具有改善的半衰期的细胞外囊泡的制作方法

1.本发明涉及具有改善的药代动力学概况、增加的半衰期和增加的体内肿瘤积累以及在储存时增加的稳定性的遗传工程改造的细胞外囊泡(ev)。本发明还涉及所述ev在疗法中的用途、生产所述ev的方法和所述ev的纯化。

背景技术：

2.ev(如外泌体)通常为纳米大小的囊泡，其由大多数细胞类型内源性产生，并且用作细胞之间蛋白质、核酸、肽、脂质和各种其他分子的身体的天然运输系统。ev具有许多潜在的用途，并且ev已经被研究作为蛋白质、核酸和小分子剂的递送载体。然而，ev用于疾病的有前景的潜在临床应用目前受到ev在特别是静脉内施用后的快速清除的影响。由于短的半衰期，大多数非靶向的ev回到肝脏和脾脏，这意味着非靶向的ev疗法的应用主要集中在这些靶器官上。
3.ev在体内的短循环时间是开发其可观的潜力的主要限制之一。此外，已知ev主要由肝脏和脾脏摄取。这种独特的生物分布模式意味着靶向除了肝脾系统以外的器官需要大剂量和/或包含特异性靶向部分以将ev导向其他靶器官，这是本发明试图克服的问题。期望将ev从通过肝脏和脾脏的摄取中转移出来，使得这将增加向其他器官的递送，并且因此改善生物分布(尤其是靶向的ev，例如向大脑的递送)。
4.存在许多常用技术以增加药物和生物制品的半衰期。通常，使用延长半衰期的四种一般策略之一：
5.1)药理学活性肽或蛋白质与天然长半衰期蛋白质或蛋白质结构域的非共价结合或遗传融合，例如fc融合、转铁蛋白或白蛋白融合，或与惰性多肽(例如，xten、同-氨基酸聚合物、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物或弹性蛋白样肽)的融合。
6.2)通过药理学活性肽或蛋白质与重复化学部分(例如，与聚乙二醇(peg)(聚乙二醇化)或透明质酸)的化学缀合，增加流体动力学半径。
7.3)通过多唾液酸化(polysialylation)显著增加药理学活性肽或蛋白质的负电荷；或者，可替代地，融合带负电荷的、高度唾液酸化的肽(例如，羧基末端肽[ctp；绒毛膜促性腺激素(cg)β-链的])，已知延长如人cgβ-亚基的天然蛋白质对生物药物候选物的半衰期。
[0008]
4)用不同长度和结构的peg包被或缀合药剂(例如，脂质或聚合物纳米颗粒或性蛋白质)，以便降低货物分子的静电荷并保护其免受免疫系统细胞、肾脏或肝脏清除机制的影响。
[0009]
除了聚乙二醇化，所有这些目前的方法仅已在临床上成功地用于重组蛋白或在一些情况下用于rna剂，但从未用于纳米颗粒形式的大分子组件，如ev，其受到体内完全不同的生物物理和免疫学考虑因素的影响。特别是，ev除了比单一蛋白质或rna剂大得多之外，还携带非常不同的电荷，这使得将改变药代动力学/药效学的现有方法转化为ev的情况非常不可预测。
[0010]
然而，上述现有方法具有一些明显的缺点。对fc融合的主要关注是稳定性、接头和融合蛋白中的异常糖基化，而对hsa融合的主要关注是生物分布可能更局限于特定器官。fc蛋白的融合也很庞大，并且会导致融合蛋白干扰剂的活性的问题。
[0011]
过去曾尝试过ev的聚乙二醇化，但收效甚微。首先，在不干扰ev拓扑和表型的情况下，将peg与ev缀合是有挑战的。其次，peg是人工物质，其当被注射时可能会产生毒副作用。此外，它还具有免疫原性，这也可能导致毒性以及药物产品从循环中的清除。
[0012]
在ev的情况下使用唾液酸化来增加它们的半衰期是不太可能起作用的，因为存在识别驱动某些ev亚类的摄取的唾液酸化部分的受体。例如，b细胞外泌体被脾脏中的唾液酸粘附素摄取。此外，增加ev上的糖基化模式并不像对于更简单的蛋白质剂那样容易，因为ev已经包括覆盖ev的膜(类似于质膜)；因此它们在它们的表面上已经具有糖基化的蛋白质。已知ev上常见的蛋白质被高度糖基化，因此带负电荷。因此，增加ev表面的唾液酸化可能没有益处。

