲哚羟基化活性，如实例9所示。为了探究优势突
变体对其他反应的普适性，将其应用到苯乙烯的环氧化反应、乙苯羟化和苯甲硫醚的亚砜化反应，如实例10、11、12所示。
[0163]
实施例8
[0164]
将上述获得的f87g/t268v基础上的三突变体，利用2mm h2o2催化吲哚羟化的过程：
[0165]
反应体系如下：0.05μm的p450bm3，4mm的吲哚(2％dmso作为助溶剂)，0.5mm的双功能小分子im-c6-phe，2mm h2o2，ph 8.2 100mm的tris-hcl缓冲溶液作为反应体系的溶剂，终体积为1ml；对照体系为f87g/t268v的吲哚羟基化反应；25℃反应4h。反应结束后加入9ml的dmso中止反应，通过紫外分光光度计检测620nm靛蓝的吸光值，反应结果如表33所示。
[0166][0167][0168]
由表33可知，与f87g/t268v相比，l272位的亮氨酸(l)突变为丝氨酸(s)后吲哚羟化生成靛蓝的ton提高了153％。另外，在f87g/t268v基础上的其他突变体提高了108％-135％。
[0169]
实施例9
[0170]
将上述获得的f87g/t268v基础上的最优突变体，进一步降低h2o2浓度，利用1mm h2o2催化吲哚羟化的过程：
[0171]
反应体系如下：0.05μm的f87g/t268v/l272s，4mm的吲哚(2％dmso作为助溶剂)，0.5mm的双功能小分子im-c6-phe，1mm h2o2，ph 8.2
[0172]
100mm的tris-hcl缓冲溶液作为反应体系的溶剂，终体积为1ml；对照体系为f87g/t268v的吲哚羟基化反应；25℃反应4h。反应结束后加入9ml的dmso中止反应，通过紫外分光光度计检测620nm靛蓝的吸光值，反应结果如表34所示。
[0173]
[0174][0175]
由表34可知，f87g/t268v/l272s有效地将h2o2浓度降低到接近天然过氧酶的水平。与f87g/t268v相比，l272位的亮氨酸(l)突变为丝氨酸(s)后吲哚羟化生成靛蓝的ton提高了208％。
[0176]
实施例10
[0177]
将上述获得吲哚羟基化优势突变体，利用2mm h2o2催化苯乙烯环氧化的过程：
[0178]
反应体系如下：0.5μm的p450bm3，4mm的苯乙烯(10％甲醇作为助溶剂)，0.5mm的双功能小分子im-c6-phe，2mm h2o2，ph 8.0 100mm的pbs缓冲溶液作为反应体系的溶剂，终体积为1ml；对照体系为f87g/t268v的苯乙烯环氧化反应；25℃反应2h。反应结束后用乙酸乙酯(1ml)萃取2min，离心后取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，添加二苯甲酮作为内标，进行gc测定，反应结果如表35所示。
[0179][0180]
由表35可知，与f87g/t268v相比，182位的天冬氨酸(d)突变为甘氨酸(g)、l272位的亮氨酸(l)突变为丝氨酸(s)后，苯乙烯环氧化合成氧化苯乙烯的ton分别提高了235％和227％。另外，在f87g/t268v基础上的其他突变提高了129％-188％。
[0181]
实施例11
[0182]
将上述获得苯乙烯环氧化优势突变体，利用2mm h2o2催化乙苯卞位羟基化的过程：
[0183]
反应体系如下：0.5μm的p450bm3，10mm的乙苯(2％dmso作为助溶剂)，0.5mm的双功能小分子im-c6-phe，2mm h2o2，ph 8.0 100mm的pbs缓冲溶液作为反应体系的溶剂，终体积为1ml；对照体系为f87g/t268v的乙苯卞位羟基化反应；25℃反应2h。反应结束后用乙酸乙酯(1ml)萃取2min，离心后取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，添加二苯甲酮作为内标，进行gc测定，反应结果如表36所示。
[0184][0185]
由表36可知，与f87g/t268v相比，182位的天冬氨酸(d)突变为甘氨酸(g)、l272位的亮氨酸(l)突变为丝氨酸(s)后，乙苯卞位羟基化生产1-苯乙醇的ton分别提高了239％和258％。
[0186]
实施例12
[0187]
将上述获得苯乙烯环氧化优势突变体，利用2mm h2o2催化苯甲硫醚亚磺化的过程：
[0188]
反应体系如下：0.5μm的p450bm3，4mm的苯甲硫醚(2％dmso作为助溶剂)，0.5mm的双功能小分子im-c6-phe，2mm h2o2，ph 8.0 100mm的pbs缓冲溶液作为反应体系的溶剂，终体积为1ml；对照体系为f87g/t268v的苯甲硫醚亚磺化反应；25℃反应2h。反应结束后用乙酸乙酯(1ml)萃取2min，离心后取有机相过0.22μm的膜，用无水硫酸钠除水，添加二苯甲酮作为内标，进行gc测定，反应结果如表37所示。
[0189][0190][0191]
由表37可知，与f87g/t268v相比，182位的天冬氨酸(d)突变为甘氨酸(g)、l272位的亮氨酸(l)突变为丝氨酸(s)后，苯甲硫醚亚磺化合成甲基苯基亚砜的ton分别提高了124％和133％。
[0192]
由上述各实施例可见，利用半理性策略设计cyp199a4通道内的关键氨基酸残基，制备一系列突变体，通过比较其与野生型酶催化4-甲氧基苯甲酸的脱甲基化反应，确定通道内的关键氨基酸残基f182和p90，并将其催化活性提高了183倍。为了验证此策略的普适性，以相同策略制备了cyp153am.aq一系列突变体，以月桂酸的羟化反应的活性为指标，确定其通道内的关键氨基酸残基v456和d226，将月桂酸的活性提高15倍以上。另外，进一步验证该策略在p450bm3(双功能小分子协同的p450bm3过加氧酶)的适用性，以相同策略制备了p450bm3一系列突变体，分别进行了吲哚羟化、苯乙烯环氧化、乙苯卞位羟化、苯甲硫醚亚磺化多种不同类型的反应，确定其通道内的关键氨基酸残基d182和l272，其反应活性相比f87g/t268v提高2倍左右。
[0193]
综上所述，本专利通过分析p450酶的通道，并结合半理性设计的策略确定了一条p450单加氧酶的h2o2通道，在低h2o2浓度下成功将p450单加氧酶改造为过加氧酶，并在一定程度上提高其催化天然底物的活性。另外，该策略通道可以应用到p450酶，这为p450酶的生物催化剂提供了新的见解和策略，有望进行工业化应用。
[0194]
参考文献
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技术特征：

