一种检测猪PRRSV抗性的DNA甲基化分子标记及其应用

一种检测猪prrsv抗性的dna甲基化分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于抗性品种选育技术领域，更具体地，涉及一种检测猪prrsv抗性的dna甲基化分子标记及其应用。

背景技术：

2.猪繁殖与呼吸综合症(prrs)俗称蓝耳病，是由猪蓝耳病毒(prrsv)引起，也是养猪业中最严重的传染病之一，给生猪养殖业带来了巨大经济损失。尽管各国从疫苗开发、生物安全、猪健康等方面做了大量工作，但prrsv具有基因组极易发生变异和重组、免疫抑制、抗体依赖性增强、持续性感染等特点，使得prrsv的防控和清除非常困难。近年来，随着国内外对prrsv研究的深入，逐渐认识到，挖掘与prrsv易感性/抗性相关靶基因，培育抗prrsv猪可以成为防控prrsv重要手段，对猪疫病的防控具有重要的现实意义。
3.猪是否发病是病原入侵和机体防御相互作用的结果，动物机体遗传因素在疾病的发生过程扮演重要作用，不同种和不同个体在面对同一病原体感染时其抗性和易感性是不同的。prrs的流行以及非洲猪瘟的爆发，都存在一些共同的特征，即发病率和死亡率虽然很高，但仍存在一些抗病品种和一些抗病个体。研究表明中国地方猪种对prrsv有强的抵抗力，而国外猪种对prrsv易感。而梅山猪相对长白猪对prrsv有较强的抵抗力。
4.dna甲基化是目前发现最早的、可稳定遗传的表观遗传修饰之一。研究发现，dna甲基化在病毒感染过程发挥重要作用。如prrsv可通过dna甲基化修饰限制转录因子irf3的高表达，进而抑制了i型干扰素介导的抗病毒作用；在对中国地方猪抗大肠杆菌f18研究中发现，fut3基因的表达在苏太猪和梅山猪的一些易感个体中显著高于抗性强的个体，其分子机制是fut3基因启动子区的两个甲基化位点影响了转录因子(sp1、hif1a)与fut3启动子的结合。
5.因此，根据猪基因组遗传信息开展猪生长性状差异显著体在转录组、基因组以及表观遗传学上的差异特征研究，得到一种能够应用于猪抗病育种，进而获得优良遗传性状优良品种(品系)的dna甲基化的分子标记成为了目前亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