技术实现要素：

[0013]
因此，本发明的目的是克服上述与ev的半衰期和生物分布相关的问题。
[0014]
在第一方面，本发明涉及被修饰以包括至少一个存在于ev的表面上的白蛋白结合结构域(abd)的ev。abd可以与ev蛋白形成融合蛋白的一部分，任选地，其中ev蛋白是跨膜ev蛋白或与ev膜的外表面缔合的ev蛋白。
[0015]
在第二方面，本发明涉及根据第一方面的用于产生ev的方法，其包括：(i)将至少一种编码abd-ev蛋白融合构建体的多核苷酸构建体引入到产生ev的细胞中；和(ii)在产生ev的细胞中表达所述构建体，从而产生包括存在于ev的表面上的abd的ev。
[0016]
在第三方面，本发明涉及一种药物组合物，其包括至少一种第一方面的ev和药学上可接受的赋形剂或载剂。
[0017]
在第四方面，本发明涉及用于药物的第一方面的ev和/或第三方面的药物组合物。
附图说明
[0018]
图1：显示融合构建体在稳定细胞中的良好表达的蛋白质印迹。
[0019]
图2：显示融合构建体在ev中的良好表达的蛋白质印迹。
[0020]
图3：体内半衰期延长，其显示abd的存在显著增加了循环中ev的半衰期，并且通过使它们更稳定，导致与对照ev相比循环中的ev多14倍以上。
[0021]
图4：abd ev的体内生物分布，其显示与对照ev相比靶器官中的ev的显著的倍数增加。
[0022]
图5：abd ev的体内生物分布，其显示与对照ev相比abd ev的肿瘤积累。
[0023]
图6：abd ev的体内生物分布，其显示与对照ev相比abd ev的淋巴结积累。
[0024]
图7：abd-ev白蛋白体外结合测定，其显示与对照ev相比，abd ev能够结合白蛋白。
[0025]
图8：与对照ev相比，abd ev结合白蛋白的能力的流式细胞术分析。
[0026]
图9：另外的abd-ev白蛋白体外结合测定，其测试一系列额外的构建体。
[0027]
图10：另外的体内半衰期延长实验测定，其测试一系列额外的构建体。
[0028]
图11：体外白蛋白结合数据与体内血浆半衰期延长数据相结合，用于表达与单程
跨膜ev蛋白融合的abd的ev。
[0029]
图12：abd ev体内生物分布，其显示与对照ev相比abd ev的淋巴结和肿瘤积累。
[0030]
图13：显示通过不同施用途径递送后abd ev在血浆中的半衰期的图。
[0031]
图14：显示来源于替代细胞来源的abd ev的改善的血浆半衰期的图。
[0032]
图15：梯度分离(斑点印迹定量)和宽视野显微镜图像，其显示白蛋白和表达abd的ev的共定位。
[0033]
图16：显示以定量的斑点印迹表示的体内abd结合测定的图，证实表达abd的体内ev结合白蛋白。
[0034]
图17：通过斑点印迹的另外的梯度分离分析，其显示abd ev结合白蛋白。
[0035]
图18：概述融合蛋白的构建体设计的示意图。
具体实施方式
[0036]
本发明涉及包括至少一种存在于ev的表面上的abd的ev。本发明还涉及制备和纯化那些ev的方法及其在疗法中的用途。由于在其表面上abd的存在，本发明的ev具有许多明显的优点。不希望受理论的束缚，主要是存在于ev的表面上的abd能够延长ev在循环中的半衰期，可能是通过介导ev和血清白蛋白之间的相互作用。半衰期的这种延长可以广泛应用于任何和所有ev。它适用于装载了任何货物和任何靶向部分的ev，即本发明对货物或靶向部分没有特异性；它是广泛适用的。先前增加生物制品的半衰期的尝试需要对所讨论的生物制品进行特定定制。本发明的显著之处在于，其不适用于性货物，而是适用于递送囊泡，因此使得其极其适合于增加能够被装载到ev中或ev上的任何货物分子的半衰期。不希望受理论的束缚，abd ev的增加的半衰期也会导致abd ev的改变的生物分布。ev生物分布的这种改变，以及因此ev中或ev上携带的药物货物的药物动力学的这种改变，对于延长ev的循环时间和提高性ev的靶向的递送的机会是至关重要的。白蛋白蛋白也能够与再循环受体fcrn结合，其参与受体介导的内吞作用。因此，能够将ev或外泌体摄取到靶细胞和/或组织中。不希望受理论的束缚，由于更高的有效载荷被递送到目标器官，这导致更大的功效。例如，abd ev非常适合于靶向大脑。通过利用蛋白质(如白蛋白)，还可以避免增加ev的半衰期的已知方法(如聚乙二醇化)的所有上述缺点。
[0037]
为了方便和清楚起见，在下文中收集并描述了本文中所采用的某些术语。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在说明书中，单数形式也包含复数形式，除非上下文另有明确说明；作为实例，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”应被理解为单数或复数，并且术语“或”应被理解为包含性的。作为实例，“一个元件”意指一个元件或多个元件。在整个本说明书中，词语“包括(comprising)”或其变体(如“comprises”或“comprising”)将被理解为暗示包含所述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。“约”可以理解为在规定值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非上下文另有说明，否则本文提供的所有数值都用术语“约”修饰。
[0038]
尽管类似或等效于本文所述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本公开，但下文描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有公开、专利申请、专利和其他参
考文献均通过引用整体并入。本文引用的参考文献不被认为是要求保护的发明的现有技术。在发生冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。本公开的其他特征和优点将根据以下具体实施方式以及权利要求书而变得显而易见。
[0039]
在本发明的特征、方面、实施例或替代方案以马库什组的形式进行描述的情况下，本领域的技术人员将认识到，本发明也由此以马库什组的任何单独成员或成员子组的形式进行描述。本领域技术人员将进一步认识到，本发明还由此以马库什组的单独成员或成员的子组的任何组合的形式进行描述。另外，应注意，结合本发明的各方面和/或各实施例之一进行描述的实施例和特征在进行必要的修改后还适用于本发明的所有其他方面和/或实施例。例如，本文结合ev所述的abd蛋白和abd融合蛋白/多肽应被理解为与本文的所有其他方面、教导和实施例公开、相关和相容，例如与用于产生或纯化ev的方法相关的方面和/或实施例，或与本文所述的相应多核苷酸构建体或ev来源于的工程改造的产生ev的细胞相关的方面和/或实施例。此外，结合某些方面描述的某些实施例，例如如结合涉及某些医学适应症的方面描述的包括性货物分子和任选地融合多肽的ev的施用途径，自然也可以与其他方面和/或实施例(如与包括此类ev的涉及药物组合物的那些方面和/或实施例)相关。此外，本文鉴定的所有多肽和蛋白质可以使用用于融合多肽的常规策略在融合蛋白中自由组合。作为非限制性实例，本文所述的白蛋白结合结构域蛋白可以以任何组合与一种或多种ev蛋白自由组合，任选地与本文的所有其他多肽结构域、区域、序列、肽、基团(例如任何多聚化结构域、接头序列、释放结构域、性货物分子、内体逃逸结构域和/或靶向部分)组合。此外，任何和所有特征(例如，马库什组的任何和所有成员)可以自由地与任何和所有其他特征(例如，任何其他马库什组的任何和所有成员)组合，例如，任何abd可以与任何ev蛋白组合。此外，当本文的教导以单数形式提及ev和/或作为离散的天然纳米颗粒样囊泡提及ev时，应当理解，所有此类教导对于多种ev和ev的体同等相关并且适用于多种ev和ev的体。总的来说，白蛋白结合结构域、ev蛋白、产生ev的细胞来源、额外的结构域和部分、性货物分子、靶向部分和根据本发明的所有其他方面、实施例和替代方案可以以任何和所有可能的组合自由组合，而不偏离本发明的范围和主旨。此外，本发明的任何多肽或多核苷酸或任何多肽序列或多核苷酸序列(分别为氨基酸序列或核苷酸序列)可以显著偏离原始多肽、多核苷酸和序列，只要任何给定的分子保留了实现与其相关的期望的技术效果的能力。只要它们的生物学性质被保持，与天然序列相比，根据本技术的多肽和/或多核苷酸序列可以偏离多达50％(使用例如blast或clustalw计算)，尽管尽可能高的序列同一性或相似性是优选的(例如，60％、70％、80％，或者例如90％或更高)。本领域的标准方法可以用于确定序列同一性或同源性。例如，pileup和blast算法可以用于计算同源性或排列序列。例如几种多肽的组合(融合)意味着相应多肽的某些区段可以被替换和/或修饰和/或序列可以通过插入其他氨基酸片段被中断，这意味着只要关键性质(例如，结合白蛋白并因此延长半衰期的能力、将融合构建体转运至ev的能力、靶向能力等)是保守的，与天然序列的偏离可以是相当大的。因此，类似的推理自然适用于编码此类多肽的多核苷酸序列。本文中提及的与肽、多肽和蛋白质相关的任何seq id no应仅被视为实例，并且仅供参考，并且所有肽、多肽和蛋白质应被赋予其普通含义，如技术人员所理解的那样。因此，如上所述，本领域技术人员也将理解，本发明不仅涵盖本文提及的特定seq id nos和/或登录号，而且还
包括其变体和衍生物，例如，从seq id nos:5-10中去除his标签(hhhhhh)。本文提及的所有蛋白质、多肽、肽、核苷酸和多核苷酸应根据如本领域技术人员理解的其常规含义来解释。
[0040]
如本文使用的术语“至少一个”可以意指至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个。
[0041]
如本文所用，术语“半衰期”和“t1/2”可以意指当在生物体的全血中循环时，物质的血浆浓度将其稳态(血浆半衰期)减半所花费的时间。
[0042]
术语“细胞外囊泡”或“ev”或“外泌体”或“遗传修饰的/遗传工程改造的ev/外泌体”，或“工程改造的/修饰的ev/外泌体”在本文中可互换使用并且可以被理解为涉及可从任何形式的细胞获得的任何类型的囊泡，例如微囊泡(例如，从细胞的质膜脱落的任何囊泡)、外泌体(例如，来源于内体、溶酶体和/或内溶酶体通路和/或来自细胞的质膜或任何其他细胞膜的任何囊泡)、凋亡小体(可从凋亡细胞、arrdc1介导的微囊泡(armm)(含有蛋白1[arrdc1]-介导的微囊泡的抑制蛋白结构域)获得)、微粒(其可以来源于血小板)、核外颗粒体(可来源于例如血清中的嗜中性粒细胞和单核细胞)、前列腺颗粒体(例如，可从前列腺癌细胞获得)或心脏体(例如，可来源于心脏细胞)等。外泌体、微囊泡和armm代表特别优选的ev，但其他ev在各种情况下也可能是有利的。术语“遗传修饰的”和“遗传工程改造的”ev表示ev来源于通常包括重组融合蛋白产物的遗传修饰的/工程改造的细胞，该重组融合蛋白产物被并入到由这些细胞产生的ev中。术语“修饰的ev”表示囊泡已经使用遗传方法或化学方法进行了修饰，例如经由产生ev的细胞的遗传工程或经由例如化学缀合进行修饰，例如以将部分连接到外泌体表面。
[0043]
ev的尺寸可能会有很大差异，但是ev通常具有纳米尺寸的流体动力学半径，即半径低于1000nm。外泌体通常具有30nm至300nm的尺寸，通常在40nm至250nm的范围内，这是非常合适的尺寸范围。很明显，ev可以来源于任何细胞类型，包括体内、离体和体外(来源细胞的另外的细节将在下文描述)。
[0044]
术语“白蛋白结合结构域”或“abd”可以理解为涉及能够与白蛋白结合的任何蛋白质、肽、抗体或纳米抗体，或其片段或结构域。abd可以来源于任何物种；优选地，abd对人血清白蛋白(hsa)具有特异性结合亲和力。通常已知的abd是针对白蛋白或abd的抗体或纳米抗体，其来源于来自大消化链球菌(peptostreptococcus magnus)的pab蛋白和来自c组和g组链球菌的g蛋白，两者都以高亲和力与白蛋白结合。
[0045]
abd是在各种表面蛋白中发现的小的三螺旋蛋白结构域，其通常由例如革兰氏阳性菌表达。可以通过特异性诱变对abd进行工程改造，以实现对不同白蛋白的更广泛特异性、增加的稳定性、较低的免疫原性或改善的结合亲和力。本发明中由abd结合的白蛋白可以是重组白蛋白或来源于任何物种的白蛋白，但优选地它是hsa。
[0046]
本发明中使用的示例性的abd序列包含：seq id no:1(g418-ga3、abd001(wt))、seq id no:2(abd011)、seq id no:3(abd013)和seq id no:4(abd035)。本发明还涵盖这些序列的变体或衍生物，其与这些序列具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列同一性或同源性，并且能够与白蛋白结合。本发明涉及包括存在于ev的表面上的abd的ev，其中abd与seq id nos:1-4中的任何一个具有约50％、60％、70％、80％、90％或95％的序列同一性或同源性。可以使用本领域中已知的标准肽合成方法来合成abd。
[0047]
本发明的abd可以是能够与白蛋白结合的抗体、单链可变片段(scfv)纳米抗体、重
链抗体(hcab)、单结构域抗体(sdab)如vhh或vnar或其片段。sdab和抗体片段是特别优选的，因为它们的小尺寸，这允许将其他额外的结构域引入融合蛋白以及简单的构建体产生和表达。
[0048]
根据本发明的abd存在于ev的表面上，使得它们能够与主要在待的患者的循环系统中发现的白蛋白结合或存在于药物产品配方中或在施用于患者之前ev所暴露的任何储存缓冲液或其他溶液中的白蛋白。abd可以以本领域技术人员已知的多种方式存在于ev的表面上，只要abd暴露于ev的外表面，使得它能够结合白蛋白。通常，abd将与ev蛋白形成融合蛋白的一部分。ev可以包括多于一个abd，即多个abd。多个abd可以彼此相同或不同。
[0049]
本发明不需要在融合构建体中包含完整的白蛋白蛋白(如在过去通常是用于增加生物制品的半衰期的方法)。而是，本发明依赖于在注射到循环中之后ev与受试者的天然白蛋白的结合或与存在于例如配方或缓冲液中的白蛋白的离体结合。白蛋白具有66.5kda的mr；abd通常比白蛋白本身小得多。不希望受理论的束缚，abd的较小尺寸允许更简单地产生稳定的细胞系，使更多拷贝的abd能够融合到本发明的融合多肽中，并且也是有益的，因为较小的尺寸更好地允许其他蛋白(如货物蛋白和/或靶向部分)被包含在相同的融合构建体中。不希望受理论的束缚，这可以允许abd ev充当高度灵活的平台，从该平台中可以生产任何数量的不同性ev，因为abd ev能够容易地被修饰，以适应更多的货物和/或靶向部分。
[0050]
在一个实施例中，本发明的ev包括至少一种存在于ev的表面上的abd，其中abd与ev蛋白形成融合蛋白的一部分。
[0051]
在另一个实施例中，本发明的ev包括至少一种存在于ev的表面上的abd，其中abd与跨膜ev蛋白或与ev膜的外表面缔合的ev蛋白形成融合蛋白的一部分。包含ev蛋白作为与abd融合的一部分使得abd能够主动装载到ev中，因为ev蛋白的存在主动驱动融合构建体装载到ev中。用于该融合蛋白的ev蛋白可以是单程或多程跨膜蛋白。
[0052]
包括在根据本发明的融合蛋白中的ev蛋白可以选自由以下非限制性实例组成的组：cd9、cd53、cd63、cd81、cd54、cd50、flot1、flot2、cd49d、cd71、cd133、cd138、cd235a、aaat、at1b3、at2b4、alix、膜联蛋、basi、basp1、bsg、内居蛋白(syntenin)-1、内居蛋白-2、lamp2、lamp2a、lamp2b、tsn1、tsn3、tsn4、tsn5 tsn6、tsn7、tspan8、tsn31、tsn10、tsn11、tsn12、tsn13、tsn14、tsn15、tsn16、tsn17、tsn18、tsn19、tsn2、tsn4、tsn9、tsn32、tsn33、tnfr、tfr1、多配体聚糖-1、多配体聚糖-2、多配体聚糖-3、多配体聚糖-4、cd37、cd82、cd151、cd224、cd231、cd102、notch1、notch2、notch3、notch4、dll1、dll4、jag1、jag2、cd49d/itga4、itgb5、itgb6、itgb7、cd11a、cd11b、cd11c、cd18/itgb2、cd41、cd49b、cd49c、cd49e、cd51、cd61、cd104、clic1、clic4、白细胞介素受体、免疫球蛋白类、mhc-i或mhc-ii组分、cd2、cd3ε、cd3ζ、cd13、cd18、cd19、cd30、cd34、cd36、cd40、cd40l、cd44、cd45、cd45ra、cd47、cd53、cd86、cd110、cd111、cd115、cd117、cd125、cd135、cd184、cd200、cd279、cd273、cd 274、cd362、col6a1、agrn、egfr、fprp、gapdh、glur2、glur3、gp130、gpi锚定蛋白、gtr1、hlaa、hla-dm、hspg2、ita3、乳凝集素、l1cam、lamb1、lamc1、limp2、myof、arrdc1、atp2b2、atp2b3、atp2b4、bsg、igsf2、igsf3、igsf8、itgb1、itga4、atp1a2、atp1a3、atp1a4、itga4、slc3a2、atp转运蛋白、atp1a1、atp1b3、atp2b1、lfa-1、lgals3bp、mac-1α、mac-1β、mfge8、富含肉豆蔻酰化丙氨酸的蛋白激酶c底物(marcks)蛋白家族的成员，如marcksl1、基质金属蛋
白酶-14(mmp14)、pdgfr、ptgfrn、prph2、rom1、slit2、slc3a2、ssea4、stx3、tcra、tcrb、tcrd、tcrg、tfr1、upk1a、upk1b、vti1a、vti1b、和任何其他ev蛋白，及其任何组合、衍生物、结构域、变体、突变体或区域。可以将突变引入到ev蛋白的野生型序列中以改变其功能。根据本发明的优选的突变体是cd63(y235a)。不希望受理论的束缚，ev蛋白的使用具有驱动abd加载到ev中的作用，使得abd主动加载到ev中(如上)。因此，ev蛋白有时被称为载剂蛋白。特别有利的ev蛋白包含四次跨膜蛋白、cd63、cd81、cd9、cd82、cd44、cd47、cd55、lamp2b、limp2、icam、整联蛋白、arrdc1、多配体聚糖、内居蛋白、tnfr、tfr1和alix以及其衍生物、结构域、变体、突变体或区域。
[0053]
在另一个实施例中，本发明的ev包括至少一种存在于其表面上的abd，其中abd被工程改造到多程跨膜蛋白的一个或多个囊泡外环中，任选地其中多程跨膜蛋白是四次跨膜蛋白，如cd36、cd9、cd81或tspan1-tspan33中的任何一个。abd可以被融合到多程跨膜ev蛋白的第一、第二、第三、第四或任何后续环中，或者被融合到环中的多于一个环中。合适地，abd被融合到多程跨膜ev蛋白的第一、第二或任何后续环中。本发明人惊奇地发现，将abd并入到跨膜蛋白的环中并不阻止融合蛋白的表达，也不阻止其插入膜中，并且重要的是，已经显示跨膜蛋白的环中的abd也不影响abd的结构和功能，尽管存在这种高度典型的融合蛋白位置。有利地，abd可以被并入到所述多程跨膜蛋白的环中的多于一个环中，和/或多于一个abd(即多个abd)可以被并入到所述多程跨膜蛋白的每个环中。存在于一个或多个环中的多个abd可以是相同或不同的abd。本技术中的数据显示，多于一个abd可以被并入到跨膜融合蛋白中，而不影响跨膜蛋白的表达。每个跨膜ev蛋白存在多于一个abd意味着每个表达的融合蛋白更多的白蛋白分子可以与ev结合。这是有利的，因为它增加了包被ev的白蛋白的量，从而增加了abd的屏蔽效果。这反过来增加了abd ev的半衰期，同时允许额外的构建体在相同的ev中表达，例如，额外的构建体可以包括性货物和/或靶向部分。将abd工程改造到多程跨膜ev蛋白的一个环中，并将另一个实体(如靶向实体或性货物蛋白)工程改造到同一跨膜ev蛋白的另一个环中，允许将不同组分多重化到单一融合蛋白中，这显著地增加所得ev的多功能性。特征的多重化使这种工程改造的ev能够成为高度通用的平台技术，其中可以相对容易地添加或更换部件零件。在技术上，在单个ev蛋白上具有多于一个特征也更简单，因为它只需要产生单个稳定的细胞系，但产生具有多个不同功能元件的ev。
[0054]
在另一个实施例中，abd可以与ev蛋白的n末端结构域(ntd)或c末端结构域(ctd)融合。
[0055]
在另一个实施例中，本发明的ev在abd ev蛋白融合蛋白构建体中包括额外的序列或结构域。在一个有利的实施例中，abd ev蛋白进一步包括至少一个多聚化结构域。
[0056]
根据本发明的多聚化结构域可以是同源多聚化结构域或异源多聚化结构域。本发明的多聚化结构域可以是二聚化结构域、三聚化结构域、四聚化结构域或任何更高级的多聚化结构域。不希望受理论的束缚，多聚化结构域可以实现融合多肽的二聚化、三聚化或任何更高级别的多聚化，这增加了融合多肽到ev的分选和转运，并且也可能有助于增加由产生ev的细胞产生的囊泡的产量。示例性的多聚化结构域包含但不限于：亮氨酸拉链、折叠结构域、片段x、胶原结构域、2g12 igg同型二聚体、线粒体抗病毒信号传导蛋白card丝、心脏磷蓝蛋白跨膜五聚体、甲状旁腺激素二聚化结构域、糖蛋白a跨膜、人类免疫缺陷病毒(hiv)gp41三聚化结构域、hpv45癌蛋白e7 c-末端二聚体结构域及其任何组合。
[0057]
