一种检测视黄醇代谢产物的试剂在制备诊断和/或尘肺病工具中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测视黄醇代谢产物的试剂在制备诊断和/或尘肺病工具中的应用。

背景技术：

2.尘肺是一种由于长期吸入致病性粉尘而引起的以肺组织弥漫性纤维化为主要特征的职业性疾病。临床表现为咳嗽、咳痰、胸闷、胸痛、呼吸困难等，病理变化以肺部炎症及弥漫性的结节性纤维化为特征。即使脱离粉尘环境，也无法阻止疾病进程，最终可能发展为甚至死亡。尘肺病常发生于接触切割，抛光，研磨石材的从业人员中，包括采石、采矿、采煤、喷砂、陶器制造、石工砌体、道路建设、岩石钻探、隧道作业珠宝抛光等。
3.尘肺病是全世界最重要的职业病之一，迄今为止，由于尘肺病机制不清，尚无有效方法。肺移植仍是晚期尘肺合并患者的最终选择。目前，尘肺病并没有改善预后和改善肺功能的方案，仅采取止咳化痰、改善气短和呼吸困难等对症措施，必要时进行消炎。
4.全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，atra)是维生素a的一种活性代谢产物。atra可调节细胞生长，增殖，分化，凋亡等相关基因，是首个应用于临床的分化诱导剂，被认为诱导异常积蓄的早幼粒细胞向成熟粒细胞分化，进而诱导细胞死亡和抑制增殖，是当下急性早幼粒细胞白血病的首选药物。但atra在尘肺纤维化中的作用仍不清楚。

技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测视黄醇代谢产物的试剂在制备检测和/或尘肺病工具中的应用，将视黄醇、atra作为筛查尘肺的生物标记物，将atra作为尘肺病的药物，效果显著。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了一种检测视黄醇代谢产物的试剂在制备尘肺病诊断工具中的应用。
8.优选的，所述视黄醇代谢产物包括全反式维甲酸、全反式维甲酸的前体物质、全反式维甲酸的代谢产物和全反式维甲酸的修饰产物中的一种或多种。
9.优选的，所述视黄醇代谢产物的检测方法包括代谢组学或靶向hplc-ms/ms。
10.优选的，所述视黄醇代谢产物的检测样本包括血浆和/或肺组织。
11.本发明还提供了全反式维甲酸、全反式维甲酸的前体物质、全反式维甲酸的代谢产物和全反式维甲酸的修饰产物中的一种或多种的组合在制备尘肺病的药物中的应用。
12.优选的，所述尘肺病包括矽肺、煤工尘肺、石墨尘肺、碳黑尘肺、石棉尘肺、滑石尘肺、水泥尘肺、云母尘肺、陶工尘肺、铝尘肺、电焊工尘肺和铸工尘肺。
13.有益效果：本发明提供了一种检测视黄醇代谢产物的试剂在制备尘肺病诊断工具中的应用，实施例中发现视黄醇代谢障碍和atra缺乏与尘肺发生密切相关，因此提出将视黄醇、atra作为筛查尘肺的生物标记物，应用到制备诊断尘肺病的相关产品中；同时对尘肺病给予atra干预能有效减缓尘肺病进展，因此首次提出将atra作为尘肺病的药物。
附图说明
14.图1为尘肺组织发生视黄醇代谢通路障碍与atra缺乏的关系图，其中a-c：pbs组和silica组差异代谢产物火山图、无监督聚类热图和kegg富集通路；d：hplc-ms/ms检测pbs和silica组小鼠肺组织和血清中atra含量；***p＜0.001；
15.图2为atra对于尘肺的影响结果图，其中a：atra实验示意图；b和c：小鼠肺功能，ic为吸气量，cst为准静态顺应性；d：小鼠右心功能，rvsp为右心室收缩压；e：小鼠he染；f和g：小鼠支气管肺泡灌洗液中il-1β和il-6浓度，balf为支气管肺泡灌洗液；h：小鼠masson染；i和j：小鼠肺组织fn-1的翻译和转录水平；k：小鼠肺组织col
