肽支架、其生产方法及其作为可溶性支持物的用途与流程

肽支架、其生产方法及其作为可溶性支持物的用途
发明领域
1.本发明涉及包含一系列脯氨酸(pro，p)和反应性氨基酸的官能化肽支架(peptidic scaffold)、其生产方法，以及其作为可溶性支持物在任何需要支持物的方法或可以使用支持物进行的方法中的用途，例如用于合成方法或分子生物学和生物化学测定。
2.发明背景
3.1984年诺贝尔化学奖授予罗伯特
·
布鲁斯
·
梅里菲尔德(robert bruce merrifield)，因为他开发了一种用于在固体支持物上进行化学蛋白合成的方法(merrifield,1963.j am chem soc.85(14):2149-54)。这一项技术给生物分子的化学合成领域和随后的酶合成领域(其中感兴趣的分子或其起始物与官能化的固体支持物结合并自其延伸)以及生化测定领域(诸如酶或亲和测定)带来了变革。正如梅里菲尔德所解释，“对于这种方法，原因是当生长的肽链牢固地附着于完全不溶的固体颗粒时，它所处的形式便于过滤和洗涤除去试剂和副产物”。
4.本领域通常使用各种类型的固体支持物。例如，官能化磁珠通常作为抗原、抗体、催化剂、蛋白和核酸的载体使用，并且具有可利用包括电磁体的自动化系统简单操作的优点。琼脂糖珠也常用于生物化学，用于结合各种生化测定中的抗体和其他蛋白。
5.此类固体支持物由于尺寸大而允许使用过滤系统(例如真空过滤)进行合成和生物化学测定，从而容易地过滤和洗涤或洗脱试剂和副产物。
6.然而，此类固体支持物并非没有缺陷。首先，它们可能与反应混合物的某些化合物发生非特异性相互作用，导致这些化合物在支持物上和在支持物附近聚集，并在反应混合物中形成不希望的聚集体。其次，固体支持物具有空间位阻，这阻碍了反应混合物中的大化合物(例如酶)到达更靠近支持物的支持物结合分子。
7.例如，在核酸的酶促合成领域，寡核苷酸引物作为起始物通常与固体支持物结合。然而，与作为起始物的游离寡核苷酸引物相比，使用这样结合至支持物的寡核苷酸引物作为起始物进行dna聚合的效率并不高；但最重要的是，仅有15-20％的合成寡核苷酸被最终回收，因为切割酶无法到达支持物附近的寡核苷酸并释放它们。因此，损失是巨大的。
8.面对这些问题，其他人提出在溶液中(即没有任何支持物)进行测定和合成反应。该技术解决了空间位阻的问题，但不利于使用例如真空过滤等过滤系统进行过滤和洗涤的便易性。此外，放弃支持物对于任何测定和合成都是不现实的——这也解释了其不受欢迎的原因。
9.因此，目前似乎没有一种方法是完全令人满意的，因此仍然需要能够以快速、简易且同时保持高效的方式进行测定和合成的替代方法。出于成本效益的考虑，还期望此类替代方法任凭用户重复使用。
10.在这里，本发明人令人惊讶地发现，包含聚赖氨酸/脯氨酸基序的肽支架可作为有效且可重复使用的可溶性支持物容易地用于实施测定和合成，同时还克服了现有手段和方法中发现的缺陷。
11.尽管本技术证明了这样的肽支架在核酸酶促合成方法中的优点，但对于本领域技
术人员来说很明显的是，这样的肽支架可用于任何可替代地使用固体支持物实施的测定和合成方法。

技术实现要素：

12.本发明涉及肽支架，其包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中：
[0013]“n”是2至20的整数，并且
[0014]
x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；更优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；甚至更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；并且
[0015]
x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)；
[0016]
其中所述肽支架利用与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团结合的至少一个核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸进行官能化。
[0017]
在一个实施方案中，所述至少一个核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸共价结合至所述至少一个赖氨酸残基的ε-氨基，任选地通过接头或间隔物进行结合。
[0018]
在一个实施方案中，肽支架进一步包含至少一个芳香族氨基酸，所述芳香族氨基酸选自氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)和组氨酸(his，h)，优选选自氨酸(trp，w)和酪氨酸(tyr，y)。
[0019]
在一个实施方案中，所述肽支架包含具有seq id no:3的(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，或具有seq id no:4的(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中“n”、x2、x3、x4和x5如上文所定义。
[0020]
在一个实施方案中，所述肽支架包含seq id no:5至22中任一项所示的氨基酸序列。
[0021]
在一个实施方案中，所述肽支架包含seq id no:24、25、48或49中任一项所示的氨基酸序列。
[0022]
在一个实施方案中，所述肽支架包含具有seq id no:26的(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，或具有seq id no:27的(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中“n”、x2、x3、x4和x5如上文所定义。
[0023]
本发明还涉及生产本发明的肽支架的方法，其包括以下步骤：
[0024]
a.产生包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列的肽，其中
[0025]“n”是2至20的整数；
[0026]
x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸
(glu，e)的反应性氨基酸；更优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；甚至更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；并且
[0027]
x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)；
[0028]
b.纯化步骤a中产生的肽；
[0029]
从而获得肽支架，
[0030]
c.将肽支架官能化，其中肽支架的官能化包括：
[0031]
(i)将所述肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团与核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸偶联，任选地通过接头或间隔物偶联；和
[0032]
(ii)任选地，在(i)之前、与(i)同时或在(i)之后，用肽基-脯氨酰基异构酶将所述肽支架的脯氨酸(pro)残基的脯氨酰基肽键异构化。
[0033]
在一个实施方案中，核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸或接头或间隔物包含能够直接或间接地与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团反应的蛋白连接基团。
[0034]
本发明还涉及本发明的肽支架作为可溶性支持物的用途。
[0035]
在一个实施方案中，作为可溶性支持物的用途是用在核酸合成方法中，优选用在核酸的液相合成方法中。
[0036]
在一个实施方案中，核酸合成方法是从头核酸合成方法、模板依赖性核酸合成方法或核酸组装方法。
[0037]
在一个实施方案中，作为可溶性支持物的用途是用在分子生物学和生物化学测定中。