在另一个有利的实施例中，abd ev蛋白融合蛋白进一步包括至少一个内体逃逸结构域。根据本发明的内体逃逸结构域包含：ha2、vsvg、gala、b18。其他示例性的内体逃逸结构域包含但不限于：hiv tat pdt(肽/蛋白质转导结构域)、hiv gp-120、kala、gala和inf-7(来源于流感病毒血凝素ha-2亚基的n-末端结构域)、通过引起膜融合起作用的内体逃逸部分，如白喉毒素t结构域、质子海绵型内体逃逸部分，如具有组氨酸或咪唑部分的肽或脂质以及细胞穿透肽(cpp)和其他能够实现内体逃逸的部分。如本领域技术人员所理解的，cpp通常少于50个氨基酸，但也可以更长，通常是高度阳离子化的，并且富含精氨酸和/或赖氨酸氨基酸，并具有进入几乎任何细胞类型内部的能力。示例性的cpp为转运素(transportan)、转运素10、渗透蛋白、mts、vp22、cady肽、map、kala、pptg20、富含脯氨酸的肽、mpg肽、pepfect肽、pep-1、l-低聚物、降钙素肽、各种富含精氨酸的cpp，如poly-arg、tat及其组合。内体逃逸结构域的存在有利地帮助驱动内体逃逸，从而增强ev本身的生物活性递送。内体逃逸策略的使用可以用于疾病，其中需要将ev内携带的货物递送到受体细胞的胞质溶胶中或内溶酶体系统外的任何其他隔室内。
[0058]
在另一个有利的实施例中，abd ev蛋白融合蛋白进一步包括至少一个接头、间隔子和/或支架序列。接头、间隔子和/或支架序列的存在允许灵活性，并且使abd能够被最佳定位以用于展示在ev的表面上。
[0059]
根据本发明的接头可用于提供增加的灵活性、改善药代动力学(pk)、增加表达和改善融合多肽构建体以及相应多核苷酸构建体的生物活性，并且还可以用于保持避免空间位阻和保持融合多肽的功能性。根据本发明的示例性的接头包含增加稳定性或灵活性的甘氨酸或丝氨酸接头如(ggggs)n(n＝1、2、4)或(gly)6、(gly)8，刚性接头如(eaaak)n(n＝1-3和a(eaaak)4alea(eaaak)4a，弯曲接头(xp)n或可切割接头如二硫化物、蛋白酶敏感序列。
[0060]
在特定实施例中，本发明的ev包括多于一个abd，即多个abd。多个abd可以彼此相同或不同。如上所述，这可能是在单个融合蛋白中存在多于一个abd的结果，可替代地它可能是多个融合蛋白被装载到单个ev中的结果。所述多个融合蛋白可以包括相同或不同的ev蛋白。不希望受理论的束缚，在单个ev上存在多于一个abd可能是有利的，因为它增加了包被ev的白蛋白的量，从而增加了abd的屏蔽效果，这反过来可以增加abd ev的半衰期。在一些实施例中，本发明的ev包括至少一种abd ev融合蛋白，其中至少一种abd ev融合蛋白包括至少一种、或至少两种、或至少三种、或至少四种、或至少五种、或至少六种、或至少七种、或至少八种、或至少九种、或至少十种abd。
[0061]
包括abd的ev可以使用本文公开的方法中的任何一种来生产。
[0062]
在本发明的一个实施例中，本发明的ev进一步被装载有性货物，任选地，其中性货物是蛋白质、核酸、病毒、病毒基因组、抗原或小分子或其组合。
[0063]
根据本发明待装载的货物基本上可以是任何类型的药物货物，如例如：核酸如rna分子、dna分子或混合物、mrna、反义或剪接转换寡核苷酸、sirna、shrna、mirna、质粒dna(pdna)、超螺旋或非超螺旋的质粒或小圆圈；肽或蛋白质，其包含：转运蛋白、酶、受体如诱饵受体、膜蛋白、细胞因子、抗原或新抗原、核糖核酸蛋白、核酸结合蛋白、抗体、纳米体或抗体片段；抗体-药物缀合物；小分子药物；基因编辑技术，如crispr-cas9、talen、巨型核酸酶；或基于囊泡的货物如病毒(例如，aav病毒、慢病毒等)。在一个实施例中，货物可以是蛋白质、核酸、病毒、病毒基因组、抗原和/或小分子的混合物。
[0064]
更详细地，本发明的核酸货物分子可以选自包括以下的组：shrna、sirna、sarna、mirna、抗mirna、mrna、grna、pri-mirna、pre-mirna、环状rna、pirna、trna、rrna、snrna、lncrna、核酶、小环dna、质粒dna、rna/dna载体、反式剪接寡核苷酸、剪接转换寡核苷酸、crispr引导链、吗啉代(pmo)反义寡核苷酸(aso)、肽-核酸(pna)、病毒基因组和病毒遗传材料(例如，裸aav基因组)，但基本上任何类型的核酸分子都可以通过本发明的ev递送。单链和双链核酸分子两者都在本发明的范围内，并且核酸分子可以是天然存在的(如rna或dna)或可以是化学合成的rna和/或dna分子，其可以包括被化学修饰的核苷酸，如2'-o-me、2'-o-烯丙基、2'-o-moe、2'-f、2'-ce、2'-ea、2'-fana、lna、clna、ena、pna、硫代磷酸酯、三环dna、硫代核苷酸、氨基磷酸酯、pna、pmo等。
[0065]“核酸”是指多核苷酸并且包含多核糖核苷酸和多脱氧核糖核苷酸。根据本发明的核酸可以包含嘧啶和嘌呤碱基的任何聚合物或低聚物，例如分别为胞嘧啶(c)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u)、以及腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)(参见albert l.lehninger，《生物化学原理(principles of biochemistry)》，793-800(worth出版，1982)以及g.michael blackburn，michael j.gait，david loakes和david m.williams，《化学和生物学中的核酸(nucleic acids in chemistry and biology)》，第3版，(英国皇家化学协会出版社(rsc publishing)，2006)，所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文)。实际上，本发明考虑了任何脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组分以及其任何化学变体。聚合物或寡聚物在组成上可以是非均相的或均相的，并且可以从天然存在的来源中分离或可以是人工地或合成地产生的。另外，核酸可以是dna或rna或其混合物，并且可以以包含同源双链、异源双链和杂交状态在内的单链或双链形式永久地或过渡地存在。
[0066]“寡核苷酸”或“多核苷酸”可以意指长度在至少2个、至少8个、至少15个或至少25个核苷酸范围内的核酸，但可以高达50个、100个、1000个、5000个、10000个、15000个或20000个核苷酸长或是与多核苷酸特异性杂交的化合物。多核苷酸包含可以从天然来源分离、重组产生或人工合成的dna或rna或其模拟物的序列。本发明中所采用的多核苷酸的另一个实例可以是肽核酸(pna；参见美国专利第6,156,501号，所述美国专利特此通过引用整体并入。)本发明还涵盖以下情况：存在已经在某些trna分子中被鉴定并且假定以三螺旋存在的非传统碱基配对，如胡斯坦碱基配对(hoogsteen base pairing)。“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。应理解，当核苷酸序列在本文中由dna序列(例如，a、t、g和c)表示时，这也包含相应rna序列(例如，a、u、g、c)，其中“u”替换“t”。
[0067]
如本文所使用的，“多核苷酸”包含例如cdna、rna、dna/rna杂交体、反义rna、sirna、mrna、核酶、基因组dna、合成形式和混合聚合物、有义链和反义链两者，并且可以被化学或生化修饰以含有非天然的或衍生的、合成的或半合成的核苷酸碱基。此外，考虑了野生型或合成基因的改变，所述改变包含但不限于一个或多个核苷酸的缺失、插入、取代或与其他多核苷酸序列的融合。
[0068]
本发明具体涉及abd ev，其进一步装载有如sirna的核酸，该核酸靶向已知与癌症的发展有关的癌基因。由根据本发明的核酸靶向的基因可以是abl、af4/hrx、akt-2、alk、alk/npm、aml1、aml1/mtg8、axl、bcl-2、3、6、bcr/abl、c-myc、dbl、dek/can、e2a/pbx1、egfr、enl/hrx、erg/tls、erbb、erbb-2、ets-1、ews/fli-1、fms、fos、fps、gli、gsp、her2/neu、hox11、hst、il-3、int-2、jun、kit、ks3、k-sam、lbc、lck、lmo1、lmo2、l-myc、lyl-1、lyt-10、
lyt-10/cα1、mas、mdm-2、mll、mos、mtg8/aml1、myb、myh11/cbfb、neu、n-myc、ost、pax-5、pbx1/e2a、pim-1、prad-1、raf、rar/pml、ras-h、ras-k、ras-n、rel/nrg、ret、rhom1、rhom2、ros、ski、sis、set/can、src、tal1、tal2、tan-1、tiam1、tsc2、trk。
[0069]
更详细地，根据本发明的性蛋白质货物包含：抗体、胞内抗体、纳米抗体、scfv、亲和体、双特异性和多特异性抗体或结合剂(包含双特异性t细胞接合子(bite))、受体、配体、转运蛋白、用于例如酶替代疗法(ert)或基因编辑的酶、肿瘤抑制剂、病毒或细菌抑制剂、细胞组分蛋白、dna和/或rna结合蛋白、dna修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素(例如，假单胞菌外毒素)、结构蛋白、神经营养因子如nt3/4、脑源性神经营养因子(bdnf)和神经生长因子(ngf)及其单独的亚基如2.5sβ亚基、离子通道、膜转运蛋白、蛋白质内稳态因子、细胞信号传导中涉及的蛋白质、翻译和转录相关蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白结合蛋白、脂质结合蛋白、粘多糖(gag)和gag结合蛋白、代谢蛋白、细胞应激调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白，如细胞因子和此类细胞因子的抑制剂(细胞因子可以包含：cxcl8、gmcsf，白细胞介素，其包含：il-1家族、il-2、il-4、il-6、il-6样、il-9、il-10、il12、il-13、il-17，干扰素，其包含inf-α/β/γ、tnf家族成员、cd40和cd40l、trail和tgf-β家族)、线粒体蛋白和热休克蛋白等。货物蛋白可以是报告蛋白，如绿荧光蛋白(gfp)或nanoluc。在一个优选的实施例中，经编码蛋白质是具有完整核酸酶活性的与rna链相关(即携带其)的crispr相关(cas)多肽(如cas9)，一旦通过肽递送，该rna链使cas多肽能够在靶细胞中执行其核酸酶活性。可替代地，在另一个优选的实施例中，cas多肽可以催化失活以实现靶向基因工程化。又另一个替代方案可以是任何其他类型的crispr效应子，如单个rna引导的核酸内切酶cpf1。cpf1的包含是本发明的特别优选的实施例，因为其通过交错的双链断裂切割靶dna。cpf1可以从如氨基酸球菌属(acidaminococcus)或毛螺菌科(lachnospiraceae)等物种获得。在又另一个示例性实施例中，cas多肽还可以与转录激活因子(如p3330核心蛋白)融合，以特异性诱导基因表达。
[0070]
在一些实施例中，本发明还涉及核酸货物，其通过ev蛋白与核酸结合蛋白(na-结合蛋白)的融合来装载，该核酸结合蛋白然后与核酸货物分子结合并导致核酸货物装载到ev中。na结合蛋白的非限制性实例是hnrnpa1、hnrnpa2b1、ddx4、adad1、dazl、elavl4、igf2bp3、samd4a、tdp43、fus、fmr1、fxr1、fxr2、eif4a13、ms2衣壳蛋白以及其任何结构域、部分或衍生物。更广泛地，rna结合蛋白和结构域的特定亚类，例如mrna结合蛋白(mrbp)、前rrna结合蛋白、trna结合蛋白、小核或核仁rna结合蛋白、非编码rna结合蛋白、mirna结合蛋白、shrna结合蛋白和转录因子(tf)。此外，各种结构域和衍生物也可以用作na-结合结构域，以将核酸货物转运到ev中。rna结合结构域的非限制性实例包含小rna结合结构域(rbd)(其可以是单链和双链rbd(ssrbd和dsrbd)，如dead、kh、gtp_eftu、dsrm、g-patch、ibn_n、sap、tudor、rnasea、mmr-hsr1、kow、rnaset、mif4g、zf-ranbp、ntf2、paz、rbm1ctr、pam2、xpo1、piwi、csd和核糖体_l7ae)。此类rna结合结构域可以以多个形式存在，单独存在或与其他结构域组合存在，并且本身也可以形成更大的rna结合蛋白构建体的一部分，只要它们的关键功能(即运输感兴趣的核酸货物(例如mrna或短rna)的能力)被保持。
[0071]
在优选的实施例中，本发明涉及两组na结合结构域，即puf蛋白和crispr相关多肽(cas)，特别是cas6和cas13，以及各种类型的na结合适体。
[0072]
本发明使用术语“puf蛋白”来涵盖所有相关的蛋白和此类蛋白的结构域(其也可
以被称为“pum蛋白”)，例如，人pumilio同源物1(pum1)、pumx2或pufx2(它们是pum1的复制品)等，或可从任何puf(pum)蛋白获得的任何na结合结构域。如技术人员所理解的，puf蛋白的典型特征是存在八个连续的puf重复序列，每个重复序列约40个氨基酸，侧翼通常是两个相关的序列，csp1和csp2。每个重复序列具有含有芳香族和碱性残基的“核心共有序列”。对于rna结合，需要整个puf重复序列簇。值得注意的是，该相同区域也与蛋白辅调节因子相互作用，并且足以在很大程度上挽救puf蛋白突变体的缺陷，这使得puf蛋白非常适合于用于本发明的突变。此外，puf蛋白是可释放的na结合结构域的实例，其以合适的亲和力与核酸货物分子结合，从而使得puf蛋白能够可释放地、可逆地附着到核酸货物上。puf蛋白存在于大多数真核生物中，并且参与胚胎发生和发育。puf具有一个结合rna的结构域，该结构域由通常含有36个氨基酸的8个重复序列组成，这是本发明中通常用于rna结合的结构域。每个重复序列结合特定的核苷酸，并且通常是位置12和16中的氨基酸通过来自氨基酸13的堆积相互作用赋予特异性。puf可以结合核苷酸、腺苷、尿嘧啶和鸟苷，并且工程改造的puf也可以结合核苷酸、胞嘧啶。因此，该系统是模块化的，并且puf结构域所结合至的8核苷酸序列可以通过切换重复结构域的结合特异性来改变。因此，根据本发明的puf蛋白可以是天然的或工程改造的以结合rna分子中的任何位置，或者可替代地，人们可以选择对不同序列具有不同结合亲和力的puf蛋白，并且工程改造rna分子以含有所述序列。此外，还存在以序列特异性方式结合16个核苷酸的工程改造的和/或复制的puf结构域，其也可以用于进一步增加核酸货物分子的特异性。因此，puf结构域可以被修饰以结合任何序列，具有不同的亲和力和序列长度，这使得该系统高度模块化并适用于根据本发明的任何rna货物分子。根据本发明可以用作na结合结构域的puf蛋白及其区域和衍生物包含以下puf蛋白的非限制性列表:fbf、fbf/puf-8/puf-6、-7、-10，均来自秀丽隐杆线虫(c.elegans)；来自黑腹果蝇(d.melanogaster)的pumilio；puf5p/mpt5p/uth4p、puf4p/ygl014wp/ygl023p、puf5p/mpt5p/uth4p、puf5p/mpt5p/uth4p、puf3p，均来自酿酒酵母(s.cerevisiae)；来自盘基网柄菌(dictyostelium)的pufa；人pum1(pumilio 1，有时也被称为puf-8r)及其任何结构域，包括来自至少两个pum1的na结合结构域的多肽，任何截短的或修饰的或工程改造的puf蛋白，如例如puf-6r、puf-9r、puf-10r、puf-12r和puf-16r或其衍生物；和来自非洲爪蟾(xenopus)的x-puf1。根据本发明，特别合适的na-结合puf包含以下：puf 531、puf mrna loc(有时被称为puf工程改造的或pufeng)和/或pufx2(其序列可在国际专利公开号wo 2019/092145中获得)及其任何衍生物、结构域和/或区域。puf/pum蛋白是非常有利的，因为它们可以被选择为人类来源。
[0073]
此外，与puf蛋白的情况一样，cas蛋白如cas6和cas13是可释放的na结合结构域的实例，其以合适的亲和力与核酸货物分子结合，从而使得cas蛋白能够可释放地、可逆地附着至核酸货物。如同基于puf的na-结合结构域一样，cas蛋白代表可释放的、不可逆的na-结合结构域，对靶核酸货物分子具有可编程的、可修饰的序列特异性，能够在较低的总亲和力下实现较高的特异性，从而允许将核酸货物装载到ev中和在靶位置释放核酸货物。
[0074]
另外的优选的实施例包含选自包括以下的组的性蛋白质货物：针对溶酶体贮积病症的酶或转运蛋白，例如葡糖脑苷脂酶如伊米苷酶、α-半乳糖苷酶、α-l-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶和艾度硫酸酯酶、芳香基硫酸酯酶、加硫酶、酸性α葡糖苷酶(gaa)、鞘磷酯酶、半乳糖脑苷脂酶、半乳糖基神经酰胺酶、神经酰胺酶、α-n-乙酰氨基半乳
糖苷酶、β-半乳糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、酸性鞘磷脂酶、npc1、npc2、乙酰肝素磺酰胺酶、n-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷-n-乙酰转移酶、n-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、透明质酸酶、αn-乙酰神经氨酸苷酶、glcnac磷酸转移酶、粘脂蛋白1、棕榈酰蛋白硫酯酶(palmitoylprotein thioesterase)、三肽氨基肽酶i、棕榈酰-蛋白硫酯酶1、三肽氨基肽酶1、battenin、linclin、α-d-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、天冬氨酰葡、α-l-岩藻糖苷酶、胱氨酸转运蛋白(cystinosin)、组织蛋白酶k、唾液酸转运蛋白、lamp2和氨基己糖苷酶。
[0075]
另外的优选的实施例包含性蛋白质货物，其选自包括与尿素循环病症相关的酶的组，其包含:n-乙酰谷氨酸合酶、氨甲酰磷酸合成酶、鸟氨酸转氨酶(otc)、精氨酸琥珀酸合酶、精氨酸琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、线粒体鸟氨酸转运蛋白、citrin、y+l氨基酸转运蛋白1和尿苷一磷酸合酶(umps)。
[0076]
在其他优选的实施例中，性蛋白质货物可以是例如修饰炎性应答的胞内蛋白例如表观遗传蛋白如甲基化酶和布罗莫结构域、或修饰肌肉功能的胞内蛋白例如转录因子如myod或myf5、调节肌肉收缩力的蛋白例如肌球蛋白、肌动蛋白、钙/结合蛋白如肌钙蛋白、或结构蛋白如肌营养不良蛋白、微型肌营养不良蛋白、微肌营养不良蛋白、肌营养相关蛋白、肌联蛋白、伴肌动蛋白、肌营养不良蛋白相关蛋白如小肌营养蛋白、互养蛋白、肌肉萎缩相关蛋白、肌间线蛋白、肌糖、肌养蛋白聚糖、肌长、集聚蛋白和/或fukutin。性蛋白质货物通常是人来源的蛋白质或肽，除非通过蛋白质或肽的名称、任何其他命名法或如本领域技的术人员已知的方式另外说明，并且可以在各种公开可用的数据库如uniprot、rcsb等中到。
[0077]
在另一个优选的实施例中，性货物是抗原/新抗原，任选地，其中抗原/新抗原适用于癌症免疫疗法。
[0078]
任何抗原/新抗原都可以被并入到本发明的ev中。抗原可以适合于提高针对病原体如细菌、病毒和真菌的免疫应答，或者抗原可以是用于引发针对肿瘤的免疫应答以进行癌症免疫疗法的肿瘤抗原。根据本发明，在任何ev中可以存在一种或多种抗原/新抗原。一种或多种抗原/新抗原可以是内源性的/自体的(来自受试者本身)或外源性的/同种异体的(来自另一受试者)，或者在更多的抗原/新抗原被并入到ev中/上的情况下，抗原/新抗原可以是自体抗原/同种异体抗原的任何混合物。优选地，抗原是自体的。此外，一种或多种抗原/新抗原可以具有任何来源，如例如病毒或细菌，或者可以是肿瘤抗原，并且此外，可以是免疫刺激性的或免疫抑制性的或其组合。抗原/新抗原可用于通过免疫疗法任何疾病。通过免疫疗法癌症是特别优选的实施例。在抗原是新抗原的情况下，可以通过对肿瘤进行测序来鉴定新抗原。
[0079]
示例性的肿瘤抗原包含但不限于：甲胎蛋白(afp)，癌胚抗原(cea)，ca-125，muc-1，上皮肿瘤抗原(eta)，黑素瘤相关抗原(mage)，wt-1，ny-eso-1，ly6k，imp3，depdc1，cdca-1，ras、p53、kras或nras的异常产物，ctag1b，来源于染体易位的肽如bcr-abl或etv6-aml1，病毒抗原如来自hpv相关癌症的肽，来源于蛋白质的肽如酪氨酸酶、gp100/pmel17、melan-a/mart-1、gp75/trp1或trp2，以及过表达的抗原如mok(rage-1)、erbb2(her2/neu)。
[0080]
在性货物是抗原或新抗原的情况下，ev或包括ev的药物组合物(下面进一步
讨论)可以任选地进一步包括至少一种佐剂。在抗原与佐剂一起施用以刺激免疫应答的情况下，佐剂可以是但不限于：无机化合物，如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸氢钙、矿物油如石蜡油、细菌产物如杀死的细菌百日咳博德特氏菌(bordetella pertussis)、牛分枝杆菌(mycobacterium bovis)、类毒素、非细菌有机物如角鲨烯、去污剂如quil a、植物皂苷、细胞因子如il-1、il-2、il-12或ribi佐剂(胞壁酰二肽)或免疫刺激复合物(iscom)如干扰素基因刺激剂(sting)激动剂，其可以包含环状二核苷酸。此类佐剂可以通过将性ev隔离在局部沉积物中而防止其快速扩散，或者它们可以含有刺激宿主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其他组分具有趋化性的因子的物质。可以被并入到疫苗中的佐剂是本领域技术人员熟知的，并且将以不对ev的免疫活性产生负面影响的方式进行选择。
[0081]