‑ⅰ
的转录水平；**p＜0.01，***p＜0.001；
16.图3为维生素a缺乏(vitamin a deficiency，vad)对尘肺的影响结果图，其中a：评估vad饮食致atra缺乏对尘肺小鼠的影响示意图；b和c：小鼠肺功能；d：小鼠右心功能；e：小鼠he染；f和g：小鼠支气管肺泡灌洗液中il-1β和il-6浓度；h：小鼠masson染；i和j：小鼠肺组织fn-1的翻译和转录水平；k：小鼠肺组织col
‑ⅰ
的转录水平；**p＜0.01，***p＜0.001。
具体实施方式
17.本发明提供了一种检测视黄醇代谢产物的试剂在制备尘肺病诊断工具中的应用。
18.本发明所述视黄醇代谢产物优选包括全反式维甲酸、全反式维甲酸的前体物质、全反式维甲酸的代谢产物和全反式维甲酸的修饰产物。本发明所述视黄醇代谢产物的检测样本优选包括血浆和肺组织。本发明所述视黄醇代谢产物的检测方法优选包括代谢组学或靶向hplc-ms/ms。
19.在本发明实施例中，利用尘肺小鼠进行实验，与对照小鼠相比，尘肺小鼠肺部代谢异常，大量代谢产物显著增多或减少。尘肺发生异常代谢的通路主要包括氨酸代谢、类固醇激素代谢和视黄醇代谢等。尘肺小鼠肺组织和血清中视黄醇代谢活性产物atra均显著低于对照小鼠。而后对尘肺小鼠进行vad饮食干预以消耗体内atra，加重尘肺进展；与正常饮食vas组相比，vad组尘肺小鼠心肺功能均有不同程度的加重。病理染也显示，atra缺乏会使尘肺小鼠的炎症及纤维化程度加重。尘肺小鼠的炎症因子il-1β及il-6、纤维化因子fn-1及col
‑ⅰ
也因atra缺乏而出现增多的情况。由此证实了视黄醇代谢产物，尤其是atra可作为尘肺病的检测标志物。
20.本发明还提供了全反式维甲酸、全反式维甲酸的前体物质、全反式维甲酸的代谢产物和全反式维甲酸的修饰产物中的一种或多种的组合在制备尘肺病的药物中的应用。
21.本发明所述尘肺病优选包括根据“尘肺病诊断标准”和“尘肺病理诊断标准”可以诊断的尘肺类型，更优选包括矽肺、煤工尘肺、石墨尘肺、碳黑尘肺、石棉尘肺、滑石尘肺、水
泥尘肺、云母尘肺、陶工尘肺、铝尘肺、电焊工尘肺和铸工尘肺等。在本发明实施例中，给予尘肺小鼠atra，可明显改善尘肺小鼠心肺功能、炎症及纤维化。与对照组小鼠相比，经过atra的尘肺小鼠组的吸气量(ic)、准静态顺应性(cst)具有一定程度的好转，右心室收缩压(rvsp)也有一定程度的下降。病理染显示，atra可减少尘肺小鼠的炎症及纤维化程度。atra还可减少尘肺小鼠肺泡灌洗液(balf)中炎症因子il-1β及il-6的浓度，也可减少纤维化因子fn-1和col
‑ⅰ
的水平，因此本发明首次提出将atra作为尘肺病的药物。
22.下面结合实施例对本发明提供的一种检测视黄醇代谢产物的试剂在制备诊断和/或尘肺病工具中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
23.实施例1
24.atra尘肺有效。
25.1.1尘肺小鼠模型构建及atra给药处理
26.选取雄性c57bl/6j小鼠(8-10周龄，25-30g)饲养于spf级实验动物房，采取一次性气管滴注二氧化硅法进行尘肺造模，将小鼠分为4组(n＝9)，分别为：
①
pbs+vehicle组：给予40μl无菌pbs气管滴注，2周后，玉米油灌胃，一周3次，持续4周；
②
pbs+atra组：给予40μl无菌pbs气管滴注，2周后，atra 10mg/kg灌胃，一周3次，持续4周；
③
si+vehicle组：给予silica悬液(300mg/ml，40μl)气管滴注，2周后，玉米油灌胃，一周3次，持续4周；
④
