一种基于距离信号输出的DNA糖基化酶即时检测方法

一种基于距离信号输出的dna糖基化酶即时检测方法
技术领域
1.本发明属于分析检测领域，具体涉及一种基于距离信号输出的dna糖基化酶即时检测方法。

背景技术：

2.dna复制是通过模板与互补链的沃森-克里克碱基配对(a:t和g:c)并依赖聚合酶催化磷酸二酯键的形成实现的。dna产物的精准复制和序列的稳定保持对种族的延续至关重要。然而，dna容易受到内源性或外源性化学物质的影响使得碱基发生损伤。dna序列中胞嘧啶自发脱氨为尿嘧啶或在dna复制过程中dutp直接错误掺入在dna上产生尿嘧啶是最具代表性的一种损伤。细胞已经进化出了碱基切除修复(ber)通路用以修复损伤的碱基。其中尿嘧啶可诱导尿嘧啶dna糖基化酶(udg)在人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(ape)的协助下识别和切除dna上的尿嘧啶生成具有3'oh末端的dna，并启动进一步的dna修复过程。因此，udg在维持dna完整性和稳定性方面起到了非常重要的作用。udg水平异常不仅可导致尿嘧啶诱导的ber通路失调还与人类免疫缺陷、淋巴瘤、神经退行性疾病等各种疾病密切相关。目前常用的检测udg活性的方法有凝胶电泳法、比法、光电化学法、荧光法等。然而，这些方法存在着费时费力、仪器复杂、灵敏度差、探针设计昂贵复杂、或需要标记信号分子等问题。因此，迫切需要开发一种简单、便携、低成本，无需大型仪器，可视化检测的udg活性检测方法。