本发明还涉及装载有病毒货物的abd ev，任选地，其中abd ev进一步包括一种或多种提供免疫效应子功能的免疫效应子分子。示例性的病毒货物包含但不限于病毒载体，其为腺相关病毒(aav)载体或慢病毒载体。在一些实施例中，病毒载体是aav载体。在一些实施例中，aav载体包括来自人aav血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav 10、aav11或aav12的衣壳。在一些实施例中，aav载体包括aav病毒基因组，该aav病毒基因组包括来自人aav血清型aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9或aav10的反向末端重复(itr)序列。在一些实施例中，aav衣壳和aav itr来自相同的血清型或来自不同的血清型。
[0082]
在上述方面的一些实施例中，病毒载体是慢病毒载体。在一些实施例中，慢病毒载体来源于hiv、猿猴免疫缺陷病毒或猫科免疫缺陷病毒。在一些实施例中，慢病毒载体是非复制性的。在一些实施例中，慢病毒载体是非整合的。
[0083]
在一些实施例中，病毒载体包括病毒衣壳和病毒基因组，病毒基因组包括一种或多种异源转基因。在优选的实施例中，异源转基因编码多肽或蛋白质。在病毒基因组内编码的蛋白质可以是根据本发明的蛋白质货物中的任何一种，其允许病毒货物充当基因替代疗法。
[0084]
在一些实施例中，装载货物的abd ev可以另外包括一种或多种提供免疫效应子功能的分子。免疫效应子分子在abd ev装载有病毒(例如，avv或慢病毒)货物的情况下特别有用，但是在其中abd ev装载有根据本发明的任何货物的情况下同样可以使用。免疫效应子可以用于降低abd ev的免疫原性。在一些实施例中，免疫效应子功能刺激免疫抑制剂。在其他实施例中，免疫效应子功能抑制免疫刺激分子。在一些实施例中，abd-ev包括刺激免疫抑制剂的分子和抑制免疫刺激分子的分子。
[0085]
示例性的免疫效应子分子包含但不限于ctla4、b7-1、b7-2、pd-l、pd-l1、pd-l2、cd28或vista中的一种或多种。在一些实施例中，ev进一步包括ctla4和pd-l1、ctla和pd-l2、ctla-4和vista、pd-l1和pd-l2、pd-l1和vista、pd-l2和vista、ctla4和pd-l1和pd-l2、ctla4和pd-l1和vista、ctla4和pd-l2和vista、pd-l1和pd-l2和vista，或ctla4和pd-l1和pd-ll和vista。
[0086]
免疫效应子分子可以形成abd ev融合构建体、货物、靶向部分的一部分，或者可以形成完全单独的融合蛋白构建体的一部分，该完全单独的融合蛋白构建体包括与根据本发明的任何ev蛋白融合的免疫效应子分子。
[0087]
本发明还涉及装载有小分子货物的abd ev。术语“小分子”、“小分子货物”、“小分
子药物”和“小分子剂”在本文中可互换使用，并且可以被理解为涉及可以用于、预防和/或诊断疾病和/或病症的任何分子药剂。小分子药剂通常经由化学合成手段合成，但也可以是天然来源的，例如经由从天然来源纯化，或者可以通过任何其他合适的手段或技术的组合获得。“小分子”的简单定义是分子量小于900g/mol(道尔顿)的可以帮助调节生物过程的任何有机化合物。出于本发明的目的，小分子可以显著大于900g/mol，例如1500g/mol、3000g/mol，或者偶尔甚至更大。尽管许多小分子表现出良好的口服生物利用度，但出于药代动力学、药效学、毒性和/或稳定性原因，许多小分子药物需要静脉内或经由某些其他施用途径给予。小分子的实例包含抗癌剂如阿霉素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶或其他核苷类似物如阿糖胞苷(cytosine arabinoside)，蛋白酶体抑制剂如硼替佐米(bortezomib)，或激酶抑制剂如伊马替尼或塞利西利(seliciclib)，或非甾体抗炎药(nsaids)如萘普生、阿司匹林或塞来昔布，抗生素如海他西林，或抗高血压药如血管紧张素转化酶(ace)抑制剂如依那普利(enalapril)，arb如坎地沙坦(candesartan)等。本发明自然也适用于其他小分子，而不背离本发明的主旨，如对于本领域技术人员来说将显而易见的。
[0088]
在某些实施例中，由abd ev携带的性货物可以存在于ev的内部、ev的外部或ev的膜中。性货物的期望位置将取决于货物的性质及其作用机制，例如，膜蛋白将优选地位于ev的膜中，诱饵受体将优选地存在于ev的表面上，但是设计成被递送到受体细胞的胞质溶胶或细胞核中的货物(如沉默rna)将优选位于ev的腔中。
[0089]
性货物可以通过存在于产生ev的细胞的胞质溶胶中的性货物被动装载到ev中。例如，此类被动加载适用于天然装载到ev中的核酸、小分子、病毒、可溶性蛋白或膜蛋白。
[0090]
在某些实施例中，性货物被主动装载到本发明的abd ev中。货物的主动装载的一种形式涉及外源性主动装载，其涉及使用任何已知的外源性装载方法装载货物，该外源性装载方法包含：电穿孔、用转染试剂如阳离子转染剂、lipofectamine(rtm)转染、货物与膜锚定部分如脂质或胆固醇尾部的缀合、或通过cpp装载(以cpp-货物缀合物的形式或以cpp-货物非共价复合物的形式)。同样，这种类型的主动装载可以导致性货物蛋白位于ev的内部、ev的外部或位于ev的膜内。
[0091]
在某些实施例中，通过使用融合蛋白将性货物主动装载到本发明的abd ev中。在这种情况下，由ev携带的性货物形成ev蛋白-abd融合蛋白的一部分，或者可替代地由ev携带的性货物形成额外的融合蛋白的一部分，其中ev蛋白与ev蛋白-abd融合蛋白分离。在任一情况下，性货物蛋白可以被融合到融合蛋白中，使得其位于ev的内部、ev的外部或位于ev的膜内。融合蛋白中ev蛋白的存在主动将性蛋白装载到ev中。可以对性货物蛋白进行工程改造，以使其在c末端或n末端与单程或多程跨膜蛋白融合，从而在ev的表面上展示性蛋白或保护ev内的性货物。如上所定义的任何ev蛋白都可以用作用于装载性蛋白质货物的融合配偶体。可以用于将货物蛋白装载到ev中的ev蛋白可以是跨膜的，但不是必须的。在性货物形成额外的融合蛋白的一部分(其中ev-蛋白与ev-蛋白-abd融合蛋白分离)的情况下，很明显该融合蛋白可以包含与膜相关而非跨膜的ev蛋白。例如，融合蛋白可以使用与ev膜的腔/囊泡内表面缔合的ev蛋白，以确保性货物被装载到ev的腔中。可替代地，货物可与ev蛋白融合，该ev蛋白与ev膜外表面缔合。特别有利的ev蛋白包含cd63、cd81、cd9、cd82、cd44、cd47、cd55、lamp2b、icam、整联蛋白、
arrdc1、多配体聚糖、内居蛋白和alix以及其衍生物、结构域、变体、突变体或区域。
[0092]
性蛋白质也可以被工程改造到多程跨膜蛋白的一个或多个囊泡外环或囊泡内环中，任选地，其中多程跨膜蛋白是四次跨膜蛋白，如cd36、cd9、cd81或tspan1-tspan33中的任何一种。有利地，货物蛋白可以被并入到所述多程跨膜蛋白的环中的多于一个环中，和/或多于一种货物蛋白可以被并入到所述多程跨膜蛋白的每个环中。多于一种货物蛋白可以被并入到跨膜融合蛋白中，而不影响跨膜蛋白的表达。不希望受理论的束缚，每个跨膜ev蛋白存在多于一种性货物蛋白意味着每个表达的融合蛋白更多的货物分子可以与ev结合，这可以增加ev的效力，并且允许不同的性货物被并入到同一ev中，从而显著增加所生产的ev的多功能性。
[0093]
在其中利用单独的融合蛋白构建体(即在不包括白蛋白结合结构域的额外的融合构建体上)将性货物主动装载到ev中的实施例中，所述额外的融合构建体还可以进一步包括：(i)至少一个多聚化结构域；(ii)至少一个内体逃逸结构域；(iii)至少一个接头/间隔子/支架序列；(iv)至少一个能够切割以释放性货物的释放结构域或可释放接头；(v)至少一种免疫效应子分子；和/或(vi)至少一个靶向部分。
[0094]
根据本发明的合适的释放结构域包含但不限于顺式切割序列如内含子、光诱导的单体或二聚体释放结构域如kaede、kikgr、eosfp、tdeosfp、meos2、psmorange、gfp样dendra蛋白、dendra和dendra2、cry2-cibn等。可替代地，可以使用核定位信号(nls)-核定位信号结合蛋白(nlsbp)(nls-nlsbp)释放系统。蛋白酶切割位点也可以被并入到融合蛋白中以用于自发释放等，这取决于融合多肽的期望的功能。在核酸货物的情况下，可以包含特定的核酸切割结构域。核酸切割结构域的非限制性实例包含但不限于核酸内切酶如cas6、cas13、工程改造的puf核酸酶、位点特异性rna核酸酶等。
[0095]
不希望受理论的束缚，包含释放结构域可以使特定部分或结构域从原始融合多肽中释放出来。当部分融合多肽的释放将增加货物的生物活性递送时和/或当融合多肽的特定功能在作为较小构建体的一部分时更好地发挥作用时，这是特别有利的。
[0096]
在另外的实施例中，根据本发明的ev可以包括至少一个靶向部分，以能够靶向递送至感兴趣的细胞、组织、器官和/或隔室。靶向部分可以包括在具有ev蛋白的融合多肽中。在有利的实施例中，靶向部分是具有跨膜ev蛋白的融合蛋白的一部分，以使得靶向部分能够展示在ev的表面上。在一个实施例中，靶向部分可以作为abd ev蛋白融合构建体的一部分被包括；可替代地，靶向部分可以作为与ev蛋白的单独的融合的一部分存在。靶向部分可以是可从人类或非人类动物等获得的蛋白质、肽、单链片段或抗体的任何其他衍生物。靶向部分可以形成abd ev融合构建体的一部分，或者可替代地它可以形成ev中包括的单独的多肽构建体的一部分。包括靶向部分的ev可以使用本文公开的方法中的任何一种产生。
[0097]
靶向部分的存在，结合abd ev的改善的生物分布，使它们在器官靶向中特别有用。不希望受理论的束缚，一旦abd ev被包被在白蛋白中，它可以在循环中保留更长时间，避免被肝脏或免疫系统的细胞摄取，因此能够到达期望的靶器官。
[0098]
根据本发明，靶向部分可以与任何ev蛋白融合。靶向部分-ev蛋白融合可以被工程改造，以便通过融合到单程跨膜蛋白的囊泡外部分而在ev的表面上展示靶向部分。可替代地，可以将靶向部分可以被工程改造到多程跨膜蛋白的一个或多个囊泡外环中，任选地，其中多程跨膜蛋白是四次跨膜蛋白如cd63、cd9、cd81或tspan1-tspan33中的任何一种。
[0099]
在其中靶向部分存在于单独的融合蛋白构建体上(即存在于不包括白蛋白结合结构域的额外的融合构建体上)的实施例中，所述额外的融合构建体还可以进一步包括：(i)至少一个多聚化结构域；(ii)至少一个内体逃逸结构域；(iii)至少一种免疫效应子分子；和/或(iv)至少一个接头/间隔子/支架序列。
[0100]
靶向部分可以用于将ev靶向细胞、亚细胞位置、组织、器官或其他身体隔室。可以靶向的器官和细胞类型包含但不限于：脑、神经元细胞、血脑屏障、肌肉组织、眼睛、肺、肝脏、肾脏、心脏、胃、肠、胰腺、红细胞、包含b细胞和t细胞在内的白细胞、淋巴结、骨髓、脾脏和癌细胞。
[0101]
如技术人员将理解的，靶向可以通过多种手段(例如，使用靶向肽)实现。此类靶向肽可以为几个氨基酸的长度到几百个氨基酸的长度中的任一个，例如约3-100个氨基酸、约3-30个氨基酸、约5-25个氨基酸的区间中的任一个，例如约7个氨基酸、约12个氨基酸、约20个氨基酸等。本发明的靶向肽还可以包含全长蛋白，如受体、受体配体等。此外，根据本发明的靶向肽也可以包含抗体和抗体衍生物，例如单克隆抗体、scfv、其他抗体结构域等。示例性的靶向部分包含脑靶向部分如狂犬病病毒糖蛋白(rvg)、神经生长因子(ngf)、黑转铁蛋白和fc5肽，以及肌肉靶向部分如肌肉特异性肽(msp)。
[0102]
靶向部分也可以通过与ev蛋白融合的fc结合物(binder)而附着于ev。含有fc结构域的靶向部分(如经工程改造以包括fc结构域的抗体或蛋白质)可以通过被并入到靶向融合构建体中的fc结合物的存在而附着于ev的表面。fc结合物蛋白的实例为：蛋白a、蛋白g、蛋白a/g、蛋白l、蛋白lg、z结构域、zz结构域、人fcgri、人fcgr2a、人fcgr2b、人fcgr2c、人fcgr3a、人fcgr3b、人fcgrb、人fcamr、人fcera、人fcar、小鼠fcgri、小鼠fcgriib、小鼠fcgriii、小鼠fcgriv、小鼠fcgrn、sph肽、spa肽、spg2、spa模拟物1、spa模拟物2、spa模拟物3、spa模拟物4、spa模拟物5、spa模拟物6、spa模拟物7、spa模拟物8、spa模拟物9、spa模拟物10、fcγ模拟物1、fcγ模拟物2。在具体的实施例中，fc结合物被并入到与abd相同的多程跨膜蛋白中，例如，abd可以被工程改造到第一环中，并且靶向部分可以被工程改造到第二环中，或者反之亦然。在更具体的实施例中，ev可以包括至少一种多程跨膜蛋白，该多程跨膜蛋白已经将abd和fc结合物工程改造到其环中，该abd和fc结合物充当包括fc结构域的靶向部分(例如抗体)的锚。
[0103]
本发明还涉及包括至少一种存在于ev的表面上的abd的ev体。在某些实施例中，根据本发明的ev体中每ev的平均abd数量高于每ev一个abd，但是也可以低于每ev一个abd。此外，在某些实施例中，在根据本发明的ev体中，每ev的平均货物分子数高于或低于每ev一个货物分子。在另一实施例中，在根据本发明的ev体中，所有ev的至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和/或至少95％包括至少一种abd和任选地至少一种货物分子。
[0104]
本发明还涉及包括至少一种abd和至少一种ev蛋白的融合蛋白，和编码此类融合蛋白的多核苷酸构建体，以及包括此类构建体的载体、ev和细胞。
[0105]
ev蛋白可以任选地是跨膜ev蛋白或与ev的外膜缔合的ev蛋白。在ev蛋白是多程跨膜ev蛋白的情况下，abd可以被工程改造到多程跨膜蛋白的一个或多个囊泡外环中。在优选的实施例中，融合蛋白的多程跨膜ev蛋白是四次跨膜蛋白。本发明的融合蛋白可以有利地包括多于一个abd，即多个abd。多个abd可以彼此相同或不同。
[0106]
根据本发明的融合蛋白可以进一步包括：(i)至少一个多聚化结构域；(ii)至少一个内体逃逸结构域；(iii)至少一个接头/间隔子/支架序列；(iv)至少一种性货物蛋白，其任选地进一步包括能够切割以释放性货物的释放结构域或可释放接头；(v)至少一种免疫效应子分子；和/或(vi)至少一个靶向部分。
[0107]
为了清楚起见，一些abd-ev蛋白融合蛋白的结构在下面和图18中示出：
[0108]
ev蛋白-abd
[0109]
ev蛋白结构域i-abd-ev蛋白结构域ii
[0110]
ev蛋白结构域i-abd-abd-ev蛋白结构域ii
[0111]
ev蛋白结构域i-abd-ev蛋白结构域ii-abd-ev蛋白结构域iii
[0112]
ev蛋白结构域i-abd-ev蛋白结构域ii-性货物
[0113]
性货物-ev蛋白结构域i-abd-ev蛋白结构域ii
[0114]
ev蛋白结构域i-abd-ev蛋白结构域ii-靶向部分
[0115]
ev蛋白结构域i-abd-ev蛋白结构域ii-靶向部分-ev蛋白结构域iii
[0116]
ev蛋白结构域i-abd-ev蛋白结构域ii-性货物-ev蛋白结构域iii
[0117]
本发明涉及包括上述鉴定的融合蛋白的ev。
[0118]
通常，ev可以来源于基本上任何细胞来源，其可以是原代细胞来源或永生化细胞系。ev来源细胞可以是任何胚胎细胞、胎儿细胞或成年体干细胞类型，包含诱导性多能干细胞(ipsc)和通过任何方法衍生的其他干细胞，以及任何成体细胞来源。根据本发明的来源细胞可以选自宽范围的细胞和细胞系，例如间充质干细胞或基质细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、华顿氏胶(wharton's jelly)、围产期组织、绒毛膜、胎盘、牙胚、脐带血、皮肤组织等获得)、成纤维细胞、羊膜细胞，并且更具体地是任选地表达各种早期标志物的羊膜上皮(ae)细胞、骨髓样抑制细胞、m2极化的巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。特别感兴趣的细胞系包含人脐带内皮细胞(huvec)、人胚胎肾(hek)细胞、内皮细胞系如微血管或淋巴内皮细胞、红细胞、红系祖细胞、软骨细胞、不同来源的间充质基质细胞(msc)、羊膜细胞、ae细胞、cevec's细胞、通过羊膜穿刺术或从胎盘、气道或肺泡上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等获得的任何细胞。此外，免疫细胞如b细胞、t细胞、nk细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞(dc)也在本发明的范围内，并且基本上任何类型的能够产生ev的细胞也涵盖在本文中。来源细胞对待的患者而言可以是本质上同种异体的、自体的或甚至异种的，即细胞可以来自患者本身或来自不相关的、匹配的或不匹配的供体。
[0119]
特别地，本发明涉及已经被稳定修饰以包括至少一种根据本发明(如上定义)的单顺反子、双顺反子或多顺反子多核苷酸构建体的细胞，该构建体编码ev蛋白和至少一种abd蛋白的融合蛋白。此类细胞可以用根据本发明的多核苷酸稳定地或瞬时地转染，以使它们成为产生abd-ev的细胞。此类细胞也可以被稳定地或瞬时地修饰，以便包含编码性货物蛋白的构建体，该构建体任选地可以与ev蛋白形成融合蛋白的一部分。此类细胞也可以被稳定地或瞬时地修饰，以便包含编码靶向部分的构建体，该构建体包括靶向部分的融合蛋白和ev蛋白。本发明的细胞可以是单克隆细胞或多克隆细胞系。
[0120]
根据本发明的优选的生产者细胞可以包含但不限于hek细胞、hek293细胞、hek293t细胞、msc，特别是wj-msc细胞或bm-msc细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、ae细胞、cevec's细胞、胎盘来源的细胞、脐带血细胞、免疫系统细胞、内皮细胞、上皮细胞或任
何其他细胞类型，其中所述细胞可以是例如贴壁细胞、悬浮细胞和/或悬浮适应细胞。
[0121]
本发明涉及一种用于生产根据本发明的ev的方法。用于产生ev的方法包括：
[0122]
(i)将至少一种编码abd-ev蛋白融合构建体的多核苷酸构建体引入到产生ev的细胞中；和
[0123]
(ii)在产生ev的细胞中表达所述构建体，从而产生包括存在于ev的表面上的abd的ev。
[0124]
有利地，通过本发明的方法产生ev导致abd-ev蛋白融合构建体内源性装载到ev中。蛋白质的内源性装载对于合适的蛋白质的正确确认和膜蛋白向膜中的插入以及任何必要的翻译后修饰是必不可少的。使用膜蛋白作为支架将abd锚定到ev上，同时也存在于ev的表面上，对于在ev上展示abd，同时保留天然来源的ev的所有固有益处(如它们的天然rna和蛋白质货物以及它们的免疫沉默性质)是必不可少的。避免免疫原性对于剂是重要的，并且是ev相对于合成或体外产生的剂的内在益处之一。
[0125]
用于产生ev的方法可以进一步包括用至少一种货物分子装载ev的步骤。所述货物装载步骤可以是通过内源性装载或外源性装载。
[0126]
在货物装载步骤是外源性装载步骤的情况下，装载步骤可以包括:通过任何外源性装载方法装载货物，该外源性装载方法包含电穿孔、微流体、用转染试剂如阳离子转染剂、lipofectamine(rtm)转染、货物与膜锚定部分如脂质或胆固醇尾部的缀合或通过cpp装载(以cpp-货物缀合物的形式或以cpp-货物非共价复合物的形式)。
[0127]
在货物装载步骤是内源性的情况下，内源性装载步骤可以包括将货物蛋白引入到abd-ev蛋白融合构建体中，或将编码性货物的另外的核酸构建体引入到产生ev的细胞中。通过使用双向质粒，单个核酸构建体也可以分别编码abd-ev蛋白融合蛋白和货物蛋白。所述性货物构建体可以简单地由产生ev的细胞表达，并被动地装载到ev中，或者性货物可以作为与ev蛋白的融合蛋白被包括，使得货物蛋白当被翻译时被内源性地并主动地装载到由产生ev的细胞产生的ev中。
[0128]
用于产生ev的方法可以进一步包括用至少一个靶向部分装载ev的步骤。在该特定实施例中，靶向部分装载步骤是内源性装载步骤，并且可以包括将编码靶向部分的另外的核酸构建体引入到产生ev的细胞中，该核酸构建体作为与ev蛋白的融合蛋白被包括，使得当被翻译时，靶向部分被内源性地并且主动地装载到由产生ev的细胞产生的ev中。
[0129]
不希望受理论的束缚，产生作为双重稳定或多重稳定细胞的细胞的益处在于可以通过交换货物和/或靶向构建体快速且容易地产生生产者细胞系的大文库。另外，每个单独的构建体可以置于不同启动子的控制之下，因此可以仔细和单独地控制abd、货物和/或靶向部分的表达水平。可替代地，当性货物和/或靶向部分形成abd-ev蛋白融合构建体的一部分时，单个abd-ev蛋白-货物/靶向部分构建体的优点在于，它仅需要使细胞单一稳定，这导致产生简单和稳健的细胞系。单一、双重或多重稳定细胞系的选择将取决于期望的货物和靶向部分、它们的大小和在ev上的期望的位置。
[0130]
ev的纯化可通过任何方法实现，包含但不限于，包括液相谱法(lc)、高效液相谱法(hplc)、珠洗脱液谱法、离子交换谱法、旋转过滤、正切流动过滤(tff)、中空纤维过滤、离心、免疫沉淀、流场分馏、透析、基于微流体的分离等、或其任何组合的技术。在有利的实施例中，ev的纯化使用过滤(优选地，超滤(uf)、tff或中空纤维过滤)和亲和谱法的
顺序组合来进行，任选地还包含尺寸排阻lc或珠洗出液lc。结合纯化步骤通常提高所得样本的纯度，并且进而产生优异的活性。此外，与常规用于纯化外泌体的超速离心(uc)相比，顺序过滤谱法明显更快，并且可以按比例放大到更高的生产量，这是主导现有技术的当前uc方法的显著缺点。另一种有利的纯化方法是tff，其提供了可扩展性和纯度，并且可以与任何其他类型的纯化技术组合。
[0131]