[0038]
在一个实施方案中，分子生物学和生物化学测定是核酸杂交测定。
[0039]
本发明还涉及包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列的肽支架，作为有机分子合成方法中或分子生物学和生物化学测定中的可溶性支持物的用途，条件是分子生物学和生物化学测定不是或不包括细胞递送测定，其中：
[0040]“n”是2至20的整数；并且
[0041]
x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；更优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；甚至更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；并且
[0042]
x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)；
[0043]
其中所述肽支架利用与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团结合的至少一个有机分子进行官能化。
[0044]
在一个实施方案中，所述至少一个有机分子通过接头或间隔物共价结合至所述至少一个赖氨酸残基的ε-氨基。
[0045]
在一个实施方案中，肽支持物进一步包含至少一个芳香族氨基酸，所述芳香族氨基酸选自氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)和组氨酸(his，h)，优选选自氨酸(trp，w)和酪氨酸(tyr，y)。
[0046]
在一个实施方案中，所述肽支架包含具有seq id no:3的(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:4的(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中“n”、x2、x3、x4和x5如上文所定义。
[0047]
在一个实施方案中，所述肽支架包含seq id no:5至22中任一项所示的氨基酸序列，优选包含seq id no:24或seq id no:25的氨基酸序列。
[0048]
在一个实施方案中，所述肽支架包含具有seq id no:26的(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:27的(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中“n”、x2、x3、x4和x5如上文所定义。
[0049]
在一个实施方案中，有机分子合成方法是肽、碳水化合物或其缀合物的合成方法。
[0050]
本发明还涉及试剂盒，其包含：
[0051]-包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列的肽支架，其中
[0052]“n”是2至20的整数；
[0053]
x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；更优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；甚至更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；和
[0054]
x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)；
[0055]-核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸，其任选地结合至接头或间隔物；其中核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸或接头或间隔物包含能够直接或间接地与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团反应的蛋白连接基团；
[0056]-将核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸与肽支架偶联的说明。
[0057]
发明详述
[0058]
本发明涉及包含一系列脯氨酸(pro，p)和反应性氨基酸的肽支架。
[0059]
如本文所用，术语“反应性氨基酸”是指除脂族氨基酸之外的氨基酸残基，即包含反应性侧链基团的氨基酸残基。此类反应性氨基酸的实例包括但不限于赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)。
[0060]
因此，本发明涉及包含(lys-pro)或(pro-lys)氨基酸序列基序的肽支架。
[0061]
它还涉及包含(cys-pro)或(pro-cys)氨基酸序列基序的肽支架。
[0062]
它还涉及包含(ser-pro)或(pro-ser)氨基酸序列基序的肽支架。
[0063]
它还涉及包含(thr-pro)或(pro-thr)氨基酸序列基序的肽支架。
[0064]
它还涉及包含(tyr-pro)或(pro-tyr)氨基酸序列基序的肽支架。
[0065]
它还涉及包含(his-pro)或(pro-his)氨基酸序列基序的肽支架。
[0066]
它还涉及包含(arg-pro)或(pro-arg)氨基酸序列基序的肽支架。
[0067]
它还涉及包含(asp-pro)或(pro-asp)氨基酸序列基序的肽支架。
[0068]
它还涉及包含(glu-pro)或(pro-glu)氨基酸序列基序的肽支架。
[0069]
在一个实施方案中，所述肽支架包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中：
[0070]“n”是等于或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大数的整数，
[0071]
x1是反应性氨基酸，并且
[0072]
x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸。
[0073]
在一个实施方案中，“n”是2至20的整数。在一个实施方案中，“n”等于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。
[0074]
如本文所用，术语“脂族氨基酸”是指包含脂族侧链官能团的氨基酸。脂族氨基酸是非极性和疏水性的。脂族氨基酸的实例包括但不限于丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)。
[0075]
在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或选自包含以下或由以下组成的组：丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)。
[0076]
在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或选自包含以下或由以下组成的组：丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)和缬氨酸(val，v)。
[0077]
作为非极性的，脂肪族氨基酸是非反应性的，因此当被引入肽支架中可用以减少两个反应性氨基酸之间(例如，如下详述，两个官能化反应性氨基酸之间)的空间位阻。
[0078]
在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5中的至少一个不存在。
[0079]
在一个实施方案中，肽支架进一步包含至少一个芳香族氨基酸，例如1、2、3、4、5个或更多个芳香族氨基酸。
[0080]
如本文所用，术语“芳香族氨基酸”是指包括芳香环的氨基酸。芳香族氨基酸的实例包括但不限于氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)和组氨酸(his，h)。芳香族氨基酸的其他实例包括但不限于非编码的(或非蛋白性的)氨基酸甲状腺氨酸(thyroxine)、5-羟氨酸(5-hydroxytryptophan)和l-dopa。