技术实现要素：

3.本发明为解决现有的技术问题，借助对dna糖基化酶响应的功能化dna水凝胶和纸分析器件，构建了一种便携、简单、低成本、灵敏、无需大型仪器的udg活性检测平台。为此，本发明采用的技术方案如下：
4.本发明提供了一种纸分析器件，包括纸片a、纸片b和纸片c；所述纸片a、纸片b和纸片c均包括亲水区和疏水区，所述纸片c包括相连接的中转区和显区，所述中转区和所述显区底部设有密封底衬；纸片a的亲水区、纸片b的亲水区与纸片c的中转区在垂直位置上相对应设置，纸片c的显区不被纸片a和纸片b遮挡；
5.所述纸片a的亲水区上负载功能化dna水凝胶，所述纸片b的亲水区上负载颜指示剂。
6.进一步地，所述功能化dna水凝胶包括dna糖基化酶可识别剪切的损伤碱基以及任意含有a，g，c，t的dna链。
7.进一步地，所述dna糖基化酶包括尿嘧啶dna糖基化酶(udg)或人单链选择性单功能尿嘧啶dna糖基化酶(hsmug)。
8.进一步地，所述颜指示剂包括溴酚蓝、甲基橙、甲基红或紫石蕊。
9.进一步地，所述亲水区被所述疏水区包围；所述纸片c也设有疏水区，纸片c的疏水区包围中转区和显区；所述显区为长方形，根据长方形内柱的长度对0-50u/ml浓度
范围内dna糖基化酶进行定量检测。
10.本发明还提供了一种基于距离信号输出的dna糖基化酶即时检测方法，进一步地，包括如下步骤：
11.(1)功能化dna水凝胶负载于纸分析器件纸片a的亲水区；颜指示剂负载于纸分析器件纸片b的亲水区；组装所述纸分析器件；
12.(2)将含有dna糖基化酶的缓冲液滴加到纸分析器件纸片a的亲水区上，dna糖基化酶使功能化dna水凝胶瓦解，缓冲液由重力作用和毛细管作用通过纸片a到达纸片b的亲水区；缓冲液携带纸片b上的颜指示剂由重力作用和毛细管作用达到纸片c的中转区，进而到达纸片c的显区，产生不同距离的柱，实现对dna糖基化酶的可视化定量检测。
13.更具体地包括：
14.步骤一：制备功能化dna水凝胶；
15.步骤二：水凝胶负载于纸分析器件纸片a的亲水区用以阻止缓冲液通过；
16.步骤三：单功能dna糖基化酶在人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(ape)协助下或者双功能dna糖基化酶直接作用刺激功能化dna水凝胶瓦解；
17.步骤四：不同浓度dna糖基化酶对功能化dna水凝胶瓦解程度不同，使得在纸分析器件中穿过纸片a流速变化的缓冲液可以携带纸片b上的颜指示剂在纸片c的显区中产生不同距离的柱实现对dna糖基化酶的可视化定量检测。
18.进一步地，所述功能化dna水凝胶可通过滚环扩增制备。
19.进一步地，所述滚环扩增的环状模板链是任意含有a，g，c，t的dna链。
20.进一步地，功能化dna水凝胶的功能化可通过在滚环扩增中使用除dntps(datp、dttp、dctp、dgtp)外可被聚合酶利用的、待检测dna糖基化酶可识别剪切的损伤碱基所对应的其他2'-脱氧核苷-5'-三磷酸三钠盐实现或滚环扩增制备出水凝胶后利用化学试剂处理使水凝胶上的碱基损伤成dna糖基化酶可识别剪切的损伤碱基。
21.进一步地，所述对应的其他2'-脱氧核苷-5'-三磷酸三钠盐包括2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸三钠盐(dutp)。
22.进一步地，所述滚环扩增的原料至少包括：以每100微升计，》10pmol的环状模板，》10pmol的引物，(5-10)u的phi29 dna聚合酶，(0.05-0.2)u焦磷酸酶(ppase)，》100μmol的dntps和》1μmol的dutp，终浓度为1
×
phi29 dna聚合酶缓冲液。滚环扩增时间》4h。
23.进一步地，纸分析器件纸片a和纸片b的亲水区的形状包括圆形，纸片c的中转区形状包括圆形，显区的形状包括长方形，三层的圆形在同一个垂直面上。
24.进一步地，dna糖基化酶使功能化dna水凝胶瓦解的时间为60-120min，所述缓冲液中包含5-10u ape。
25.本发明所述的检测方法仅用于获取作为中间结果的信息的方法，不作为直接得出疾病的诊断结果或健康状况的信息，该方法为非疾病的诊断方法。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
27.本发明设计的基于距离信号输出的dna糖基化酶即时检测方法具有以下优点：水凝胶制备过程简单不需要提前制备大量的dna原料也不需要复杂的序列设计，分子识别单元不需要额外的修饰；采用基于距离信号输出的纸分析器件，操作简单，便携，无需额外仪器；水凝胶制备和纸分析器件的构建过程成本低，特异性好，灵敏度高具有良好的实际应用
价值。
附图说明
28.图1为本发明工作原理图；图1a为功能化dna水凝胶检测udg的原理图，图1b为纸分析器件检测udg的成像示意图。
29.图2为本发明对udg的检测灵敏度图；图2a为纸分析器件检测udg的实物图，图2b为纸分析器件距离信号与udg浓度的关系图。
30.图3为本发明对udg的检测特异性图。
具体实施方式
31.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
32.表1：本发明中使用的核酸序列
[0033][0034]
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0035]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0036]
实施例1功能化dna水凝胶的制备
[0037]
用含20pmol的环状模板(seq id no.1)，20pmol的引物(seq id no.2)，5u phi 29dna聚合酶，0.1u焦磷酸酶，2mm dntps和0.2mm dutp的100μl终浓度为1
×
phi29 dna聚合酶缓冲液在30℃反应8h,65℃灭活phi29 dna聚合酶10min，得到尿嘧啶功能化的dna水凝胶并在4℃保存备用。
[0038]
实施例2纸分析器件的制备
[0039]
纸分析器件的图案由microsoftpowerpoint设计，并由xerox color qube 8570喷蜡打印机打印在whatman grade 1谱滤纸上，然后在120℃加热1min，让融化的蜡穿透纸张，形成疏水边界。切割组装成单个纸分析器件。每个器件包含三层。第一层纸片a和第二层纸片b包含直径为4mm的亲水性圆形图案，纸片a的圆形区域中加入10μl水凝胶，纸片b的圆形区域中加入10μl溴酚蓝。粘上密封底衬的纸片c由一个55mm
×
1mm的亲水长方形通道和与之相连的直径为4mm的亲水圆形图案组成。三层的圆形区域在垂直位置上相对应放置。30μl的缓冲溶液加入含水凝胶的纸片a后经垂直流动将溴酚蓝带到纸片c圆形中转区，并在长方形横向通道上产生不同距离的柱，可用肉眼观察并通过智能手机捕捉(图1)。
[0040]
实施例3udg灵敏度表征
[0041]
将30μl含3μl的10
×
udg缓冲液、5u ape和不同浓度的udg(0，6.4
×
10-4
，3.2
×
10-3
，1.6
×
10-2
，8
×
10-2
，0.4，2，10，50u/ml)的缓冲液加入到纸分析器件含水凝胶的纸片a上，在湿润环境中孵育80min后，即可在纸片c长方形通道中观察到随浓度影响的不同长度的紫柱，检测灵敏度达6.4
×
10-4
u/ml(图2)。利用该方法即可实现0-50u/ml浓度范围内udg的定量检测。
[0042]
实施例4udg特异性表征
[0043]
牛血清白蛋白(bsa)、细胞素c(cytc)和碱性磷酸酶(ciap)不能从dna底物中识别和去除尿嘧啶。8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶(fpg)是一种dna糖基化酶，它只能识别和去除dna中的氧化碱基损伤，而不能切割dna中的尿嘧啶。人单链选择性单功能尿嘧啶dna糖基化酶(hsmug)是udg家族3的一种糖基化酶，也能作用于含尿嘧啶的dna。将30μl含3μl的10
×
udg缓冲液、5u ape和含不同种类蛋白的缓冲液分别加入到纸分析器件含水凝胶的纸片a上(空白组不加入蛋白)，在湿润环境中孵育80min后，观察纸片c长方形通道中紫柱的长度。如图3所示，纸分析器件仅能检测到对尿嘧啶有响应的蛋白酶活性，而对没有尿嘧啶识别去除功能的蛋白酶则没有明显的信号。本发明所述方法具有良好的检测特异性。