在一些实施例中，本发明的ev是分离的ev。因此，本发明提供分离的ev，其包括至少一种存在于ev的表面上的abd，其中abd与ev蛋白形成融合蛋白的一部分。
[0132]
本发明还涉及药物组合物，其包括至少一种根据本发明的ev和药学上可接受的赋形剂或载剂。
[0133]
术语“赋形剂”或“载剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进化合物的施用的惰性物质。该术语涵盖经如fda或emea的监管机构批准的或在美国药典中列出的用于动物(包含人)的任何药剂，以及不对受试者造成显著刺激并且不消除性货物的生物活性和性质的任何载剂或稀释剂。包含可用于制备药物组合物并且通常安全且无毒的赋形剂和载剂。
[0134]
示例性的赋形剂包含降解或丧失活性的稳定剂赋形剂，其包含蛋白质如hsa，多元醇如甘油、山梨醇和赤藓糖醇，氨基酸如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、脯氨酸、甘氨酸、组氨酸和甲硫氨酸，聚合物如聚乙烯吡咯烷酮和羟丙基纤维素，表面活性剂如聚山梨酯80、聚山梨酯20和pluronicf68，抗氧化剂如抗坏血酸和α-生育酚(维生素e)，缓冲剂如乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、组氨酸、三(羟甲基)氨基甲烷(tris)，金属离子/螯合剂如ca
2+
、zn
2+
和edta，基于环糊精的赋形剂如羟丙基β-环糊精和其他赋形剂如聚阴离子和盐，稳定剂或填充剂如乳糖、海藻糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘油、白蛋白、明胶、甘露醇和葡聚糖，或防腐剂如苯甲醇、间甲酚、苯酚、2-苯氧基乙醇。
[0135]
根据本发明的ev可以经由各种不同的施用途径施用于人或动物受试者，例如耳廓(耳)、颊、结膜、皮肤、牙齿、电渗、宫颈内膜、窦内、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜腔内、动脉内、关节内、胆管内(intrabiliary)、支气管内、囊内、心脏内、软骨内、尾脊内(intracaudal)、海绵体内、腔内、脑内、脑室内、脑室内(icv)、脑池内、角膜内、冠状位内(牙齿)、冠状动脉内、阴茎海绵体内(intracorporus cavernosum)、真皮内、椎间盘内、导管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食管内、胃内、齿龈内(intragingival)、回肠内(intraileal)、病灶内、内腔内(intraluminal)、淋巴管内、髓内、脑膜内、肌肉内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内(intraprostatic)、肺内、窦内(intrasinal)、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸腔内、小管内、肿瘤内、鼓膜内、子宫内、血管内、静脉内、静脉内团注、静脉内滴注、心室内、膀胱内、玻璃体内、离子电渗疗法、灌洗、喉、鼻、鼻胃、闭塞性敷料技术、眼、口腔、口咽、其他、肠胃外、经皮(percutaneous)、关节周围、硬膜外、神经周围、牙周、直肠、呼吸(吸入)、眼球后、软组织、蛛网膜下、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、透皮(transdermal)、经粘膜、经胎盘、经气管、经鼓膜、输尿管、尿道和/或阴道施用和/或上述施用途径的任何组合，这通常取决于待的疾病和/或ev的特性、所讨论的货物分子或ev体本身。
[0136]
本领域技术人员将清楚，当描述ev的医学和科学用途和应用时，本发明通常涉及多个ev，即可以包括数千、数百万、数十亿或甚至数万亿个ev的ev体。ev可以以每单位体
积或每单位重量(例如每ml或每l或每kg体重)约105、108、10
10
、10
11
、10
12
、10
13
、10
14
、10
15
、10
18
、10
25
、10
30
ev(通常被称为“颗粒”)的浓度存在，或者以更大、更小或其间的任何其他数值存在。同样，术语“体”(其可以例如涉及包括某个abd或货物的ev)可以被理解为涵盖构成这种体的多个实体。换句话说，单独的ev当以多个存在时构成ev体。因此，自然地，本发明涉及单独的ev和包括ev的体，如对于技术人员来说将显而易见的。当在体内应用时，ev的剂量自然可以根据待的疾病、施用途径、感兴趣货物的活性和作用、abd、ev上存在的任何靶向部分、药物配方等而显著差异。
[0137]
设想任何剂量方案都将适用于本发明的abd ev。所选择的剂量方案将取决于由abd ev递送的货物和待的疾病以及所施用的任何额外的疗法(其将由熟练的医生确定)。
[0138]
设想本发明的abd ev将被施用多次，即多于一次，但通常多于两次，或潜在地用于慢性、长期(即施用数十至数百至数千次)。优选地，如果货物是作为疫苗施用的抗原，则免疫计划将涉及两次或更多次施用多肽，分散在几周内。类似地，如果货物是例如rna药剂，如sirna或mrna，或蛋白质，如抗体或酶或转运蛋白，则包括该货物的abd ev将可能被施用多于一次，通常作为慢性方案的一部分被施用多次。
[0139]
本发明还涉及用于药物的根据本发明的ev。本发明还涉及用于药物的根据本发明的药物组合物。本发明还涉及一种方法，该方法包括向有此需要的患者施用至少一种有效量的根据本发明的ev或至少一种有效量的本发明的药物组合物。本发明还涉及在患者中至少一种疾病、病症和/或病状的方法，该方法包括向患者施用至少一种有效量的根据本发明的ev或至少一种有效量的本发明的药物组合物。
[0140]
医疗用途或方法可以是通过递送根据本发明的任何种类的货物。例如，医疗用途或可以是通过递送功能性蛋白质作为蛋白质替代疗法，递送编码功能性蛋白质的mrna也作为蛋白质替代疗法。此类蛋白质替代疗法可以是例如ert，该ert用于由先天性代谢错误引起的疾病，如苯丙酮尿症(pku)、尿素循环病症或溶酶体贮积病症。医疗用途或可以是通过递送基因沉默rna、剪接转换rna或crispr-cas9以用于基因编辑。医疗用途或可以是通过递送质粒dna的基因疗法、小圆圈或病毒基因疗法如aav或慢病毒。医疗用途或可以是通过呈递用于免疫疗法的抗原或新抗原，实际上充当疫苗以诱导免疫应答。例如，ev可以通过递送和/或呈递用于癌症免疫疗法的肿瘤抗原，或用于针对病原体的免疫的病毒、细菌或真菌抗原来发挥作用。医疗用途或可以是通过递送小分子、抗体或抗体-药物缀合物，该小分子、抗体或抗体-药物缀合物一旦被递送到细胞或细胞外基质中就能够介导效果。在一个实施例中，医疗用途或可以通过包括多于一种类型的性货物的ev来实现，即性货物可以是蛋白质、核酸、病毒、病毒基因组、抗原和/或小分子的混合物。
[0141]
重要的是，本发明涉及本文所述的ev或药物组合物在预防和/或和/或减轻多种疾病中的用途，通常经由递送基本上任何类型的药物货物，如例如：核酸如rna分子、dna分子或混合物、mrna、反义或剪接转换寡核苷酸、sirna、shrna、mirna、pdna，超螺旋或非超螺旋的质粒、小圆圈、肽或蛋白质，包含转运体、酶、受体如诱饵受体、膜蛋白、细胞因子、抗原和新抗原、核糖核酸蛋白、核酸结合蛋白、抗体、纳米体、抗体片段、抗体-药物缀合物、小分子药物、基因编辑技术如crispr-cas9、talen、巨型核酸酶或基于囊泡的货物如病毒(例
如，aav、慢病毒等)。在一个实施例中，货物可以是蛋白质、核酸、病毒、病毒基因组、抗原和/或小分子的混合物。
[0142]
作为使用本文所述的ev和药物组合物的合适的靶标的疾病和病症的非限制性实例包含以下非限制性实例：自身免疫性疾病(如乳糜泻、克罗恩病、1型糖尿病、格雷夫斯病、炎性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、结节病(sarcoidosis)、特发性肺纤维化、银屑病、肿瘤坏死因子(tnf)受体相关的周期性综合征(traps)、白细胞介素-1受体拮抗剂缺乏症(dira)、子宫内膜异位、自身免疫性肝炎、硬皮病、肌炎)、中风、急性脊髓损伤、血管炎、格林-巴利综合征、急性心肌梗塞、急性呼吸窘迫综合征(ards)、脓毒症、脑膜炎、脑炎、肝功能衰竭、非酒精性脂肪性肝炎(nash)、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、肾衰竭、心力衰竭或任何急性或慢性器官衰竭以及相关的潜在病因、移植物抗宿主病、杜兴氏肌营养不良症(dmd)和其他肌营养不良症，出生时代谢错误，包含碳水化合物代谢病症，例如g6pd缺乏性半乳糖血症、遗传性果糖不耐受、果糖1,6-二磷酸酶缺乏症和糖原贮积病；有机酸代谢病症(有机酸尿症)，如尿黑酸尿症、2-羟基戊二酸尿症、甲基丙二酸或丙酸血症、多重羧化酶缺乏症；氨基酸代谢病症，如pku、枫糖浆尿症、1型戊二酸血症、氨基酸病例如遗传性酪氨酸血症、非酮症高甘氨酸血症和高胱氨酸尿症、遗传性酪氨酸血症、范可尼综合征、原发性乳酸酸中毒例如丙酮酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶和细胞素氧化酶缺乏症；脂肪酸氧化和线粒体代谢病症，如短链、中链和长链酰基-coa脱氢酶缺乏症，也被称为β氧化缺陷、瑞氏综合征(reye's syndrome)、中链酰基-辅酶a脱氢酶缺乏症(mcadd)、线粒体脑病乳酸性酸中毒和中风样发作(melas)、肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(merff)、丙酮酸脱氢酶缺乏症；卟啉代谢病症，如急性间歇性卟啉症；嘌呤或嘧啶代谢病症，如莱施-尼汉综合征(lesch
–
nyhan syndrome)；类固醇代谢病症，如类脂先天性肾上腺增生、先天性肾上腺增生；线粒体功能病症，如卡恩斯-塞尔综合征(kearns
–
sayre syndrome)；过氧化物酶体功能病症，如泽尔韦格综合征(zellweger syndrome)和新生儿肾上腺脑白质营养不良、先天性肾上腺增生或斯-李-奥(smithlemli-opitz)综合征、门克斯综合征(menkes syndrome)、新生儿血素沉着症；尿素循环病症，如n-乙酰谷氨酸合成酶缺乏症、氨基甲酰磷酸合成酶缺乏症、otc缺乏症、瓜氨酸血症(精氨琥珀酸合成酶缺乏症)、精氨琥珀酸尿症(asa；精氨琥珀酸裂解酶缺乏症)、精氨酸血症(精氨酸酶缺乏症)、高鸟氨酸血症、高氨血症、高瓜氨酸尿症(hhh)综合征(线粒体鸟氨酸转运蛋白缺乏症)、瓜氨酸血症ii(柠檬素缺乏症、天冬氨酸谷氨酸转运蛋白)、赖氨酸尿蛋白不耐受(y+l氨基酸转运蛋白1中的突变)、乳清酸尿症(酶umps中的缺陷)；所有溶酶体贮积病，例如α-甘露糖苷贮积症、β-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰葡糖胺尿症、胆固醇酯贮积病、胱氨酸病、达农病(danon disease)、法布里病(fabry disease)、法伯病(farber disease)、岩藻糖苷贮积症、半乳糖唾液酸贮积症、戈谢病i型、戈谢病ii型、戈谢病iii型、gm1神经节苷脂贮积症i型、gm1神经节苷脂贮积症ii型、gm1神经节苷脂贮积症iii型、gm2-桑德霍夫病(sandhoff disease)、gm2-泰-萨二氏病(tay-sachs disease)、gm2-神经节苷脂贮积症、ab变体、粘脂贮积症ii、克拉伯氏病(krabbe disease)、溶酶体酸性脂肪酶缺乏症、异染性脑白质营养不良、mps i-赫尔勒综合征、mps i-施艾氏综合征、mps i赫尔勒-施艾氏综合征、mps ii-亨特氏综合征、mps iiia-沙费利波综合征a型、mps iiib-沙费利波综合征b型、mps iiib-沙费利波综合征c型、mps iiib-沙费利波综合征d型、mps iv-莫尔基奥a型、mps iv-莫尔基奥b
型、mps ix-透明质酸酶缺乏症、mps vi-马罗托-拉米、mps vii-史莱氏综合征、粘脂贮积症i-唾液酸贮积症、粘脂贮积症iiic、粘脂贮积症iv型、粘多糖贮积症、多重硫酸酯酶缺乏症、神经元蜡样脂褐质贮积症t1、神经元蜡样脂褐质贮积症t2、神经元蜡样脂褐质贮积症t3、神经元蜡样脂褐质贮积症t4、神经元蜡样脂褐质贮积症t5、神经元蜡样脂褐质贮积症t6、神经元蜡样脂褐质贮积症t7、神经元蜡样脂褐质贮积症t8、神经元蜡样脂褐质贮积症t9、神经元蜡样脂褐质贮积症t10、尼曼匹克病a型、尼曼匹克病b型、尼曼匹克病c型(npc)、庞贝病(pompe disease)、致密性成骨不全症、唾液酸贮积病(salla disease)、辛德勒病(schindler disease)和沃尔曼病(wolman disease)等、囊性纤维化、原发性纤毛运动障碍、肺泡蛋白沉积症、关节挛缩一肾功能不全一胆汁淤积综合征(arc)综合征、rett综合征、神经退行性疾病，包含阿尔茨海默氏病(alzheimer's disease)、帕金森氏病(parkinson's disease)、gba相关的帕金森氏病、亨廷顿氏病(huntington's disease)和其他三核苷酸重复相关疾病、朊病毒疾病、包含额颞叶痴呆在内的痴呆、肌萎缩性侧索硬化(als)、运动神经元疾病、多发性硬化、癌症诱导的恶病质、厌食症、2型糖尿病和各种癌症。
[0143]
本发明提供包括至少一种abd的ev，其中ev在肿瘤和/或淋巴结内的积累水平高于缺乏至少一种abd的其他方面相同的ev所表现出的积累水平。具体而言，与缺乏abd的ev相比，肿瘤和/或淋巴结积累的水平可以是至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少7倍、或至少8倍、或至少9倍、或至少10倍、或至少20倍或更多。
[0144]
本发明特别有利于由于abd ev在肿瘤中积累而引起的癌症；特别是通过免疫疗法由于在淋巴结中的积累而引起的癌症。
[0145]
具体而言，设想本发明可用于通过癌症免疫疗法癌症，即在abd ev的表面上呈递癌症抗原，使得这些抗原提高针对癌症抗原的免疫应答。事实上，各种类型的癌症是用于本发明的相关疾病靶标，例如急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、aids相关癌症、aids相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、小脑或大脑、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑癌、脑肿瘤(小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性脑胶质瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/良性肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(儿童，胃肠道)、不明原发癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性障碍、结肠癌、原发性皮肤t细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、室管膜细胞瘤、食道癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑素瘤、成视网膜细胞瘤)、胆囊癌、胃窦(胃)癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(gist)、生殖细胞瘤(颅外、性腺外或卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤(脑干胶质瘤、脑星形细胞瘤、视通路和下丘脑胶质瘤)、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病((急性淋巴细胞白血病(也被称为急性淋巴性白血病)、急性骨髓性白血病(也被称为急性髓系白血病)、慢性淋巴细胞白血病(也被称为慢性淋巴性白血病)、慢性髓系白血病(也被称为慢性骨髓性白血病)、毛细胞白血病)、唇及口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤、aids相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金病、成神经管细胞瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、具有隐匿原发性的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、
多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈状真菌病、脊髓发育不良/骨髓增殖性疾病、骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病(急性，慢性)、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽喉癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(肿瘤肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤的尤文家族)、塞扎里综合征(s
é
zary syndrome)、皮肤癌(非黑素瘤、黑素瘤)、小肠癌、鳞状细胞、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌和胸腺上皮癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(macroglobulinemia)和/或维尔姆斯瘤(wilm's tumor)。
[0146]
本发明还特别有利于由于abd ev向脑的增加的生物分布而引起的脑和cns病症。本发明提供包括至少一种abd的ev，其中ev在脑中的积累水平高于缺乏至少一种abd的其他相同ev所表现出的积累水平。具体地，与缺乏abd的ev相比，肿瘤积累的水平可以是至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少7倍、或至少8倍、或至少9倍、或至少10倍、或至少20倍或更多。本发明具体涉及在ev的表面上存在abd的ev，其装载有根据本发明的任何类型的货物，但优选地核酸货物如沉默rna如sirna，其靶向已知与神经退行性疾病有关的rna，该神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、脊髓小脑性共济失调、als、额颞叶痴呆、运动神经元疾病、多发性硬化、wallerian变性和大疱性视网膜劈裂症(bullous retinoschisis)、goldberg-shprintzen综合征、库鲁病(kuru)、自身免疫性gfap星形细胞病，甲基cpg结合蛋白2(mecp2)复制综合征、水通道蛋白-4(aqp4)-星形细胞病变、家族性疼痛综合征如红斑性肢痛症、阵发性极度疼痛病症和先天性疼痛不敏感、佩梅病(pelizaeus
–
merzbacher disease)、朊病毒疾病，包含克-雅病(creutzfeldt-jakob disease)(cjd)、gerstmann
‑‑
scheinker综合征(gss)和致死性家族性失眠(ffi)、脑白质营养不良，包含脱髓鞘性、成人发病、常染体显性和脑白质营养不良。
[0147]
本发明具体涉及在表面上存在abd的ev，其进一步装载有根据本发明的任何性货物，该性货物可以是蛋白质和/或核酸货物，用于dmd、由先天代谢错误引起的疾病，包含溶酶体贮积病症，包含npc和庞贝病，尿素循环病症如asa和瓜氨酸血症和otc缺乏症，异染性脑白质营养不良和pku。
[0148]
增加如性外泌体的复杂产品的保存期对于实现ev的巨大益处至关重要。此外，已知由于脆弱的磷脂酰丝氨酸暴露于重复的冻融循环，ev在结构上易受损伤。本发明旨在克服这些问题。
[0149]
本发明还涉及一种改善ev在储存中的半衰期的方法，该方法包括：a)获得根据本发明的ev，和b)将所述ev配制在包括白蛋白的储存或配方缓冲液中。可以使用任何形式的白蛋白，任选地，白蛋白是重组白蛋白、人白蛋白、血清白蛋白、hsa、重组血清白蛋白、重组hsa、或因此与本发明的abd结合的任何片段或结构域。hsa具有特别长的半衰期，因此是优选的。这一事实也意味着，当本发明的abd-ev在人体中进行测试时，在本技术的小鼠数据中观察到的半衰期延长可以预期被进一步改善。
[0150]
不希望受理论的束缚，在ev的表面上abd的存在，与储存/配方缓冲液中白蛋白的
存在组合，具有允许白蛋白与ev的表面上的abd结合，从而在ev周围产生保护屏障的优点。这可能阻止ev的聚集，但也促进更大的异质纳米颗粒的形成，这保护ev在加工过期间免受破坏性的冻融循环和剪切应力。这导致了具有长保存期的更稳健的ev体。不希望受理论的束缚，据信白蛋白涂层防止ev膜与容器的壁的不想要的相互作用，这意味着在储存后更多的ev被回收，并且另外，回收的ev具有高质量。
[0151]
使用abd和白蛋白在延长这些组合物的保存期方面的额外的益处是白蛋白包被的ev可以直接施用于患者，然后白蛋白将起到增加ev在循环中的半衰期的作用。因此，仅通过对ev的一个修饰(包含abd结构域)，ev在储存和配制期间变得更加稳健。这意味着它们具有更好的功效，减少了由于粘附至容器表面而造成的ev的损失，更重要的是，当那些ev随后施用于患者时，它们还具有增加的体内循环时间。
[0152]
本发明提供包括至少一种abd的ev，其中ev表现出比缺乏至少一种abd的其他方面相同的ev表现出的保存期长至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少70％、至少90％或更多。ev可以表现出比缺乏至少一种abd的其他方面相同的ev表现出的保存期长数周、数月或数年的保存期，例如，保存期可以增加5周、10周、20周、1个月、3个月、6个月、9个月、1年、2年或更多。