[0081]
芳香族氨基酸以不同的程度吸收紫外(uv)光，因此当被引入肽支架时可用以监测例如其在溶液中的浓度。
[0082]
在一个实施方案中，肽支架进一步包含至少一个选自包含以下或由以下组成的组的芳香族氨基酸：氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)和组氨酸(his，h)，例如1、2、3、4、5个或更多个选自包含以下或由以下组成的组的芳香族氨基酸：氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)和组氨酸(his，h)。
[0083]
在一个实施方案中，肽支架进一步包含至少一个选自包含以下或由以下组成的组的芳香族氨基酸：氨酸(trp，w)和酪氨酸(tyr，y)，例如1、2、3、4、5个或更多个选自包含以下或由以下组成的组的芳香族氨基酸：氨酸(trp，w)和酪氨酸(tyr，y)。
[0084]
在肽支架包含多于1个芳香族氨基酸，例如至少2个芳香族氨基酸的一个实施方案中，所述至少两个芳香族氨基酸在序列中可以是连续的(即，其间没有非芳香族氨基酸)；或者可以被至少一个非芳香族氨基酸分隔开。
[0085]
如本文所用，术语“非芳香族氨基酸”是指那些不是氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)或组氨酸(his，h)的氨基酸；优选那些不是氨酸(trp，w)或酪氨酸(tyr，y)的氨基酸。
[0086]
在一个实施方案中，所述至少一个非芳香族氨基酸是脂族氨基酸。在一个实施方案中，所述至少一个非芳香族氨基酸是脯氨酸(pro，p)。
[0087]
在一个实施方案中，肽支架包含至少一个氨酸(trp，w)和至少一个酪氨酸(tyr，y)残基。在一个实施方案中，肽支架包含一个氨酸(trp，w)和一个酪氨酸(tyr，y)残基。
[0088]
在一个实施方案中，x1选自包含以下或由以下组成的组：赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)。
[0089]
在一个实施方案中，x1选自包含以下或由以下组成的组：赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)。
[0090]
在一个实施方案中，x1选自包含以下或由以下组成的组：赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)。
[0091]
在一个实施方案中，x1是赖氨酸(lys，k)。
[0092]
在一个实施方案中，肽支架包含具有seq id no:3的(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:4的(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中：
[0093]“n”是等于或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的数的整数，并且
[0094]
x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸。
[0095]
在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5可以彼此独立地在seq id no:3或seq id no:4的每个“n”重复中相同。在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5可以彼此独立地在seq id no:3或seq id no:4的至少两个连续的“n”重复中相同。
[0096]
在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5可以彼此独立地在seq id no:3或seq id no:4的每个“n”重复中不同。在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5可以彼此独立地在seq id no:3或seq id no:4的至少两个连续的“n”重复中不同。
[0097]
很明显，本公开涵盖了其中可以去除(lys-pro)或(pro-lys)氨基酸序列基序的第一和/或最后一个氨基酸的序列，即肽支架可以在n或c端包含脯氨酸和/或在n或c端包含赖氨酸。
[0098]
在一个实施方案中，至少一个芳香族氨基酸位于具有seq id no:3的(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:4的(pro-lys-x2-x3-x4-x5-)n氨基酸序列的n端或c端。
[0099]
在一个实施方案中，至少一个芳香族氨基酸，例如1、2、3、4或5个芳香族氨基酸，位于具有seq id no:3的(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:4的(pro-lys-x2-x3-x4-x5-)n氨基酸序列的n端。
[0100]
在一个实施方案中，至少一个芳香族氨基酸，例如1、2、3、4或5个芳香族氨基酸，位
于具有seq id no:3的(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:4的(pro-lys-x2-x3-x4-x5-)n氨基酸序列的c端。
[0101]
可选地或另外，至少一个芳香族氨基酸可以位于具有seq id no:3或seq id no:4的氨基酸序列中的两个(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)或(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)重复之间。
[0102]
可选地或另外，至少一个芳香族氨基酸可以位于具有seq id no:3或seq id no:4的氨基酸序列中的至少一个(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)或(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)重复内(即，在lys-pro、pro-lys、pro-x2、lys-x2、x
2-x3、x
3-x4和/或x
4-x5中的任一个之间)。
[0103]
在一个实施方案中，肽支架包含如下表1所示的氨基酸序列或由如下表1所示的氨基酸序列组成。
[0104]
表1
[0105]
(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)nseq id no:5(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)nseq id no:6pro-(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)nseq id no:7lys-(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)nseq id no:8(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n-lysseq id no:9(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n-proseq id no:10(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n-x6seq id no:11(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n-x6seq id no:12pro-(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n-x6seq id no:13lys-(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n-x6seq id no:14(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n-lys-x6seq id no:15(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n-pro-x6seq id no:16x