6.为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种检测猪prrsv抗性的dna甲基化分子标记及其应用。
7.第一方面，本发明提供检测猪prrsv抗性的dna甲基化分子标记，所述分子标记是针对猪mir-212启动子区内的一段富含cpg二核苷酸的序列，该序列如seq id no.1所示，将该序列中的c碱基全部转换为t碱基，然后再将tg替换成cg得到所述分子标记，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.第二方面，本发明提供用于所述分子标记的引物对，所述引物对的上、下游引物依次如seq id no.3-4所示。
9.第三方面，本发明提供一种检测猪prrsv抗性的dna甲基化的方法，包括以下步骤：
10.s1、提取待测猪基因组dna；
11.s2、亚硫酸氢盐转换dna后纯化；
12.s3、以纯化后的dna为模板，利用所述的引物对进行pcr扩增；
13.s4、对s3的扩增产物进行测序，定量检测mir-212启动子区序列的甲基化程度。
14.第四方面，本发明提供所述的分子标记在辅助猪抗prrsv育种中的应用。
15.第五方面，本发明提供一种提高猪prrsv抗性的育种方法，利用所述的方法检测猪mir-212启动子区序列的甲基化程度，筛选出甲基化程度低的个体作为育种亲本。
16.本发明的有益效果在于：
17.本发明通过前述分子标记设计了针对mir-212启动子区序列的dna甲基化引物，可用于有效、准确、定量检测猪mir-212启动子区序列dna甲基化程度。本发明提供的猪prrsv抗性的dna甲基化分子标记可作为新型的表观遗传分子标记，为培育具prrs抗性的猪分子育种提供理论依据和遗传基础。
附图说明
18.图1为梅山猪mir-212甲基化水平。实心圆代表甲基化，空心圆代表未甲基化。
19.图2为长白猪mir-212甲基化水平。实心圆代表甲基化，空心圆代表未甲基化。
20.图3为mir-212在梅山和长白猪肺组织表达水平，纵坐标为mir-212的相对表达水平。
21.图4为mir-212在prrsv感染前后的表达水平，纵坐标为mir-212的相对表达水平。
22.图5为mir-212对prrsv复制的影响。a为mir-212mimic抑制prrsv复制，纵坐标为prrsv的拷贝数；b为mir-212inhibitor抑制prrsv复制，纵坐标为prrsv的拷贝数；c为mir-212mimic抑制prrsv n蛋白表达；d为mir-212inhibitor抑制prrsv n蛋白表达。
具体实施方式
23.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
24.实施例1：猪基因组dna的提取及质量鉴定
25.利用苯酚/氯仿抽提法提取dna，具体步骤如下：
26.(1)取梅山和长白一月龄肺组织块0.1g(0.5cm3)，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml离心管中，加入蛋白酶k(500ug/ml)20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12-24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
27.(2)加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100μl吸头挑出，凉干，用200μl te重新溶解。(可进行pcr反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行。)
28.(3)加等量的酚，氯仿，异戊醇(25:24:1)、振荡混匀，离心12000rpm，5min。
29.(4)取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿，异戊醇(24：1)，振荡混匀，离心12000rpm，5min。
30.(5)取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/l乙酸氨加入2倍体积的无水乙
醇，混匀后室温沉淀2min，离心12000rpm，10min。
31.(6)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。
32.(7)用1ml 70％乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000rpm，5min。
33.(8)小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。
34.(9)加200ul te重新溶解沉淀物，然后使用thermo nano drop 2000spectrophotometer对所提取的dna进行浓度和纯度的测定。检测合格后的dna样品置于-20℃保存。
35.实施例2：猪mir-212启动子区cpg岛的扩增
36.1、亚硫酸氢盐处理dna样品
37.使用epitec bisulfite handbook(59104)转换dna，先在buffer bw中加入30ml无水乙醇，使用前需颠倒混匀；在buffer bd中加入27ml无水乙醇，同样使用前需颠倒混匀。将dna样品以及所有的buffer平衡到室温。
38.亚硫酸氢盐转换dna：
39.(1)每管bisulfite mix加入800μlrnase-free water，振荡混匀至完全溶解，也可以60℃水浴溶解。
40.(2)反应体系的配制，见表1，需注意：dna solution与rnase-free water总体积必须达到20μl。
41.表1dna转换反应体系
[0042][0043][0044]
(3)盖上盖子，混匀反应体系，室温下等其由绿变成蓝进行下一步操作。
[0045]
(4)在pcr仪上进行亚硫酸氢盐的dna转换，程序如表2。
[0046]
表2dna转换反应程序
primer 0.3μl,dna 1μl,ddh2o up to 25.0μl；反应程序为95℃2min，95℃30s,55℃30s,72℃30s,72℃10min,35个循环。
[0064]
4、pcr扩增产物的检测与回收
[0065]
取5μl pcr扩增产物混合少量loading buffer，以1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物扩增结果，用百泰克公司生产的胶回收试剂盒回收目的条带。
[0066]
a.将pcr扩增产物完全加入琼脂糖凝胶胶孔，等条带完全电泳分开后，在长波紫外灯下切下含有目的片段的凝胶，放入干净的1.5ml离心管中；
[0067]
b.根据胶块大小，适量加入200-400μl的溶胶结合液；
[0068]
c.56℃水浴溶胶，直至胶溶解，溶胶过程中每1-2min摇动离心管，加速溶解；
[0069]
d.将c步骤所得液体吸入吸附柱中，12000r/min离心1min；
[0070]
e.弃废液，加700μl漂洗液入吸附柱中，12000r/min离心1min；
[0071]
f.弃废液，将吸附柱放入一个新的离心管，12000r/min空离2min；