[0153]
值得注意的是，白蛋白不含血液来源的杂质，否则这些杂质会激活不需要的细胞途径，并且导致产品不能满足关于宿主细胞蛋白水平的监管机构批准要求。重组白蛋白通过避免宿主细胞蛋白的存在，可以有助于维持最终药物产品在储存期间的安全性和功效。
[0154]
用存在于储存或配方缓冲液中的白蛋白如重组白蛋白预包被abd-ev具有产生abd-ev的预包被形式的额外的益处。此类预包被的abd-ev可以施用于患者，并且abd-ev从患者循环中获得延长abd-ev半衰期所需的白蛋白时没有延迟。因此，此类预包被的abd-ev将展示在注射部位对abd-ev的摄取显著减少(即脱靶标摄取的减少)。这再次导致更多的abd-ev施用剂量在循环中存在更长时间，从而增加预包被的abd-ev的功效。
[0155]
本发明还涉及包括根据本发明的abd-ev的纳米颗粒复合物，其中abd-ev的一些或所有abd与白蛋白结合(即，abd-ev用至少一种类型的白蛋白修饰或预包被在ev的表面上)。本发明还涉及药物组合物，其包括与药学上可接受的赋形剂或载剂组合的本发明的纳米颗粒复合物。
[0156]
在另外的方面，本发明因此还涉及ev、ev-蛋白质复合物和/或包括此类ev和ev-蛋白质复合物的药物组合物，其用于药物，优选地用于将受益于基于含抗体或含fc结构域的蛋白的、基于抗体-药物缀合物(adc)的和/或抗体介导的靶向的疾病。
[0157]
如上所述，用白蛋白(如重组白蛋白)预包被abd-ev具有产生abd-ev的预包被形式的额外的益处，其不依赖于来自患者的自身血液的白蛋白的结合。这加快了白蛋白的保护作用，其进而增加了半衰期，并且因此增加了abd-ev的功效。使用纳米颗粒复合物的另一显著益处是白蛋白与abd的结合强度可以通过abd结合位点的基因工程和所使用的白蛋白的基因工程预先确定。这允许abd和白蛋白之间的高、中或弱强度缔合，这给予纳米颗粒复合物可调节的结合亲和力，因此可以以非常精细的方式控制半衰期。
[0158]
本发明还涉及本发明的ev的亲和谱分离和纯化，其中ev被工程改造成能够高度特异性地与例如谱基质结合，以及任选地随后的洗脱。根据本发明的ev在ev的表面上包括abd蛋白。利用存在于ev上的abd对其结合配偶体白蛋白的亲和力，通过亲和纯化纯化所
述ev是可能的。
[0159]
制备和分离ev(例如外泌体)的常规方法涉及一系列差速离心步骤，以从存在于培养基中的细胞或细胞碎片中分离囊泡，ev由产生ev的细胞释放到该培养基中。通常，进行一系列离心，例如以300g、10,000g和70,000g或100,000g离心，然后将管底部的所得沉淀用盐水溶液再悬浮至其原始体积的一小部分，以构成浓缩的ev或外泌体溶液。然而，由于多种原因，这些方法基本上不适合于临床应用:(1)整个过程所需的延长的时间长度，(2)在gmp环境中放大和验证相关的问题，(3)通过细胞碎片的污染的显著风险，导致宿主细胞蛋白污染达到监管机构批准不可接受的水平，(4)由于操作者的可变性导致的差的再现性，(5)由囊泡的造粒导致的ev/外泌体的聚集，(6)加工结束时的低的回收率，以及(7)对囊泡形态以及由此的生物分布和活性的负面影响。因此，存在对制备膜囊泡的改进方法的需求，该方法适合于工业限制并且允许生产质量的囊泡制剂。为此，国际专利公开号wo 2000/044389公开了用于通过谱技术如阴离子交换谱法和/或凝胶渗透谱法从生物样本制备膜泡的方法。然而，存在相对于所述公开显著改进的空间，尤其是随着ev疗法领域向基于ev的疗法的临床转化和影响方向发展。先前已知的用于纯化外泌体的方法并不理想地适合于商业化产生ev疗法所必需的大规模生产和放大。本发明允许以比用先前已知的方法可实现的高亲和力大得多的规模纯化工程改造的外泌体。
[0160]
本发明通过利用包括白蛋白结构域的谱基质来实现这些和其他目的，该白蛋白结构域对本发明的ev(其被工程改造以在ev的表面上包括abd多肽)具有亲和力。因此，本发明涉及围绕用于分离和/或纯化ev的工艺的各个方面和实施例。有利地，abd用于纯化ev，并且另外，一旦abd-ev被生产和纯化，存在于表面上的abd赋予ev增加的保存期和延长的半衰期。很明显，将abd添加到ev中具有允许纯化和改善的半衰期和保存期的双重功能的益处。因此，abd的添加在仅一个基因工程步骤的情况下生产出极其通用的ev。
[0161]
本发明提供包括至少一种abd的ev，其中ev表现出在人体内的半衰期比缺乏至少一种abd的其他方面相同的ev表现出的半衰期长至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％或更多。例如，ev可以表现出在人体内的半衰期比缺乏至少一种abd的其他方面相同的ev所表现出的半衰期长至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少3小时。
[0162]
本发明的亲和纯化方法包括以下步骤：(i)使包括abd ev的介质与包括白蛋白或其片段或结构域的谱基质接触，(ii)允许本发明的abd ev吸附到白蛋白或其片段/结构域上，和(iii)通过使从白蛋白或其片段或结构域释放abd ev的介质穿过谱基质来洗脱abd ev。如上所述，本发明的ev被工程改造成在其表面上包括并展示abd，如seq id nos:1-4中给出的abd。
[0163]
该过程的原理是所谓的亲和纯化和/或亲和谱法，即基于通用配体和通用相应受体(在这种情况下为白蛋白或其片段或结构域和abd)之间的特异性相互作用，从含有各种类型溶质的复杂生物流体中纯化特定的目标溶质(在这种情况下为ev，如外泌体)。因此，白蛋白或其片段/结构域附着于固定相，而abd多肽存在于ev上，该ev包括在液相中，例如细胞培养基。本发明的工艺和方法易于应用于任何类型的细胞培养基，并且用于贴壁细胞和悬浮细胞的各种细胞培养基已经在本发明的亲和谱方法中进行了测试，例如，rpmi、emem、dmem、mem、pmem、pem、opti-mem、imdm、高级dmem、mccoy培养基、含有或不含有添加剂
如血清、抗生素、营养物等的培养基。
[0164]
在另外的实施例中，该工艺可以包括通过将白蛋白-abd键暴露于具有合适ph的介质来触发ev从白蛋白或其片段/结构域中的释放。这是通过以下实现的：使含ev的介质(即液相)运行通过例如谱柱(该谱柱包括作为固定相的谱基质，其上附着有白蛋白或其片段/结构域)，使ev的abd多肽吸附到基质上存在的白蛋白或其片段/结构域上，然后使具有合适ph的溶液运行通过谱柱。旨在触发ev从柱中释放的溶液的ph可以低于ph 8、低于ph 7或低于ph 6。捕获ev的过程和释放ev的过程都可以重复多次，例如从一次到至多例如500次中的任何一个。
[0165]
在另外的实施例中，白蛋白或其片段/结构域可以经由不同类型的化学和生物化学连接和键与谱基质连接。基质和包括白蛋白或其片段/结构域的蛋白质(例如hsa)之间的共价键可以是常规的酰胺键、二硫键、醚键、酯键、硫醚键、硫酯键、谷胱甘肽-gst相互作用、链霉亲和素-生物素相互作用等。使用化学缀合部分，如n-羟基琥珀酰亚胺(nhs；用于nhc-edc/edac偶联)、硫醇、溴化氰(cnbr)、环氧、硫丙基、伯胺、巯基、羧酸、醛、碘乙酰基、吖内酯、羰基二咪唑(cdi)、马来酰亚胺等，基质可以被化学活化以促进与白蛋白蛋白或其片段/结构域结合，如本领域的技术人员熟知的。
[0166]
在优选的实施例中，本发明的工艺在谱柱中进行，该谱柱包括有包括白蛋白或其片段/结构域的谱基质。
[0167]
用于捕获abd ev的谱基质可以基本上由适合作为固定谱相的任何类型的材料组成。非限制性的实例包含琼脂糖、葡聚糖、凝集素、肝素、纤维素、淀粉、葡聚糖、琼脂、琼脂糖、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚砜、聚乙烯聚合物、聚苯乙烯、二氧化硅、氧化铝、氧化锆、氧化钛、多糖-矿物结构、多糖-合成聚合物、合成聚合物-矿物结构或其任何组合中的一种或多种。基质可以是珠、纤维、不规则形状的颗粒、膜、扁平结构、多孔矿物材料或基本上任何类型的合适固定相的形式。自然，连接到基质上的白蛋白或其片段/结构域也可以使用化学键和接头被直接连接到各种表面上。这对于如例如表面等离子体共振的方法特别有用。
[0168]
根据本发明的亲和纯化方法可以进一步包括额外的ev纯化步骤，其可以在本发明的亲和捕获步骤之前进行。合适的纯化方法如本文结合本发明的第二方面所公开的。
[0169]
重要的是，如上所述，abd ev的亲和纯化可以运行多次，基本上是无限期的，但至少运行2至500次中的任何一个。结合白蛋白的ev的顺序纯化使得在纯化步骤之间能够装载外源物。例如，结合白蛋白的ev可以直接从产生ev的细胞来源的条件培养基(cm)中纯化，接着是外源物装载步骤，以及又一轮纯化。示意性地，这可以说明如下：
[0170]-通过产生ev的细胞将ev分泌到细胞培养基中；
[0171]-使用本发明的工艺和方法亲和纯化ev
[0172]-药物装载(例如，通过电穿孔或转染试剂将sirna装载到ev中/ev的表面上)；
[0173]-使用本发明的工艺和方法亲和纯化ev。
[0174]
额外的外源性装载步骤可以涉及使用任何已知的外源性装载方法装载货物，该方法包含：电穿孔、用转染试剂如阳离子转染剂、lipofectamine(rtm)转染、货物与膜锚定部分如脂质或胆固醇尾部的缀合、或通过cpp装载(以cpp-货物缀合物的形式或以cpp-货物非共价复合物的形式)。
[0175]
上述方面中的任何一个可以与任何其他方面组合。
[0176]
实例
[0177]
实例1：构建体在生产者细胞中的表达
[0178]
使用如本文公开的技术，设计了编码以下关键部分中描述的融合蛋白的核酸融合构建体，并将其引入到产生ev的细胞中，使得这些细胞表达融合蛋白。由于在融合构建体中存在ev蛋白，该融合蛋白随后被并入到由生产者细胞产生的ev中。通过蛋白质印迹来测试构建体在稳定转导的hek-293t生产者细胞中的表达。nanoluc和肌动蛋白初级抗体分别被用于检测。图1中所示的数据显示所有的构建体在hek-293t稳定细胞中表达良好。
[0179]
关键：
[0180]-mcd63-nluc(seq id no:5)：对照融合蛋白，其包括外泌体蛋白(cd63)和nanoluc报告物(缺乏abd)的融合蛋白。
[0181]-mcd63-abdx2-nluc(seq id no:6)：外泌体蛋白(cd63)与abd的融合蛋白，其被工程改造以便存在于ev的表面上并表达nanoluc报告物(p6＝第6代，p10＝第10代)。
[0182]-mcd63-abdx2-neo-nluc(seq id no:9)：外泌体蛋白(cd63)与abd的融合蛋白，其被工程改造以便存在于ev的表面上并表达另外包括肿瘤抗原(新抗原＝6种肿瘤抗原)的nanoluc报告物。
[0183]
包含新抗原以递送新抗原货物，用作通过免疫疗法癌症的疫苗。向构建体中添加新抗原显示，可以向同一cd63-abd构建体中添加额外的序列和基序，而不影响构建体的表达。在本实例中，任何其他性蛋白质可以被插入到融合构建体中以代替新抗原。
[0184]
所有构建体在hek-293t稳定细胞中表达良好。mcd63-abdx2-nluc构建体的表达在几次传代后没有降低，显示尽管进行了显著的基因工程，但该构建体在多次传代后仍是稳定的，已知基因工程可以在几次传代后影响某些表达盒的表达。实例1的构建体中使用的abd是abd035(seq id no:4)。
[0185]
实例2：构建体在ev级分中的表达
[0186]
一旦建立了构建体在稳定转导的hek-293t生产者细胞中的表达，然后通过蛋白质印迹来测试构建体在纯化后的ev级分中的表达。
[0187]
关键：
[0188]-hek-wt：来自hek-293t wt细胞的ev作为阴性对照。
[0189]-mcd63-abdx2-mut30-nluc(seq id no:10)：外泌体蛋白(cd63)与abd的融合蛋白，其被工程改造以便存在于ev的表面上并表达nanoluc报告物。另外包括肿瘤抗原(mut30)。
[0190]-mcd63-abdx2-nluc(seq id no:6)：外泌体蛋白(cd63)与abd的融合蛋白，其被工程改造以便存在于ev的表面上并表达nanoluc报告物。
[0191]-mcd63-nluc(seq id no:5)：对照融合蛋白，其包括外泌体蛋白(cd63)和nanoluc报告物(缺乏abd)的融合蛋白。
[0192]-mcd63-abdx2-neo-nluc(seq id no:9)：外泌体蛋白(cd63)与abd的融合蛋白，其被工程改造以便存在于ev的表面上并表达另外包括肿瘤抗原(新抗原＝6种肿瘤抗原)的nanoluc报告物。
[0193]
所有的构建体在从hek-293t稳定细胞中纯化的ev中表达良好。构建体的表达在几
次传代后没有降低。
[0194]
nanoluc、alix和cd81初级抗体分别用于检测(alix和cd81是外泌体标志物蛋白)。实例2的构建体中使用的abd是abd035(seq id no:4)
[0195]
实例3：abd ev的改善的体内半衰期
[0196]
与缺乏abd结构域的ev相比，在nmri小鼠体内测试了abd ev的半衰期。将工程改造以在表面表达abd加上发光nanoluc报告物(mcd63-abdx2
–
nanoluc(seq id no:6))的ev与工程改造以仅表达nanoluc(mcd63
–
nanoluc(seq id no:5))的ev进行比较。实例3的构建体中使用的abd是abd035(seq id no:4)。使用每组6只nmri小鼠，并以1e11/小鼠的剂量静脉注射ev。基于相对光单位(rlu)/注射的ev数(总rlu/1e11)计算在特定时间点循环中保留的ev的数量。由此，衍生出血浆中注射的ev的百分比。
[0197]
图3中的数据显示，abd的存在通过使它们至少在高达4.5小时的时间点更稳定而显著地增加了循环中ev的半衰期。
[0198]
与对照组相比，在ev的表面上abd的存在导致循环中的ev超过14倍，如从图3可以看到的，这导致ev在循环中的半衰期显著增加。
[0199]
实例4：与对照ev相比，abd ev的生物分布
[0200]
据预测，ev的改善的半衰期将影响那些ev的生物分布。为了研究与对照ev(mcd63-nanoluc(seq id no:5))相比abd ev(mcd63-abdx2-nanoluc(seq id no:6))的生物分布，在注射后270分钟对血液进行取样并收获内脏器官。实例4的构建体中使用的abd是abd035(seq id no:4)。测量每个器官或血浆中的总rlu，并且基于rlu/注射的ev数(总rlu/1e11)计算注射的ev的百分比。
[0201]
图4中的数据显示，在ev的表面上abd的存在增加了脑、肾脏、血浆和肝脏中的ev数量。图4中的列上方的数字表示与对照组相比的倍数变化。在大脑中观察到3倍增加，在肾脏中观察到2倍增加，在血浆中观察到14倍增加，并且在肝脏中观察到1.3倍增加。在ev的表面上abd的存在不影响ev在肺中的生物分布，并且降低ev在脾脏中的生物分布。
[0202]
因此，abd的存在有利于改变ev的生物分布。对于其中预期的靶器官是脑的ev或用于癌症的ev来说尤其如此，其中在血浆和淋巴结中需要高水平的ev。显然的是，本发明在另外包括靶向部分的ev的情况下将是极其有用的；例如，经工程改造以靶向特定器官或疾病状态的ev，如脑靶向的ev或包括癌症靶向部分的ev。
[0203]
实例5：abd ev的肿瘤积累
[0204]
在发现在ev的表面上abd的存在延长了ev在循环中的半衰期并改变ev的生物分布后，预测ev的改善的半衰期和改变的生物分布将影响那些ev的肿瘤积累。此外，由于肿瘤血管具有通透性并且肿瘤组织缺乏功能性淋巴系统，因此ev可以通过增强的通透性和滞留(epr)效应在肿瘤组织中积累。ev不能循环回到循环系统。此外，肿瘤组织通常表达白蛋白的受体，并且与白蛋白结合的ev将以这种方式靶向肿瘤。为了研究与对照ev(mcd63-nanoluc(seq id no:5))相比abd ev(mcd63-abdx2-nanoluc(seq id no:6))的肿瘤积累，c57小鼠(每组3只小鼠)被静脉内注射对照ev或结合白蛋白的ev(1e11 ev/小鼠)。实例5的构建体中使用的abd是abd035(seq id no:4)。注射后4.5小时，收获肿瘤并用组织裂解物在缓冲液(0.1％(v/v)tritonx-100)中裂解。通过光度计测量来自裂解物的nanoluc信号。
[0205]
图5中的数据显示，与对照组相比，在ev的表面上abd的存在使ev在肿瘤中的积累
增加了1.73倍。
[0206]
因此，abd的存在有利于改变ev的生物分布，使它们在肿瘤中积累。这在通过ev疗法癌症中特别有用，该ev疗法可能需要向ev装载性货物，如小的制瘤分子、抗癌抗体或抗癌沉默rna。可替代地或另外地，性ev可以包括新抗原，其用于通过免疫疗法提高针对癌症的免疫应答。此外，向ev中添加肿瘤靶向部分将进一步增加abd ev的肿瘤积累。
[0207]
实例6：abd增加淋巴结积累
[0208]
在发现在ev的表面上abd的存在延长了ev在循环中的半衰期并改变ev的生物分布后，还预测ev的改善的半衰期和改变的生物分布将影响那些ev在淋巴结中的积累。此外，abd与纳米颗粒的缀合已经显示出在淋巴结中积累纳米颗粒。为了研究与对照ev(mcd63-nanoluc(seq id no:5))相比abd ev(mcd63-abdx2-nanoluc(seq id no:6))的淋巴结积累，nmri小鼠(每组6只小鼠)被静脉内注射对照ev或结合白蛋白的ev(1e11 ev/小鼠)。实例6的构建体中使用的abd是abd035(seq id no:4)。注射后4.5小时，收获淋巴结并用组织裂解物在缓冲液(0.1％(v/v)tritonx-100)中裂解。通过光度计测量来自裂解物的nanoluc信号。
[0209]
图6中的数据显示，与对照组相比，在ev的表面上abd的存在使ev在淋巴结中的积累显著增加了11.5倍。
[0210]
因此，abd的存在有利于改变ev的生物分布，使它们也能在淋巴结中积累。当性货物被设计成引发免疫应答时，即装载有一种抗原或多种抗原的ev被设计成充当疫苗时，这是特别有用的，因为已知t细胞-抗原呈递细胞串扰发生在淋巴结中。将图5和图6中的数据放在一起可以看出，特别地，abd ev在通过免疫疗法癌症中特别有用，但是也可以设想通过免疫疗法任何其他疾状。
[0211]
实例7：abd-ev白蛋白体外结合测定
[0212]
为了证实存在于ev的表面上的abd能够结合白蛋白，使用谱法进行了体外结合测定。异硫氰酸荧光素(fitc)标记的白蛋白与abd-ev(mcd63-abd第二环-nanoluc(seq id no:8))或缺乏abd(mcd63-nanoluc(seq id no:5))加上磷酸盐缓冲盐水(pbs)对照的对照ev的结合。
[0213]
1e11 ev与fitc人白蛋白(360μg/ml)在37℃下温育2小时。在此温育后，使用尺寸排阻谱法来获得每个样本的48个级分，其中级分1至8作为ev级分并且级分9至48作为可溶性蛋白质级分。这些数据在图7a中呈现。
[0214]
图7a中ev级分(1至8)的数据显示，只有结合白蛋白的ev(abd-ev)显示出由spectramax检测到的明显的fitc荧光，表明ev与fitc-白蛋白的结合。级分3和4具有最高的荧光信号。
[0215]
图7b显示了nanoluc信号，其在所有48个级分中被测试以确认级分1至8是ev级分。级分3和4在结合白蛋白的ev组(abd-ev)中显示最高的nanoluc信号，相应于在fitc实验中检测到的荧光信号。
[0216]
实例8：通过流式细胞术的abd-ev白蛋白结合测定
[0217]
在图7显示谱数据后，对与白蛋白结合的abd-ev进行了进一步的体外分析。为了证实存在于ev的表面上的abd能够结合白蛋白，获取来自实例7中谱法实验的级分3和4，以用于通过cellstream进行流式细胞术分析。pan(cd9-cd63-cd81)-腺瘤性息肉病大肠杆
菌(apc)抗体用于对样本进行染。图8中的数据显示，只有结合白蛋白的ev组(abd-ev)显示双(apc和fitc)阳性信号，在级分3和4中分别为6.69％和4.14％。
[0218]
值得注意的是，由于在流式细胞术期间需要稀释样本，这可能导致白蛋白从ev中的解离。因此，双阳性ev的真实百分比可能显著高于图8中呈现的百分比。然而，图8中提供的数据清楚地显示，白蛋白与工程改造的abd-ev结合。数据与由spectramax检测的荧光信号和由光度计检测的nanoluc信号良好地相关。
[0219]
实例9：额外的abd-ev白蛋白体外结合测定
[0220]
在实例7中描述并在图7a和7b中显示的体外结合测定成功之后。使用与实例7中概述相同的方案，但是测试了更宽范围的构建体。这些构建体包含一系列不同的ev蛋白(人cd81、cd9和cd63)和一系列abd的不同位置(第一环、第二环或两个环(x2))。
[0221]
图9a-f显示与图7类似的结果，表明当将abd工程改造到融合构建体中时，fitc白蛋白结合在ev的表面上，该融合构建体具有一系列不同的ev蛋白并且位于ev蛋白内的一系列不同位置(第一环、第二环或两个环)这显示白蛋白与abd的结合不依赖于融合构建体中存在的ev蛋白的类型，也不依赖于abd在融合蛋白内的位置。
[0222]
重要地，abd融合到两个环中的实验显示，可以将功能性蛋白质工程改造到多程跨膜ev蛋白的多于一个环中，而ev蛋白不被破坏或不影响膜插入。
[0223]
实例10：额外的体内半衰期延长实验
[0224]
在实例3显示的实验成功后，体内测试了额外的构建体，以评估abd与一系列不同ev蛋白和位于不同环中的abd组合的效果。构建的测试的为：
[0225]
·
小鼠cd81-abd第二环
[0226]
·
小鼠cd9-abd第二环
[0227]