6-(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)nseq id no:17x
6-(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)nseq id no:18x
6-pro-(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)nseq id no:19x
6-lys-(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)nseq id no:20x
6-(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n-lysseq id no:21x
6-(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n-proseq id no:22
[0106]
其中：
[0107]
其中，“n”如上文所定义；
[0108]
x2、x3、x4和x5如上文所定义；
[0109]
x6对应于氨基酸序列seq id no:23(x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16-x
17
)；
[0110]
x7、x9、x
11
、x
13
、x
15
和x
17
彼此独立地为不存在或为非芳香族氨基酸；例如脂族氨基酸；例如脯氨酸(pro，p)；并且
[0111]
x8、x
10
、x
12
、x
14
和x
16
彼此独立地为不存在或为芳香族氨基酸，例如氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)或组氨酸(his，h)，例如氨酸(trp，w)或酪氨酸(tyr，y)。
[0112]
在示例性实施方案中，肽支架包含氨基酸序列pkpkpkpkpkpkpkpkpypwp(seq id no:24)或由其组成。
[0113]
在示例性实施方案中，肽支架包含氨基酸序列akpgkplkpakpgkplkpgkpypwp(seq id no:25)或由其组成。
[0114]
在示例性实施方案中，肽支架包含氨基酸序列apkapkapkapkapkapkapkwpw(seq id no:48)或由其组成。
[0115]
在示例性实施方案中，肽支架包含氨基酸序列apkapkapkapkapkapkapkapkapkapkapkapkwpw(seq id no:49)或由其组成。
[0116]
在一个实施方案中，x1是半胱氨酸(cys，c)。
[0117]
在一个实施方案中，肽支架包含具有seq id no:26的(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:27的(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中：
[0118]“n”是等于或大于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的数的整数，并且
[0119]
x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸。
[0120]
在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5可以彼此独立地在seq id no:26或seq id no:27的每个“n”重复中相同。在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5可以彼此独立地在seq id no:26或seq id no:27的至少两个连续的“n”重复中相同。
[0121]
在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5可以彼此独立地在seq id no:26或seq id no:27的每个“n”重复中不同。在一个实施方案中，x2、x3、x4和x5可以彼此独立地在seq id no:26或seq id no:27的至少两个连续的“n”重复中不同。
[0122]
很明显，本公开涵盖了其中可以去除(lys-pro)或(pro-lys)氨基酸序列基序的第一和/或最后一个氨基酸的序列，即肽支架可以在n或c端包含脯氨酸和/或在n或c端包含赖氨酸。
[0123]
在一个实施方案中，至少一个芳香族氨基酸位于具有seq id no:26的(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:27的(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列的n端或c端。
[0124]
在一个实施方案中，至少一个芳香族氨基酸，例如1、2、3、4或5个芳香族氨基酸，位于具有seq id no:26的(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:27的(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列的n端。
[0125]
在一个实施方案中，至少一个芳香族氨基酸，例如1、2、3、4或5个芳香族氨基酸，位于具有seq id no:26的(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:27的(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列的c端。
[0126]
可选地或另外，至少一个芳香族氨基酸可以位于具有seq id no:26或seq id no:27的氨基酸序列中的两个(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)或(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)重复之间。
[0127]
可选地或另外，至少一个芳香族氨基酸可以位于具有seq id no:26或seq id no:27的氨基酸序列中的至少一个(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)或(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)重复内(即，在cys-pro、pro-cys、pro-x2、cys-x2、x
2-x3、x
3-x4和/或x
4-x5中的任一个之间)。
[0128]
在一个实施方案中，肽支架包含如下表2所示的氨基酸序列或由其组成。
[0129]
表2
[0130][0131][0132]
其中：
[0133]“n”如上文所定义；
[0134]
x2、x3、x4和x5如上文所定义；
[0135]
x6对应于氨基酸序列seq id no:23(x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16-x
17
)；
[0136]
x7、x9、x
11
、x
13
、x
15
和x
17
彼此独立地为不存在或为非芳香族氨基酸，例如脂族氨基酸，例如脯氨酸(pro，p)；并且
[0137]
x8、x
10
、x
12
、x
14
和x
16
彼此独立地为不存在或为芳香族氨基酸，例如氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)或组氨酸(his，h)，例如氨酸(trp，w)或酪氨酸(tyr，y)。
[0138]
在一个实施方案中，肽支架是线性的。
[0139]