si+atra组：给予silica悬液(300mg/ml，40μl)气管滴注，2周后，atra 10mg/kg灌胃，一周3次，持续4周。所有小鼠6周后被处死，收集相应样品以待检测。
27.1.2心肺功能检测
28.将麻醉小鼠固定在实验台上，将连接高保真压力传感器的8号针头插入右心室，直接测量有创右心室收缩压(right ventricular systolic pressure,rvsp)。rvsp由power lab数据采集和分析系统(pl 3504，ad instruments,australia)记录和分析。采用肺功能检测系统(dsibuxco，usa)检测小鼠肺功能。实验前，小鼠腹腔注射0.4ml/100g2％进行麻醉，然后切开气管，插入气管插管，连接呼吸机。接下来，pft系统自动检测frc试验、pv试验、fv试验和rc试验。选取与尘肺肺功能变化密切相关的指标进行统计分析，包括吸气量(ic)、静态顺应性(cst)。
29.1.3病理染
30.将左肺固定于4％多聚甲醛中24h，脱水后石蜡包埋切片(5μm)，分别进行he染、masson染。he染根据szapiel’s评分进行炎症评分统计；masson染根据aschroft评分进行纤维化程度评分。切片于3d histech数字活检扫描仪进行扫描，拍片及统计。
31.1.4 elisa实验
32.利用elisa试剂盒检测小鼠balf中il-1β及il-6炎症因子浓度
33.1.5western blot实验
34.提取所有小鼠肺组织蛋白质。配制10％聚丙烯酰胺凝胶，将10μg蛋白上样，随后进行电泳，80v，30min；调整电压为120v后继续电泳至结束。使用pvdf膜进行转膜，5％脱脂奶粉封闭1h，孵育一抗fn-1(abcam，1:1000)4℃过夜，二抗室温1h，最后利用化学发光法显影。然后，将条带孵育β-actin一抗，剩余步骤同上。
35.1.6 qpcr实验
36.提取所有小鼠肺组织rna，利用逆转录试剂盒(kr103，tiangen biotechnology，beijing，china)得到cdna，使用sybr green
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q-pcr试剂盒(transgen biotech,beijingchina)进行qpcr实验，数据收集及分析由bio-rad iq5系统进行。
37.表1引物序列(5'to3')
[0038][0039]
1.7结果分析
[0040]
给予尘肺小鼠atra，可明显改善尘肺小鼠心肺功能、炎症及纤维化(图2中a)。与对照组小鼠相比，经过atra的尘肺小鼠组的吸气量(ic)(图2中b)、准静态顺应性(cst)(图2中c)具有一定程度的好转，右心室收缩压(rvsp)也有一定程度的下降(图2中d)。病理染显示，atra可减少尘肺小鼠的炎症及纤维化程度(图2中e，h)。atra还可减少尘肺小鼠肺泡灌洗液(balf)中炎症因子il-1β及il-6的浓度(图2中f,g)，也可减少纤维化因子fn-1和col
‑ⅰ
的水平(图2中i-k)。
[0041]
实施例2
[0042]
vad饮食加重尘肺。
[0043]
2.1尘肺小鼠模型构建及相应特殊饮食处理。
[0044]
选取雄性c57bl/6j小鼠(8-10周龄，25-30g)饲养于spf级实验动物房，采取一次性气管滴注二氧化硅法进行尘肺造模，将小鼠分为4组(n＝9)，分别为：
①
pbs+vas组：vas饮食，维生素a充足饮食。给予小鼠8周vas饮食后进行40μl无菌pbs气管滴注，；
②
pbs+vad组：vad饮食，维生素a缺乏饮食。给予小鼠8周vad饮食后进行40μl无菌pbs气管滴注；
③