·
小鼠cd63-abd第二环
[0228]
·
人cd81-abd第二环
[0229]
·
人cd9-abd第二环
[0230]
·
人cd63-abd第二环
[0231]
·
小鼠cd9-abdx2(两个环)
[0232]
·
人cd9-abdx2(两个环)
[0233]
所用的方案与实例3中给出的相同。总之，nmri小鼠iv注射1e11 ev并在4.5小时后采集血浆。
[0234]
图10a和b中的数据显示，abd的存在显著增加了循环中的ev的数量。在ev的表面上abd的存在导致所有构建体的血浆中注射的ev百分比显著增加。
[0235]
实例11：使用单程跨膜蛋白的额外的体外和体内半衰期延长实验。
[0236]
进行设计类似于实例7和3中所述的实验，以测试利用单程跨膜蛋白而非多程跨膜蛋白的融合蛋白构建体的体外结合潜力和体内半衰期延长能力。
[0237]
所用的方案与实例7和3中给出的相同。构建体使用单程跨膜ev蛋白lamp2b:
[0238]-对照：lamp2b-nanoluc
[0239]-活性物：lamp2b-abd-nanoluc
[0240]
图11a和b显示了将abd工程改造到单程跨膜蛋白lamp2b中导致abd与ev结合(体外测定)，并且图11c显示相同的ev当在体内时导致循环时间3-4倍的显著增加，表明abd工程
改造是使用单程或多程跨膜蛋白在循环中延长ev的通用平台。
[0241]
实例12：额外的肿瘤/淋巴结积累实验
[0242]
在实例5和实例6中显示abd ev在肿瘤和淋巴结中积累的证据后，进行了类似的额外的实验，以使用替代构建体(特别是cd63-abd第二环构建体)测试肿瘤和淋巴结积累。
[0243]
图12中的数据显示，与对照组相比，在ev的表面上abd的存在显著增加了ev在肿瘤(a)和淋巴结(b)中的积累。
[0244]
这一数据再次显示abd的存在因此有利于改变ev的生物分布，使它们能够在肿瘤和淋巴结中积累。重要地，这一数据显示在表面上abd的存在对具有不同设计的不同构建体广泛有效。如前所述，靶向肿瘤的能力在通过ev疗法癌症中特别有用，这可能需要向ev装载性货物，如小的制瘤分子、抗癌抗体或抗癌沉默rna。可替代地或另外地，性ev可以包括新抗原，其用于通过免疫疗法提高针对癌症的免疫应答。此外，向ev中添加肿瘤靶向部分将进一步增加abd ev的肿瘤积累。
[0245]
实例13：通过不同施用途径递送后的在血浆中的半衰期。
[0246]
为了评估经由不同施用途径施用时abd ev延长半衰期的潜力，进行了另一实验。除了通过静脉内(iv)、皮下(sc)或腹膜内(ip)施用途径递送ev之外，经由使用与实例7中所述相同的体内方案，将表达融合蛋白cd63-abd-第二环-nanoluc的ev与仅表达cd63-nanoluc的对照ev进行比较。
[0247]
图13a-c显示，无论施用途径如何，与对照相比，abd的存在增加了ev的体内血浆水平。
[0248]
实例14：在iv递送后来自替代细胞来源的ev在血浆中的半衰期。
[0249]
进行了另一项类似于实例3中所述的方案的体内半衰期延长实验，这次使用的是来源于cap细胞(羊膜上皮细胞)的ev。
[0250]
图14显示来自测试表达小鼠cd63-abd第二环的cap衍生的ev的实验的结果。图14a和b显示，类似于上述数据，来源于在表面上表达abd的cap来源细胞的ev以高于对照ev的水平存在于血浆中，显示abd ev具有更长的半衰期。这显示将abd工程改造到ev中的效果广泛地适用于来源于不同来源细胞的ev。
[0251]
还对cap衍生的ev进行了类似于实例4中所述的生物分布实验，并证明了在脑、淋巴结和肿瘤中的优先积累，类似于针对hek衍生的ev显示的数据(数据未显示)。
[0252]
实例15：梯度分离和宽视野显微镜
[0253]
进行梯度分离以评估白蛋白与在表面上表达abd的ev的结合。测试的融合构建体是:
[0254]-mcd63-nluc(浓度：1.37x10
12
个颗粒/ml)
[0255]-mcd63-abd-第二环nluc(浓度：6.5x10
11
个颗粒/ml)
[0256]
具有与不同或两个cd63环融合的白蛋白结合结构域的hek ev与80μg/ml人血清白蛋白(用alexa fluor 488标记)和用alexa fluor 647标记的四次跨膜蛋白抗体的混合物(cd9、cd63和cd81，1:100)一起在4℃5μl温育过夜。第二天，通过optiprep梯度超速离心分离ev，并收集300μl级分，将来自每种级分的100μl用于斑点印迹分析，并且将来自三种后续级分的50μl汇合并用于成像(宽视野和dstorm)
[0257]
图15a显示汇合的级分的图像。这显示，当abd不存在于ev的表面上时，hsa染(上
图)与ev级分(下图，用cd9/63/81染)没有重叠，显示在没有abd存在的情况下，hsa不与ev缔合，hsa仅存在于聚集级分中。
[0258]
图15b显示，当abd存在于ev的表面上时，观察到在级分10-24处hsa染(上图)与ev(下图，用cd9/63/81染)重叠，显示在存在abd的情况下，hsa与ev级分缔合。
[0259]
图15c和d显示了来自图15b的mcd63-abd第二环-nluc ev的宽视野显微术，显示hsa标记物与ev标志物cd9、cd63和cd81重叠。这再次证实了hsa存在于abd ev的表面上。
[0260]
实例16
–
通过斑点印迹的体内abd结合测定。
[0261]
在确认发现白蛋白在体外与abd ev结合后，随后进行了体内实验，以评估在ev的表面上abd的存在是否导致在ev注入到循环后白蛋白被结合，从而延长那些ev的半衰期。
[0262]
小鼠被注射mcd63-abd-第二环nluc hek ev或mcd63-nluc(无abd对照)。在注射后10分钟采集血清，并用尺寸排阻柱(qev)纯化以分离ev。然后将2.5x10
10 ev与抗小鼠血清白蛋白抗体(用fitc标记)和用alexa fluor 647标记的四次跨膜蛋白抗体的混合物(人特异性cd9、cd63和cd81，1:100)一起在4℃下温育过夜。第二天，通过optiprep梯度超速离心分离ev，并收集300μl级分，来自每种级分的100μl用于斑点印迹分析，并且将来自三种后续级分的50μl取出并用于成像(宽视野)。
[0263]
图16显示斑点印迹数据的定量。此图显示从血清中回收的abd ev比对照ev多得多，再次显示abd存在于表面上，将白蛋白吸引到ev的表面并延长了那些ev的血浆半衰期。
[0264]
实例17
–
通过斑点印迹的体外结合测定。
[0265]
在实例16和图16中的数据后，当abd作为不同融合构建体的一部分在ev的表面上表达时，进行另外的体外结合实验以评估hsa与abd的结合。
[0266]
包括以下测试的融合构建体的ev为：
[0267]-hcd81-abd-第一环-nluc
[0268]-hcd81-abd-第二环-nluc
[0269]-hcd81-abd-2x-nluc(abd存在于两个环中)
[0270]-hcd81-abd-nluc
[0271]-hcd9-abd-第一环-nluc
[0272]-hcd9-abd-第二环-nluc
[0273]-hcd9-abd-2x-nluc(abd存在于两个环中)
[0274]-hcd9-abd-nluc
[0275]-mcd63-abd-第二环-tluc
[0276]-mcd63-tluc
[0277]-lamp2b-abd-nluc
[0278]-lamp2b-nluc
[0279]
本实验通过将表达上文详述的构建体的4e
10 hek ev与80μg/ml人血清白蛋白(用alexa fluor 488标记)和四次跨膜蛋白抗体的混合物一起在4℃下温育过夜进行。第二天，通过optiprep梯度超速离心分离ev，并收集300μl级分，将来自每种级分的100μl用于斑点印迹分析，并且将来自三种后续级分的50μl取出并用于标记有alexa fluor 64的成像(宽视野和dstorm)芯片(cd9、cd63和cd81，1:100)。
[0280]
图17a显示cd81构建体的斑点印迹的定量。
[0281]
图17b显示cd9构建体的斑点印迹的定量。
[0282]
图17c显示cd63构建体的斑点印迹的定量。
[0283]
图17d显示lamb2b构建体的斑点印迹的定量。
[0284]
图17中的数据显示，在其中存在abd的所有样本中，hsa水平大大增加。这表明在ev的表面上abd的存在使得ev能够结合白蛋白并在加工后将该白蛋白保留在表面上，表明白蛋白与在ev的表面上的abd结合的强度相对较强。值得注意的是，这种作用不依赖于：a)abd已经与其融合的ev蛋白的类型(多程跨膜或单程跨膜)，或b)abd的位置(四次跨膜蛋白的第一环、第二环或两个环)。
[0285]
实例18：abd增加了ev在储存期间的稳定性
[0286]
如上述实例显示，在ev的表面上abd的存在可以增加ev在体内的稳定性，从而增加其在体内的半衰期。因此也预测，在ev的表面上abd的存在可以改善ev在储存中的稳定性。将白蛋白添加到ev的储存缓冲液中会导致ev与白蛋白结合，并变得被白蛋白的保护屏障包被。此类保护屏障被认为保护ev免受由冻融循环造成的损害，因此除了改善体内半衰期外，还改善配方的稳定性。这种稳定性是有利的，因为它将导致ev的药物组合物的增加的保存期，制成更稳健的多功能产品，该产品将在储存期间在更长时间内保持生物活性。
[0287]
abd-ev是从在生物反应器中培养的产生ev的基因工程改造的和永生化的细胞系中获得的。从生物反应器中收获含有ev的cm。然后通过离心从cm中分离出ev，以除去细胞和细胞碎片，然后过滤以除去任何较大的颗粒。然后使用tff系统将过滤的cm运行通过中空纤维过滤器，并在渗滤后浓缩。然后将ev与包括白蛋白的配方缓冲液组合，并且然后将该配方a)储存持续一段时间(在不同温度(-80℃、-20℃、4℃)下储存长达30周)；或b)经受重复的冻融循环。
[0288]
然后，在不同温度下长时间储存以及重复的冻融循环后，测试ev体的质量和稳健性。使用纳米颗粒跟踪分析(nta)测试ev数量。使用多种技术测量ev的质量:
[0289]
i)通过比较储存/应激测试之前和之后的rna含量；
[0290]
ii)使用如gfp或nanoluc的荧光标记物对ev加标签，并在储存/应激测试之前和之后通过光谱仪(spectramax)分析荧光/生物发光的水平；和
[0291]
iii)在使用装载有货物的ev进行储存/应激测试之前和之后，测试ev的功能性，其效果可以在体内观察到。例如，可以将剪接转换货物rna添加到ev中。当将那些ev添加到包括在剪接转换寡聚体存在下转换的报告物的细胞中时，ev中装载的货物的有效性是可测量的。可替代地，可以在nf-κb报告物细胞模型中测试在表面上表达诱饵配体的ev(如被遗传修饰以展示tnfα诱饵受体的ev)，该nf-κb报告物细胞模型被遗传修饰以表达nf-κb-荧光素酶报告物基因作为用于炎症的模型。然后，可以在储存/应激测试之前和之后测量包括tnfα诱饵受体的ev的抗炎活性。此外，携带cre的abd-ev也可以用于在储存/应激测试之前和之后在受体细胞中使用cre-lox报告物来测试cre的功能。
[0292]
实例19：abd ev的纯化
[0293]
还预测abd对白蛋白的结合亲和力将允许使用亲和谱法来纯化本发明的abd ev。纯化的步骤包括：(i)使包括abd ev的介质与包括白蛋白或其片段或结构域的谱基质接触，(ii)允许本发明的abd ev吸附到白蛋白或其片段/结构域上，和(iii)通过使从白蛋白或其片段或结构域释放abd ev的介质穿过谱基质来洗脱abd ev。
[0294]
abd ev从cm中获得，该cm从在中空纤维生物反应器中生长的基因工程改造的产生ev的细胞系中收集。分泌的ev包括存在于表面上的abd。从生物反应器中获得的cm被装载到与谱系统连接的柱上。谱基质包括与表面结合的白蛋白。根据制造商的说明选择谱柱平衡、样本装载和柱原位清洗程序的流速设置。将包括abd ev的介质装载到谱柱上，并且abd ev与包括白蛋白的基质结合。选择洗脱缓冲液，以通过改变溶液的ph从柱上洗脱abd ev。然后收集样本并储存在-80℃下，用于使用流式细胞术、电子显微镜和生物活性测定进行另外的下游分析。
[0295]
捕获ev的过程和释放ev的过程重复多次。洗脱步骤包括通过将白蛋白-abd键暴露于具有合适ph的介质来触发ev从白蛋白或其片段/结构域中的释放。这是通过以下实现的：使含ev的介质(即液相)运行通过谱柱(该谱柱包括作为固定相的谱基质，其上附着有白蛋白或其片段/结构域)，使ev的abd多肽吸附到基质上存在的白蛋白或其片段/结构域上，然后使具有合适ph的溶液运行通过谱柱。旨在触发ev从柱中释放的溶液的ph可以低于ph 8、低于ph 7或低于ph 6。
[0296]
序列表
[0297]
abd的氨基酸序列
[0298]
seq id no:1 abd001(wt)
[0299]
sdyyknlinnaktvegvkalideilaalp
[0300]
seq id no:2 abd011
[0301]
sdyykniinraktvegvralklhilaalp
[0302]
seq id no:3 abd013
[0303]
sdyyknlinkaktvegvealtlhilaalp
[0304]
seq id no:4 abd035
[0305]
sdfykrlinkaktvegvealklhilaalp
[0306]
与his标签一起使用的构建体的氨基酸序列(任选的)。编码所用构建体的核苷酸序列标识符也在括号和序列表中提供，序列表通过引用整体并入。
[0307]
seq id no:5 mcd63-nanoluc(seq id nos:34和44)
[0308]
maveggmkcvkfllyvlllafcacavgliaigvavqvvlkqamhithettagsllpvviiavgaflflvafvgccgackenyclmitfaiflslimlvevavaiagyvfrdqvksefnksfqqqmqnylkdnktatildklqkennccgatrsnytdwenipgmakdrvpdsccinitvgcgndfkestihtqgcvetiaiwlrknillvaaaalgiafvevlgiifscclvksirsgyevmgsgsgsgsgsvftledfvgdwrqtagynldqvleqggvsslfqnlgvsvtpiqrivlsgenglkidihviipyeglsgdqmgqiekifkvvypvddhhfkvilhygtlvidgvtpnmidyfgrpyegiavfdgkkitvtgtlwngnkiiderlinpdgsllfrvtingvtgwrlcerilahhhhhh*
[0309]
seq id no:6 mcd63-abdx2-nanoluc(seq id nos:35和45)
[0310]
maveggmkcvkfllyvlllafcacavgliaigvavqvvlkqamhgslaeakvlanreldkygvsdfykrlinkaktvegvealklhilaalpgselmhithettagsllpvviiavgaflflvafvgccgackenyclmitfaiflslimlvevavaiagyvfrdqvksefnksfqqqmqnylkdnktatildklqkennccgatrrtqhdeavdanslaeakvlanreldkygvsdfykrlinkaktvegvealklhilaalprtctsgtrsnytdwenipgmakdrvpdsccinitvgcgndfkestihtqgcvetiaiwlrknillvaaaalgiafvevlgiifscclvksirsgyevmgsgsgsgsgsvftledfvgdwrqtagynldqvleqggvsslfqnlgvsvtpiqrivlsgenglkidihviipyeglsgdqmgqiek
ifkvvypvddhhfkvilhygtlvidgvtpnmidyfgrpyegiavfdgkkitvtgtlwngnkiiderlinpdgsllfrvtingvtgwrlcerilahhhhhh*
[0311]
seq id no:7 mcd63-abd第一环-nanoluc(seq id nos:36和46)
[0312]
maveggmkcvkfllyvlllafcacavgliaigvavqvvlkqamhgslaeakvlanreldkygvsdfykrlinkaktvegvealklhilaalpgselmhithettagsllpvviiavgaflflvafvgccgackenyclmitfaiflslimlvevavaiagyvfrdqvksefnksfqqqmqnylkdnktatildklqkennccgatrsnytdwenipgmakdrvpdsccinitvgcgndfkestihtqgcvetiaiwlrknillvaaaalgiafvevlgiifscclvksirsgyevmgsgsgsgsgsvftledfvgdwrqtagynldqvleqggvsslfqnlgvsvtpiqrivlsgenglkidihviipyeglsgdqmgqiekifkvvypvddhhfkvilhygtlvidgvtpnmidyfgrpyegiavfdgkkitvtgtlwngnkiiderlinpdgsllfrvtingvtgwrlcerilahhhhhh*
[0313]
seq id no:8 mcd63-abd第二环-nanoluc(seq id nos:37和47)
[0314]
maveggmkcvkfllyvlllafcacavgliaigvavqvvlkqamhithettagsllpvviiavgaflflvafvgccgackenyclmitfaiflslimlvevavaiagyvfrdqvksefnksfqqqmqnylkdnktatildklqkennccgatrrtqhdeavdanslaeakvlanreldkygvsdfykrlinkaktvegvealklhilaalprtctsgtrsnytdwenipgmakdrvpdsccinitvgcgndfkestihtqgcvetiaiwlrknillvaaaalgiafvevlgiifscclvksirsgyevmgsgsgsgsgsvftledfvgdwrqtagynldqvleqggvsslfqnlgvsvtpiqrivlsgenglkidihviipyeglsgdqmgqiekifkvvypvddhhfkvilhygtlvidgvtpnmidyfgrpyegiavfdgkkitvtgtlwngnkiiderlinpdgsllfrvtingvtgwrlcerilahhhhhh*
[0315]
seq id no:9 mcd63-abdx2-neo-nanoluc(seq id no:38)
[0316]
maveggmkcvkfllyvlllafcacavgliaigvavqvvlkqamhgslaeakvlanreldkygvsdfykrlinkaktvegvealklhilaalpgselregvelcpgnkyemrrhgtthslvihddsgspfpaavilrdalhmarglkylhqelmhithettagsllpvviiavgaflflvafvgccgackenyclmitfaiflslimlvevavaiagyvfrdqvksefnksfqqqmqnylkdnktatildklqkennccgatrrtqhdeavdanslaeakvlanreldkygvsdfykrlinkaktvegvealklhilaalprtctsgvydffvwlgrghllgrlaaivgkqvllgrkvvvvrshchwndlavipagvvhnwdfeprkvsctpskpsfqefvdwenvspelnstdqpflsgtrsnytdwenipgmakdrvpdsccinitvgcgndfkestihtqgcvetiaiwlrknillvaaaalgiafvevlgiifscclvksirsgyevmgsgsgsgsgsvftledfvgdwrqtagynldqvleqggvsslfqnlgvsvtpiqrivlsgenglkidihviipyeglsgdqmgqiekifkvvypvddhhfkvilhygtlvidgvtpnmidyfgrpyegiavfdgkkitvtgtlwngnkiiderlinpdgsllfrvtingvtgwrlcerilahhhhhh*
[0317]
seq id no:10 mcd63-abdx2-mut30-nanoluc(seq id no:39)
[0318]
maveggmkcvkfllyvlllafcacavgliaigvavqvvlkqamhgslaeakvlanreldkygvsdfykrlinkaktvegvealklhilaalpgselmhithettagsllpvviiavgaflflvafvgccgackenyclmitfaiflslimlvevavaiagyvfrdqvksefnksfqqqmqnylkdnktatildklqkennccgatrrtqhdeavdanslaeakvlanreldkygvsdfykrlinkaktvegvealklhilaalprtctpskpsfqefvdwenvspelnstdqpflsgtrsnytdwenipgmakdrvpdsccinitvgcgndfkestihtqgcvetiaiwlrknillvaaaalgiafvevlgiifscclvksirsgyevmgsgsgsgsgsvftledfvgdwrqtagynldqvleqggvsslfqnlgvsvtpiqrivlsgenglkidihviipyeglsgdqmgqiekifkvvypvddhhfkvilhygtlvidgvtpnmidyfgrpyegiavfdgkkitvtgtlwngnkiiderlinpdgsllfrvtingvtgwrlcerilahhhhhh*
[0319]
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技术特征：