[0072]
g.将吸附柱放入另一新的1.5ml离心管中，向吸附膜的中央部位加入25μl的ddh2o，37℃放置2min，继而12000r/min离心1min，离心管中所得到的液体即为纯化后的产物，-20℃保存。
[0073]
5、回收产物与克隆载体的连接及转化
[0074]
(1)连接反应
[0075]
本试验使用的克隆载体为pmd18-t，连接体系如下所示，16℃反应3h。
[0076]
pmd18-t vector
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1μl
[0077]
solution i
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5μl
[0078]
回收产物
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
4μl；
[0079]
(2)连接产物的转化
[0080]
a.于超净工作台上吸取5μl的连接产物加入含有50μl感受态细胞的1.5ml离心管中，充分混匀，冰浴30min；
[0081]
b.42℃热激1.5min，再次冰浴2min；
[0082]
c.加入400μl无amp的lb液体培养基，37℃，220r/min摇床培养60min；
[0083]
d.6000r/min，离心6min收集细胞，剩80μl上层培养基；
[0084]
e.将细胞吹打均匀，涂布于已经制备好的lb固体培养基上，37℃培养1h后将平皿倒置，过夜培养。
[0085]
(3)阳性克隆的筛选及测序
[0086]
a.于超净工作台上用灭菌头挑取过夜培养的平皿上的单菌落，置于事先加入400μl含有amp的lb液体培养基的1.5ml的离心管中，每皿挑取6个单菌落。
[0087]
b.37℃，220r/min摇床培养4h。
[0088]
c.以1μl菌液为模板，以原特异性扩增引物或pmd18-t的通用引物扩增，电泳检测，筛选阳性克隆送测。
[0089]
d.将测序的结果进行比对分析，鉴定不同猪种mir-212启动子区序列的甲基化程度。
[0090]
实施例3：梅山猪和长白猪mir-212启动子区cpg岛的甲基化分析
[0091]
将实施例2扩增出的目的片段回收，连t载后进行测序，在总长382bp的pcr产物中
共测得35个cg位点。每个样品至少测10个单克隆，然后将测序正确的结果提交到在线软件quma(http://quma.cdb.riken.jp/)进行甲基化的统计分析并作出相应图。甲基化测序结果显示：梅山猪肺组织mir-212启动子区cpg岛发生甲基化的cg位点较少(0.44％，图1)，而长白猪mir-212启动子去甲基化的cg位点较梅山猪多(8.9％，图2)。有研究通过肌肉注射prrsv毒株到28日龄的梅山猪和长白猪体内，结果表明梅山猪的抵抗力要强于长白猪，而长白猪对prrsv的易感性明显高于梅山猪(肖犟，2010)。故推测长白猪mir-212启动子区甲基化水平高于梅山猪mir-212启动子区甲基化水平，导致mir-212在长白猪的表达水平较梅山猪低，进而影响不同猪种对prrsv抗性的差异。
[0092]
实施例4：mir-212在梅山猪与长白猪、及prrsv感染前后表达水平检测
[0093]
采用trizol法提取一月龄梅山猪和长白猪肺组织样品rna、prrsv感染前后marc-145细胞总rna。通过茎环法反转录mir-212的cdna，并通过rt-qpcr检测mir-212在梅山猪和长白猪中的表达水平以及感染前后mir-212，以u6为内参，定量引物和茎环引物序列见表4。结果表明，梅山猪肺组织中mir-212的表达水平显著高于长白猪(图3)，prrsv感染后，mir-212的表达水平显著降低。
[0094]
表4mir-212定量检测引物序列
[0095][0096]
实施例5：mir-212抑制prrsv的复制
[0097]
接种：将所培养好的marc-145细胞按每孔1
×
105的数量接种6孔板，每孔加2ml的含10％的胎牛血清的dmem(高糖培养液)于37℃，5％ co2条件下培养。
[0098]
脂质体转染：待细胞密度达到70％～80％时更换无血清的opti培养液(购自invitrogen)，放入培养箱准备转染。转染前先将mir-212mimic，mir-212inhibitor，以及对照组nc mimic、nc inhibitor分别用opti稀释，按每孔10μl的mirna和250μl opti分别配制混合液，同时转染试剂lip2000按每孔8μl和250μl opti配制混合液，室温放置5min，然后将两种稀释液混合，室温放置20min进行转染，每孔加500μl配置好的混合液，用opti补到总体积至2ml。转染后4～6h更换dmem并感染moi＝0.1(病毒感染复数)的prrsv，吸附1h后更换正常的培养液。
[0099]
表3合成的mirnas mimic和inhibitor的序列
[0100][0101]
prrsv拷贝数检测：在感染prrsv 36h后收集细胞，提取细胞总rna和总蛋白，将提取的细胞总rna，反转录为cdna。通过绝对荧光定量pcr检测prrsv的复制，绝对荧光定量体系为10μl：5μl sybr green i realtime pcr mix、上游引物orf7-f和下游引物orf7-r各0.15μl、1μl cdna、0.4μl probe-orf7和3.3μl双脱水。探针(genbank:hm853673.2)和引物序列如下表4：
[0102]
表4 qrt-pcr所用引物
[0103][0104]
反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，64℃退火20s，72℃延伸15s并收集荧光信号，40个循环。
[0105]
结果显示感染prrsv 36h后，mir-212的相对表达量显著降低(图4)，转染mir-212 mimic能够显著(p《0.05，图5a)的抑制prrsv的拷贝数，反之，mir-212 inhibitor能够显著(p《0.05，图5b)的增加prrsv的拷贝数。western blot结果表明，mir-212能够显著的抑制prrsv n蛋白的表达(图5c，5d)。这与mrna水平上的验证结果一致，说明mir-212能够显著地抑制prrsv的增殖。
[0106]
实施例6：检测猪prrsv抗性的dna甲基化分子标记在辅助猪抗prrsv育种中的应用，包括以下步骤：
[0107]
s1、提取待测猪基因组dna；
[0108]
s2、亚硫酸氢盐转换dna后纯化；
[0109]
s3、以纯化后的dna为模板，利用seq id no.3-4所示引物对进行pcr扩增；
[0110]
s4、对s3的扩增产物进行测序，定量检测mir-212启动子区序列的甲基化程度和差异甲基化位点；
[0111]
筛选出甲基化程度低的个体作为育种亲本。
[0112]
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0113]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精
神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