技术特征：

1.一种纸分析器件，其特征在于，包括纸片a、纸片b和纸片c；所述纸片a、纸片b和纸片c均包括亲水区和疏水区，所述纸片c包括相连接的中转区和显区，所述中转区和所述显区底部设有密封底衬；纸片a的亲水区、纸片b的亲水区与纸片c的中转区在垂直位置上相对应设置，纸片c的显区不被纸片a和纸片b遮挡；所述纸片a的亲水区上负载功能化dna水凝胶，所述纸片b的亲水区上负载颜指示剂。2.根据权利要求1所述的一种纸分析器件，其特征在于，所述功能化dna水凝胶包括dna糖基化酶可识别剪切的损伤碱基以及任意含有a，g，c，t的dna链。3.根据权利要求2所述的一种纸分析器件，其特征在于，所述dna糖基化酶包括尿嘧啶dna糖基化酶udg或人单链选择性单功能尿嘧啶dna糖基化酶hsmug。4.根据权利要求1所述的一种纸分析器件，其特征在于，所述颜指示剂包括溴酚蓝、甲基橙、甲基红或紫石蕊。5.根据权利要求1所述的一种纸分析器件，其特征在于，所述亲水区被所述疏水区包围；所述纸片c也设有疏水区，纸片c的疏水区包围中转区和显区；所述显区为长方形，根据长方形内柱的长度对0-50u/ml浓度范围内dna糖基化酶进行定量检测。6.一种基于距离信号输出的dna糖基化酶即时检测方法，其特征在于，所述检测方法为非疾病的诊断方法，包括如下步骤：(1)功能化dna水凝胶负载于纸分析器件纸片a的亲水区；颜指示剂负载于纸分析器件纸片b的亲水区；组装所述纸分析器件；(2)将含有dna糖基化酶的缓冲液滴加到纸分析器件纸片a的亲水区上，dna糖基化酶使功能化dna水凝胶瓦解，缓冲液由重力作用和毛细管作用通过纸片a到达纸片b的亲水区；缓冲液携带纸片b上的颜指示剂由重力作用和毛细管作用达到纸片c的中转区，进而到达纸片c的显区，产生不同距离的柱，实现对dna糖基化酶的可视化定量检测。7.根据权利要求6所述的一种基于距离信号输出的dna糖基化酶即时检测方法，其特征在于，所述功能化dna水凝胶通过滚环扩增制备；所述滚环扩增的环状模板链是任意含有a，g，c，t的dna链。8.根据权利要求7所述的一种基于距离信号输出的dna糖基化酶即时检测方法，其特征在于，功能化dna水凝胶的功能化可通过在滚环扩增中使用除dntps外可被聚合酶利用的、待检测dna糖基化酶可识别剪切的损伤碱基所对应的其他2'-脱氧核苷-5'-三磷酸三钠盐实现或滚环扩增制备出水凝胶后利用化学试剂处理使水凝胶上的碱基损伤成dna糖基化酶可识别剪切的损伤碱基；所述dntps包括datp、dttp、dctp或dgtp。9.根据权利要求8所述的一种基于距离信号输出的dna糖基化酶即时检测方法，其特征在于，所述对应的其他2'-脱氧核苷-5'-三磷酸三钠盐包括2'-脱氧尿苷-5'-三磷酸三钠盐dutp。10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，dna糖基化酶使功能化dna水凝胶瓦解的时间为60-120min，所述缓冲液中包含5-10u ape。

技术总结

本发明公开了一种基于距离信号输出的DNA糖基化酶即时检测方法，属于分析检测领域。反应过程包括：(1)制备功能化DNA水凝胶；(2)水凝胶负载于纸分析器件纸片A的亲水区用以阻止缓冲液通过；(3)单功能DNA糖基化酶在人源脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE)协助下或者双功能DNA糖基化酶直接作用刺激水凝胶瓦解；(4)不同浓度DNA糖基化酶对水凝胶瓦解程度不同，使得在纸分析器件中穿过纸片A流速变化的缓冲液可以携带纸片B上的颜指示剂在纸片C中产生不同距离的柱实现对DNA糖基化酶的可视化检测。该方法具有简单、便携、低成本，无需大型仪器等分析性能，具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。