1.一种提高p450酶过氧化氢催化能力的方法，其特征在于：以p450酶的血红素辅因子为起点，利用caver web 1.0软件识别p450酶的通道；选择通道长度在弯曲度在0-2，直径在作为目标通道，而后在目标通道的入口或瓶颈处选择侧链朝向通道的氨基酸即为关键氨基酸，而后对上述一个或多个关键氨基酸进行特定突变，进而获得至少一条能够提高p450酶过氧化氢催化能力的通道使其在过氧化氢催化下提高其催化能力。2.按权利要求1所述的方法，其特征在于：所述利用caver web 1.0软件识别时设计参数为探针半径为壳半径为壳体深度为聚类阈值为3.5，而后根据以上参数计算p450酶的晶体结构(pdb)，即获得出p450酶的多条通道。3.按权利要求1所述的方法，其特征在于：所述通道瓶颈处为距离通道所述关键氨基酸为在距离通道的范围内氨基酸，并且侧链朝向通道的氨基酸残基。4.按权利要求1或3所述的方法，其特征在于：所述将关键氨基酸残基突变为侧链较小或者带有极性的特定氨基酸；所述特定氨基酸为丙氨酸(a)、丙氨酸(g)、丝氨酸(s)或苏氨酸(t)。5.按权利要求1所述的方法，其特征在于：所述获得多个突变的氨基酸通道与野生型p450酶进行催化对比，催化活性最高即为能够提高p450酶过氧化氢催化能力的通道。6.一种权利要求1所述方法的在提高p450酶过氧化氢催化能力中的应用。7.一种提高过氧化氢催化底物能力的p450酶突变体，其特征在于：突变体为cyp199a4酶中f182、t298、p90中至少一个位点进行突变；其中，f182突变为a、g、s或t；t298突变为a、g或s；p90突变为a、g或s；或，f182位点与下述p71、p175、p176、y177、f185、l25o、t298、v355、v363中任意一个位点进行突变；其中，f182位点突变为a，上述记载的下述位点分别突变为a。8.一种提高过氧化氢催化底物能力的p450酶突变体，其特征在于：突变体为cyp153a
m.aq
酶中v456、d226、d310、n309中至少一个位点进行突变；其中，上述位点突变为a、g、s、或t。9.一种提高过氧化氢催化底物能力的p450酶突变体，其特征在于：突变体为p450bm3酶中f87g/t268v基础上的d182、a410、h100、m185、l272、t411中至少一个位点突变；其中，d182、a410位点突变为g；h100、m185位点突变为s；l272、t411位点突变为g或s。10.按权利要求7、8或9的突变体，其特征在于：所述突变体进行催化，催化体系为将0.01μm～1mm权利要求7、8或9的突变体与0.1μm～300mm底物加入至ph4～10的缓冲溶液中，和1μm～600mm h2o2，在0℃～60℃反应1min～24h来实现底物的催化氧化。

技术总结

本发明涉及基因改造，具体的说是一种提高工程P450过加氧酶过氧化氢催化能力的方法及其应用。以P450酶的血红素辅因子为起点，利用Caver Web 1.0软件识别P450酶的通道；选择通道长度在弯曲度在0-2，直径在作为目标通道，而后在目标通道的入口或瓶颈处选择侧链朝向通道的氨基酸即为关键氨基酸，而后对上述一个或多个关键氨基酸进行特定突变，进而获得至少一条能够提高P450酶过氧化氢催化能力的通道使其在过氧化氢催化下提高其催化能力。本发明所获得的多个突变体与野生酶进行催化活性对比，催化活性高的所在的通道为H2O2通道。此方法的应用能够提高P450酶利用过氧化氢的能力，进而提高其催化底物的活性。进而提高其催化底物的活性。