在一个实施方案中，肽支架是环化的。
[0140]
在一个实施方案中，肽支架在其n末端氨基酸的α-氨基上、在其c末端氨基酸的α-羧酸基团上或前述两者上包含保护基团。
[0141]
特别地，此类保护基团可以增强肽支架的稳定性和/或溶解度，特别地，保护基团可以提高肽支架的蛋白酶稳定性。
[0142]
例如，疏水基团如乙酰基、丹磺酰基(dansyl)、叔丁氧基羰基或9-芴甲氧基羰基可以添加至n末端氨基酸的α-氨基上。此外，这些疏水基团或叔丁基、酰胺基或对硝基苄基酯可以添加至c末端氨基酸的α-羧酸基团上。
[0143]
在一个实施方案中，肽支架在n末端被乙酰化，在c末端被酰胺化，或前述两者。
[0144]
引入此类保护基团的技术是本领域公知的。
[0145]
在一个实施方案中，肽支架在n端和/或c端包含亲和标签。
[0146]
如本文所用，术语“亲和标签”是指与本发明的肽支架共价连接的配体或化学基团，其能够与“亲和配偶体”相互作用，以便通过亲和纯化或下拉纯化(pull-down purification)从溶液中提取或纯化。通常，亲和标签能够与其亲和配偶体形成特异性的结合相互作用，即，比亲和配偶体和样品中存在的任何其他化学物质之间可能发生的任何结合相互作用更强的结合相互作用。
[0147]
亲和标签/亲和配偶体配对物的实例包括但不限于白蛋白结合蛋白(abp)/白蛋白、生物素-羧基载体蛋白(bccp)/(链霉)亲和素、钙调素结合肽(cbp)/钙调素、氯霉素乙酰转移酶(cat)/氯霉素、纤维素结合结构域(cbp)/纤维素、几丁质结合结构域(cbd)/几丁质、胆碱结合结构域(cb)/胆碱、二氢叶酸还原酶(dhfr)/甲氨蝶呤、半乳糖结合蛋白(gbp)/半乳糖、谷胱甘肽s-转移酶(gst)/谷胱甘肽、/halolink
tm
、组氨酸亲和标签(hat)/二价阳离子(ni
2+
、co
2+
、cu
2+
或zn
2+
)、麦芽糖结合蛋白(mbp)/直链淀粉、多组氨酸(his-标签)/二价阳离子(ni
2+
、co
2+
、cu
2+
或zn
2+
)、s-标签/rnase a的s片段、链霉亲和素结合肽(sbp)/链霉亲和素、链霉亲和蛋白/生物素、小泛素样修饰物(sumo)/镍(ii)阳离子和硫氧还蛋白(trx)/氧化苯砷(phenylarsinine oxide)。
[0148]
此外，亲和配偶体可以是针对亲和标签的抗体。在这种情况下，亲和标签可以选自碱性磷酸酶(ap)、au1表位、au5表位、噬菌体t7表位(t7-标签)、蓝舌病毒标签(b-标签)、e2表位、flag表位、glu-glu(ee-标签)、人流感血凝素(ha)、hsv表位、kt3表位、myc表位、蛋白c、s1-标签、葡萄球菌蛋白a(蛋白a)、t7表位、trpe和vsv-g。
[0149]
亲和标签的使用可尤其适合于纯化肽支架，或者在使用肽支架之前(即，在生产之后)，也可以在使用肽支架之后(用于回收和再利用目的)。
[0150]
根据本发明，肽支架被官能化。
[0151]“官能化”表示肽支架包含可与有机分子偶联的至少一个反应性侧链基团。“反应性侧链基团”包括例如赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)氨基酸残基的侧链基团，即氨基、巯基、羟基、咪唑基、胍基或羧酸基基团。术语“官能化”还涵盖了包含至少一个与其结合的生物分子的肽支架。
[0152]
如本文所用，术语“生物分子”是指作为活生物体的一部分或来自活生物体的任何有机分子。生物分子的实例包括但不限于核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、氨基酸残基、肽、多肽、蛋白、单糖、二糖、寡糖、多糖等。
[0153]
在一个实施方案中，生物分子与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团结合，例如与具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的至少一个赖氨酸(lys)残基的
ε-氨基结合，或与具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的至少一个半胱氨酸(cys)残基的巯基结合。
[0154]
在一个实施方案中，生物分子与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团共价结合，例如与具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的至少一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基共价结合，或与具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的至少一个半胱氨酸(cys)残基的巯基共价结合。
[0155]
在一个实施方案中，生物分子与肽支架的每一个反应性氨基酸的反应性侧链基团结合，例如与具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的每一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基结合，或与具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的每一个半胱氨酸(cys)残基的巯基结合。
[0156]
在一个实施方案中，生物分子与肽支架的每一个反应性氨基酸的反应性侧链基团共价结合，例如与具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的每一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基共价结合，或与具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的每一个半胱氨酸(cys)残基的巯基共价结合。
[0157]
在一个实施方案中，与肽支架的每一个反应性氨基酸的反应性侧链基团结合，例如与具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的每一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基结合，或与具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的每一个半胱氨酸(cys)残基的巯基结合的生物分子是彼此相同的。
[0158]
在一个实施方案中，与肽支架的每一个反应性氨基酸的反应性侧链基团结合，例如与具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的每一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基结合，或与具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的每一个半胱氨酸(cys)残基的巯基结合的生物分子是彼此不同的，即至少两个与肽支架结合的生物分子是不同的。
[0159]
在一个实施方案中，生物分子是核酸或其片段，例如核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸。
[0160]
在一个实施方案中，生物分子是核苷酸。如本文所用，术语“核苷酸”是指包含核苷和1至3个磷酸基团的分子。它们是dna和rna的构建块。核苷酸的实例包括但不限于核糖核苷酸(例如一磷酸腺苷、二磷酸腺苷或三磷酸腺苷[amp、adp、atp]，一磷酸鸟苷、二磷酸鸟苷或三磷酸鸟苷[gmp，gdp，gtp]，一磷酸尿苷、二磷酸尿苷或三磷酸尿苷[ump、udp、utp]，和一磷酸胞苷、二磷酸胞苷或三磷酸胞苷[cmp、cdp、ctp])；脱氧核糖核苷酸(例如一磷酸脱氧腺苷、二磷酸脱氧腺苷或三磷酸脱氧腺苷[damp、dadp、datp]，一磷酸脱氧鸟苷、二磷酸脱氧鸟苷或三磷酸脱氧鸟苷[dgmp、dgdp、dgtp]，一磷酸脱氧胸苷、二磷酸脱氧胸苷或三磷酸脱氧胸苷[dtmp、dtdp、dttp]，和一磷酸脱氧胞苷、二磷酸脱氧胞苷或三磷酸脱氧胞苷[dcmp、dcdp、dctp])；和环状核苷酸(例如一磷酸环腺苷[camp]，一磷酸环鸟苷[cgmp]，一磷酸环二鸟苷[c-di-gmp]，一磷酸环二腺苷[c-di-amp]和二磷酸环腺苷核糖[cadpr])。