si+vas组：给予小鼠8周vas饮食后进行silica悬液(300mg/ml，40μl)气管滴注；
④
si+vad组：给予小鼠8周vad饮食后进行silica悬液(300mg/ml，40μl)气管滴注。所有小鼠在造模6周后被处死，收集相应样品以待检测。
[0045]
其余实验步骤同1.2,1.3,1.4,1.5,1.6
[0046]
2.2结果分析
[0047]
尘肺小鼠进行vad饮食干预以消耗体内atra，加重尘肺进展(图3中a)。与正常饮食vas组相比，vad组尘肺小鼠心肺功能均有不同程度的加重(图3中b-d)。病理染也显示，atra缺乏会使尘肺小鼠的炎症及纤维化程度加重(图3中e，h)。尘肺小鼠的炎症因子il-1β及il-6(图3中f，g)；纤维化因子fn-1及col
‑ⅰ
(图3中i-k)也因atra缺乏而出现增多的情况。
[0048]
实施例3
[0049]
尘肺发生视黄醇代谢障碍导致atra缺乏。
[0050]
3.1尘肺小鼠模型构建及代谢组学检测。
[0051]
选取雄性c57bl/6j小鼠(8-10周龄，25-30g)饲养于spf级实验动物房，将小鼠随机
分为2组，分别为：
①
pbs组(n＝10)
②
silica组(n＝15)。采取一次性气管滴注二氧化硅法进行尘肺造模，对照组给予等量pbs溶液。造模6周收，收取小鼠肺组织进行基于hplc-ms/ms的非靶向代谢组学检测。根据非靶向代谢组学分析结果，再次构建尘肺小鼠模型，利用hplc-ms/ms靶向定量检测尘肺小鼠和对照小鼠肺组织和血清中atra含量。
[0052]
3.2结果解读
[0053]
与对照小鼠相比，尘肺小鼠肺部代谢异常，大量代谢产物显著增多或减少(图1中a，b)。尘肺发生异常代谢的通路主要包括氨酸代谢、类固醇激素代谢和视黄醇代谢等(图1中c)。尘肺小鼠肺组织和血清中视黄醇代谢活性产物atra均显著低于对照小鼠(图1中d)。
[0054]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种检测视黄醇代谢产物的试剂在制备诊断尘肺病工具中的应用。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述视黄醇代谢产物包括全反式维甲酸、全反式维甲酸的前体物质、全反式维甲酸的代谢产物和全反式维甲酸的修饰产物中的一种或多种。3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述视黄醇代谢产物的检测方法包括代谢组学或靶向hplc-ms/ms。4.根据权利要求1或3所述应用，其特征在于，所述视黄醇代谢产物的检测样本包括血浆和/或肺组织。5.全反式维甲酸、全反式维甲酸的前体物质、全反式维甲酸的代谢产物和全反式维甲酸的修饰产物中的一种或多种的组合在制备尘肺病的药物中的应用。6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述尘肺病包括矽肺、煤工尘肺、石墨尘肺、碳黑尘肺、石棉尘肺、滑石尘肺、水泥尘肺、云母尘肺、陶工尘肺、铝尘肺、电焊工尘肺和铸工尘肺。

技术总结

本发明提供了一种检测视黄醇代谢产物的试剂在制备诊断和/或尘肺病工具中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明验证了视黄醇代谢障碍和全反式维甲酸缺乏与尘肺发生密切相关，因此提出将视黄醇、全反式维甲酸作为筛查尘肺的生物标记物，应用到制备诊断尘肺病的相关产品中；同时对尘肺病给予全反式维甲酸干预能有效减缓尘肺病进展，因此首次提出将全反式维甲酸作为尘肺病的药物。反式维甲酸作为尘肺病的药物。反式维甲酸作为尘肺病的药物。