技术特征：

1.一种检测猪prrsv抗性的dna甲基化分子标记，其特征在于，所述分子标记是针对猪mir-212启动子区内的一段富含cpg二核苷酸的序列，该序列如seq id no.1所示，将该序列中的c碱基全部转换为t碱基，然后再将tg替换成cg得到所述分子标记，其核苷酸序列如seq id no.2所示。2.用于扩增权利要求1所述分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对的上、下游引物依次如seq id no.3-4所示。3.一种检测猪prrsv抗性的dna甲基化的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、提取待测猪基因组dna；s2、亚硫酸氢盐转换dna后纯化；s3、以纯化后的dna为模板，利用权利要求2所述的引物对进行pcr扩增；s4、扩增产物进行测序，检测mir-212启动子区序列的甲基化位点及甲基化程度。4.权利要求1所述的分子标记在辅助猪抗prrsv育种中的应用。5.一种提高猪prrsv抗性的育种方法，其特征在于，利用权利要求3所述的方法检测猪mir-212启动子区序列的甲基化程度，筛选出甲基化程度低的个体作为育种亲本。

技术总结

本发明属于抗性品种选育技术领域，更具体地，涉及一种检测猪PRRSV抗性的DNA甲基化分子标记及其应用。所述分子标记是针对猪miR-212启动子区内的一段富含CpG二核苷酸的序列，该序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列中的C碱基全部转换为T碱基，然后再将TG替换成CG得到所述分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过前述分子标记设计了针对miR-212启动子区序列的DNA甲基化引物，可用于有效、准确、定量检测猪miR-212启动子区序列DNA甲基化程度。本发明提供的猪PRRSV抗性的DNA甲基化分子标记可作为新型的表观遗传分子标记，为培育具有PRRS抗性的猪分子育种提供理论依据和遗传基础。基础。基础。