[0161]
在一个实施方案中，生物分子是寡核苷酸。如本文所用，术语“寡核苷酸”是指核苷酸单体的长度短的单链聚合物。寡核苷酸通常包含2个至约100个核苷酸单体。该术语是指上文所定义的形成核苷酸聚合物的所有核苷酸组合，例如形成dna寡核苷酸的脱氧核糖核苷酸组合、形成rna寡核苷酸的核糖核苷酸组合或形成混合的dna/rna寡核苷酸的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者的组合。
[0162]
在一个实施方案中，生物分子是多核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”是指核苷酸单体的长度长的单链聚合物。多核苷酸通常包含超过约100个核苷酸单体。该术语是指如上文所定义的形成核苷酸聚合物的所有核苷酸组合，例如形成dna多核苷酸的脱氧核糖核苷酸组合、形成rna多核苷酸的核糖核苷酸组合或形成混合的dna/rna多核苷酸的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸两者的组合。
[0163]
在一个实施方案中，生物分子是已知序列的核酸或其片段。在一个实施方案中，生物分子是未知序列的核酸或其片段。
[0164]
例如，知晓生物分子的核酸序列可能是有利的，例如，用于在捕获测定中针对感兴趣的核酸序列进行杂交，用于核酸合成方法后的pcr启动和扩增，用于条码化目的等。
[0165]
在一个实施方案中，生物分子是包含2至50个核苷酸的寡核苷酸。
[0166]
在一个实施方案中，生物分子是包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸的寡核苷酸。
[0167]
在一个实施方案中，生物分子是蛋白或其片段，例如氨基酸、肽或多肽。
[0168]
在一个实施方案中，蛋白或其片段是亲和标签。上文已经描述了亲和标签的实例，并经适当修改后适用于此。
[0169]
在一个实施方案中，蛋白或其片段是酶或其生物活性片段。在一个实施方案中，酶可以是用于有机分子的酶促合成方法中的任何酶。在一个实施方案中，酶可以是用于核酸的酶促合成方法中的任何酶。此类酶的实例包括但不限于dna依赖性dna聚合酶、dna依赖性rna聚合酶、dna引发酶、末端脱氧核苷酸转移酶和dna连接酶。
[0170]
在一个实施方案中，生物分子是碳水化合物或其片段，例如单糖、二糖、寡糖或多糖。
[0171]
在一个实施方案中，肽支架进一步包含接头或间隔物，其与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团结合，例如与具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的至少一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基结合，或与具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的至少一个半胱氨酸(cys)残基的巯基结合。
[0172]
如本文所用，术语“接头”或“间隔物”可互换使用，并且是指可共价或非共价连接两个其他部分(例如，肽支架和生物分子)的化学部分，例如通过离子键或氢键或范德华相互作用。
[0173]
在一个实施方案中，接头或间隔物被官能化。上文对官能化肽支架的描述经适当修改后适用于官能化的接头或间隔物。
[0174]
可能需要接头或间隔物，以延伸肽支架的反应性侧链的长度并由此减少两个反应性氨基酸之间的空间位阻；和/或以修饰肽支架的反应性侧链基团的性质，例如用另一个反应性基团例如但不限于硫基、羟基、咪唑基、胍基或羧酸基替代赖氨酸残基的伯胺，这取决于本领域技术人员选择的偶联化学。
[0175]
在一个实施方案中，接头或间隔物具有50个原子或更少、优选40个原子或更少、更优选30个原子或更少、甚至更优选20个原子或更少的主链(backbone)。
[0176]
在一个实施方案中，接头或间隔物是连接两个部分的共价键。在一个实施方案中，接头或间隔物是长度包含1至20个原子的链，例如长度约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14、15、16、17、18、19或20个原子的链。
[0177]
在一个实施方案中，接头或间隔物可以是直链的、支链的、环状的或单个原子。
[0178]
在一个实施方案中，接头或间隔物主链可以包含碳原子或由碳原子组成；或者可选地可以包含碳原子和杂原子的组合或由碳原子和杂原子的组合组成。
[0179]
如本文所用，术语“杂原子”是指不是碳或氢的任何原子。杂原子的实例包括但不限于氮(n)、氧(o)、硫(s)、磷(p)、氯(cl)、溴(br)、碘(i)、锂(li)和镁(mg)。优选地，杂原子选自包含以下或由以下组成的组：氮(n)、氧(o)、硫(s)、磷(p)及其组合。
[0180]
在一个实施方案中，接头或间隔物主链可以包含以下或由以下组成：酰基、酰基氨基(acylamino)、酰氧基、烷氧基、烷氧羰基、烷氧羰基氨基、烷基、三卤代烷基、烯基、炔基、氨基、酰胺基(amido)、亚氨基、氨基羰基、氨基羰基氨基、氨基羰氧基、芳基、芳氧基、叠氮基、重氮基、生物素、羧基、羰基、氰基、异氰酸酯、异硫氰酸酯、环烷基、胍基、卤素、杂环基、杂环基氧基、羟基、酮基、硝基、亚硝基、氧代、硫基、硫醚基、硫代烷氧基、硫代芳氧基、硫酮基、硫醇基、磺酸酯、亚磺酸酯、亚磷酸酯、膦酸酯、烷基-s(o)-、芳基-s(o)-、烷基-s(o)2和/或芳基-s(o)2基团。
[0181]
在一个实施方案中，接头或间隔物的主链原子之间的键可以是饱和的或不饱和的。在一个实施方案中，接头或间隔物可以包含至多三个不饱和键，例如1、2或3个。
[0182]
为了清楚起见，通过计数由接头或间隔物连接的两个部分之间的最小共价连接原子数(不包括两个连接部分本身的原子)，来计算接头或间隔物主链中的原子数。当接头或间隔物包括环状部分时，计数环状部分的环周围的最短路径，从而计算连接两个部分的最小可能原子数。
[0183]
在一个实施方案中，接头或间隔物可以包括一个或多个取代基，例如烷基、芳基或烯基。
[0184]
在一个实施方案中，接头或间隔物可以包括但不限于低聚(乙二醇)、醚、硫醚、叔胺和/或烷基，其可以是直链或支链的，例如甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)等。
[0185]
在一个实施方案中，接头或间隔物的主链可以包括环状基团，例如芳基、杂环或环烷基，其中环状基团的2个或更多个原子包含在主链中。
[0186]
在一个实施方案中，接头或间隔物是可裂解的。在一个实施方案中，接头或间隔物是不可裂解的。
[0187]
如本文所用，术语“可裂解的”在指接头或间隔物时表示所述接头或间隔物可以选择性地被裂解以产生两种产物。将合适的裂解条件应用于含有被所述裂解条件所裂解的可裂解接头或间隔物的分子时会产生两种“裂解产物”。优选地，可裂解接头或间隔物在生理条件下是稳定的，直到其与能够裂解可裂解接头和间隔物的试剂接触。
[0188]
在一个实施方案中，肽支架与固体支持物结合。在一个实施方案中，肽支架共价结合至固体支持物。
[0189]
可用作固体支持物的示例性材料包括但不限于丙烯酸、碳(例如，石墨、碳纤维)、纤维素(例如，醋酸纤维素)、陶瓷、受控孔玻璃、交联多糖(例如，琼脂糖、sepharose
tm
或藻酸盐)、凝胶、玻璃(例如，改性玻璃或官能化玻璃)、金(例如，原子级光滑au(111))、石墨、无机玻璃、无机聚合物、乳胶、金属氧化物(例如，sio2、tio2、不锈钢)、类金属、金属(例如，原子级
光滑au(111))、云母、硫化钼、纳米材料(例如，高定向热解石墨(hopg)纳米片)、硝化纤维、nylon
tm