1.一种细胞外囊泡(ev)，所述细胞外囊泡被修饰以包括至少一个存在于所述ev的表面上的白蛋白结合结构域(abd)。2.根据权利要求1所述的ev，其中所述abd与ev蛋白形成融合蛋白的一部分，任选地，其中所述ev蛋白是跨膜ev蛋白或与所述ev膜的外表面缔合的ev蛋白。3.根据权利要求2所述的ev，其中所述abd被工程改造到多程跨膜蛋白的囊泡外环中，任选地，其中所述多程跨膜蛋白是四次跨膜蛋白。4.根据权利要求2或3所述的ev，其中所述ev蛋白选自由以下组成的组：cd63、cd81、cd9、cd82、cd44、cd47、cd55、lamp2b、icam和arrdc1，以及其衍生物、结构域、变体、突变体或区域。5.根据前述权利要求中任一项所述的ev，其中所述ev包括多于一个abd。6.根据权利要求2至5中任一项所述的ev，其中在同一融合蛋白中存在多于一个abd。7.根据前述权利要求中任一项所述的ev，其中所述ev进一步装载有性货物，任选地，其中所述性货物为蛋白质、核酸、病毒、病毒基因组、抗原或小分子。8.根据权利要求7所述的ev，其中所述性货物选自由以下组成的组：核酸，任选地rna分子、dna分子或混合物、mrna、反义或剪接转换寡核苷酸、sirna、shrna、mirna、质粒dna(pdna)、超螺旋或非超螺旋的质粒或小圆圈；肽或蛋白质，任选地转运蛋白、酶、受体(任选地诱饵受体)、膜蛋白、细胞因子、抗原或新抗原、核糖核酸蛋白、核酸结合蛋白、抗体、纳米抗体或抗体片段；抗体-药物缀合物；小分子药物；基因编辑技术，任选地crispr-cas9、talen、巨型核酸酶；或基于囊泡的货物，任选地病毒，任选地aav或慢病毒。9.根据权利要求7或8所述的ev，其中所述性货物存在于所述ev的内部、所述ev的外部和/或所述ev的膜中。10.根据权利要求7至9中任一项所述的ev，其中所述性货物形成所述ev蛋白-abd融合蛋白的一部分。11.根据前述权利要求中任一项所述的ev，其中所述ev进一步包括靶向部分。12.根据权利要求11所述的ev，其中所述靶向部分形成所述abd融合蛋白的一部分。13.一种用于产生根据前述权利要求中任一项所述的ev的方法，其包括：(i)将至少一种编码abd-ev蛋白融合构建体的多核苷酸构建体引入到产生ev的细胞中；和(ii)在所述产生ev的细胞中表达所述构建体，从而产生包括存在于所述ev的表面上的abd的ev。14.一种药物组合物，其包括至少一种根据权利要求1至12中任一项所述的ev和药学上可接受的赋形剂或载剂。15.根据权利要求1至12中任一项所述的ev，和/或根据权利要求14所述的药物组合物，所述ev和/或药物组合物用于药物。

技术总结

本发明涉及细胞外囊泡(EV)，其中EV包括存在于EV的表面上的结构域，其改变此类EV的循环时间。此类EV展示改善的药代动力学，因此可用作剂。此类EV也可用于EV原料药的亲和纯化。化。化。

技术研发人员：

X

受保护的技术使用者：

医福斯有限公司

技术研发日：

2021.07.05

技术公布日：

2023/3/24