、光纤束、有机聚合物、纸、塑料、聚丙烯酰吗啉、聚(4-甲基丁烯)、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(丁酸乙烯酯)、聚丁烯、聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚乙烯、聚甲醛、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、多糖、聚苯乙烯、聚氨酯、聚偏二氟乙烯(pvdf)、石英、人造丝、树脂、橡胶、半导体材料、二氧化硅、硅(例如，表面氧化的硅)、硫化物和teflon
tm
。
[0190]
在一个实施方案中，固体支持物可包括磁芯，例如铁磁性或超顺磁性芯。
[0191]
本领域技术人员熟知将肽(例如肽支架)共价连接到固体支持物上的技术。
[0192]
本发明还涉及生产本发明的肽支架的方法。
[0193]
在一个实施方案中，生产肽支架的方法包括以下步骤：
[0194]
a.如上所述，产生包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列的肽；任选地，如上所述，其中所述肽进一步包含至少一个芳香族氨基酸；和
[0195]
b.纯化合成的肽；
[0196]
从而获得肽支架。
[0197]
生产肽的手段和方法是本领域技术人员熟知的。例如，生产肽的步骤可以通过固相合成、通过溶液相合成(solution-phase synthesis)、通过液相合成(liquid-phase synthesis)或通过在细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞中的重组表达来进行。通常，短于八个氨基酸残基的肽通过溶液相合成来更经济地制备，而大于八个氨基酸残基的肽通常通过固相合成生产。关于肽合成的综述，参见例如benoiton,2006.chemistry of peptide synthesis(1
st ed.).boca raton:crc press。
[0198]
纯化肽的手段和方法是本领域技术人员熟知的。此类方法的实例包括但不限于反相(rp)-高效液相谱(hplc)谱法、快速谱法(flash chromatography)、亲和谱法、离子交换谱法、疏水相互作用谱法、凝胶过滤谱法、尺寸排阻谱法、亲水相互作用谱法。特别地，当肽支架包含如上所述的亲和标签时，其可通过亲和谱或下拉法纯化。
[0199]
关于肽纯化的综述，参见例如aguilar,2004.hplc of peptides and proteins:methods and protocols(vol.251).totowa,nj:humana press。
[0200]
在一个实施方案中，生产肽支架的方法包括将肽支架官能化的步骤。
[0201]“官能化”(functionalizing或functionalization)表示将肽支架的至少一个反应性侧链基团与有机分子偶联，所述有机分子例如上文所定义的接头或间隔物和/或生物分子。
[0202]
在一个实施方案中，将肽支架官能化的步骤包括将肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团与有机分子偶联，优选与接头或间隔物和/或生物分子偶联，例如，将具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的至少一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基或将具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的至少一个半胱氨酸(cys)残基的巯基与有机分子偶联，优选与接头或间隔物和/或生物分子偶联。
[0203]
因此，肽支架的官能化可包括以下或由以下组成：
[0204]-将肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团与接头或间隔物偶联，然后将所述接头或间隔物与生物分子偶联；或
[0205]-将肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团与生物分子偶联；或
bioconjugate techniques(3
rd ed),elsevier)在“1.amine reactions”节的1.1至1.16.小节(pp.229-240)详述了用包含氨基反应性蛋白连接基团的接头或间隔物将肽支架官能化的方法和反应。该节内容通过引用并入本文。
[0217]
在一个实施方案中，蛋白连接基团是巯基反应性的和/或能够与肽支架(例如具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架)的至少一个半胱氨酸(cys)残基的巯基反应，从而将接头或间隔物与肽支架缀合。
[0218]
此类巯基反应性蛋白连接基团的实例包括但不限于卤代乙酰基、烷基卤化物、马来酰亚胺、氮丙啶、芳基卤化物、吡啶基二硫酸酯、2,2'-二吡啶基二硫化物、4,4'-二吡啶二硫化物、tnb-硫醇、埃尔曼试剂(ellman’s reagent)、过氧化物、乙烯基砜、金属表面、苯基硫酯、顺铂和活化双键。
[0219]
hermanson,2013.chapter 3:the reactions of bioconjugation(in bioconjugate techniques(3
rd ed),elsevier)在“2.thiol reactions”节的2.1至2.10小节(pp.240-246)详述了用包含巯基反应性蛋白连接基团的接头或间隔物将肽支架官能化的方法和反应。该节内容通过引用并入本文。
[0220]
当肽支架与接头或间隔物偶联时，生产肽支架的方法进一步包括用生物分子将接头或间隔物官能化的步骤，如上文所述。
[0221]
在这种情况下，生物分子包含化学部分，所述化学部分能够在水性条件下自发地或在通过与刺激物接触而活化之后，与接头或间隔物的可接近的化学部分反应，以产生与接头或间隔物的共价连接。这样的化学部分可以天然存在于生物分子上，或者在偶联之前使用本领域公知的技术添加至生物分子上。
[0222]
能够与接头或间隔物的可接近的化学部分反应的化学部分的性质将取决于接头或间隔物本身的可接近的化学部分。
[0223]
化学部分的实例以及将其用于偶联反应的方法描述在hermanson,2013.chapter 3:the reactions of bioconjugation.in bioconjugate techniques(3
rd ed.,229-258).elsevier，其内容通过引用并入本文。
[0224]
或者，生产肽支架的方法包括用如上文所定义的生物分子(即，没有间隔物或接头)将肽支架官能化的步骤。
[0225]
在一个实施方案中，用生物分子将肽支架官能化的步骤包括将生物分子偶联至肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团，例如偶联至具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的至少一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基，或偶联至具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的至少一个半胱氨酸(cys)残基的巯基。在一个实施方案中，用生物分子将肽支架官能化的步骤包括将生物分子共价偶联至肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团，例如共价偶联至具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的至少一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基，或共价偶联至具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的至少一个半胱氨酸(cys)残基的巯基。
[0226]
在一个实施方案中，生物分子包含蛋白连接基团——如上文所定义，以允许与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团偶联，例如，允许与具有seq id no:3或seq id no:4的肽支架的至少一个赖氨酸(lys)残基中的ε-氨基偶联，或允许与具有seq id no:26或seq id no:27的肽支架的至少一个半胱氨酸(cys)残基的巯基偶联。蛋白连接基团
no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列的肽，如上文所述；任选地，其中所述肽进一步包含至少一个芳香族氨基酸，如上文所述；
[0240]
b.纯化步骤a中产生的肽；
[0241]
从而获得肽支架，
[0242]
c.将肽支架官能化，其中肽支架的官能化包括：
[0243]
(i)将所述肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团与有机分子偶联，优先地与接头或间隔物和/或生物分子偶联，如上文所述；和
[0244]
(ii)任选地，在(i)之前、与(i)同时或在(i)之后，用肽基-脯氨酰基异构酶将所述肽支架的脯氨酸(pro)残基的脯氨酰基肽键异构化，如上文所述。
[0245]
在一个实施方案中，步骤a中的肽包含如seq id no:3或seq id no:4所示的氨基酸序列或由如seq id no:3或seq id no:4所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0246]
在一个实施方案中，步骤a中的肽包含如seq id no:5至seq id no:22中任一项所示的氨基酸序列或由如seq id no:5至seq id no:22中任一项所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0247]
在一个实施方案中，步骤a中的肽包含如seq id no:26或seq id no:27所示的氨基酸序列或由如seq id no:26或seq id no:27所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0248]
在一个实施方案中，步骤a中的肽包含如seq id no:28至seq id no:45中任一项所示的氨基酸序列或由如seq id no:28至seq id no:45中任一项所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0249]
在一个实施方案中，步骤a中的肽包含如seq id no:24所示的氨基酸序列或由如seq id no:24所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0250]
在一个实施方案中，步骤a中的肽包含如seq id no:25所示的氨基酸序列或由如seq id no:25所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0251]
在一个实施方案中，步骤a中的肽包含如seq id no:48所示的氨基酸序列或由如seq id no:48所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0252]
在一个实施方案中，步骤a中的肽包含如seq id no:49所示的氨基酸序列或由如seq id no:49所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0253]
本发明还涉及本发明的肽支架作为可溶性支持物的用途。
[0254]
在一个实施方案中，肽支架包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列，如上文所述。
[0255]
在一个实施方案中，肽支架进一步包含至少一个芳香族氨基酸，如上文所述。
[0256]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:3或seq id no:4所示的氨基酸序列或由如seq id no:3或seq id no:4所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0257]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:5至seq id no:22中任一项所示的氨基酸序列或由如seq id no:5至seq id no:22中任一项所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0258]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:26或seq id no:27所示的氨基酸序列或由如seq id no:26或seq id no:27所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0259]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:28至seq id no:45中任一项所示的
氨基酸序列或由如seq id no:28至seq id no:45中任一项所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0260]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:24所示的氨基酸序列或由如seq id no:24所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0261]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:25所示的氨基酸序列或由如seq id no:25所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0262]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:48所示的氨基酸序列或由如seq id no:48所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0263]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:49所示的氨基酸序列或由如seq id no:49所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0264]
在一个实施方案中，肽支架被官能化，如上文所述。
[0265]
在一个实施方案中，肽支架用至少一种生物分子官能化，如上文所述。
[0266]
在一个实施方案中，肽支架进一步包括接头或间隔物，所述接头或间隔物结合至所述肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团，例如结合至所述肽支架的至少一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基或结合至所述肽支架的至少一个半胱氨酸(cys)残基的巯基，如上文所述。
[0267]
在一个实施方案中，本发明的肽支架可以在需要支持物(例如，固体支持物)的方法或可以使用支持物(例如，固体支持物)进行的任何方法中作为可溶性支持物使用。
[0268]
在一个实施方案中，本发明的肽支架可以在有机分子合成方法中作为可溶性支持物使用。
[0269]
可以使用本发明的肽支架的有机分子合成方法的实例包括但不限于液相合成。
[0270]
术语“液相合成”是指为制备单个有机分子、分子相同的有机分子库或分子不同的有机分子库而进行的一个或一系列化学或酶促反应，其中所述化学或酶促反应在溶液中于可溶性支持物上顺序或循环进行。液相合成的核心特征在于，它通过使用可溶性支持物如本发明的肽支架，将较少支持物的合成提供的优点与固相合成提供的优点相结合。液相合成可用于生产有机分子，例如生物分子，包括肽、核酸分子(包括dna、rna及其混合物)、碳水化合物及其缀合物；但也可用于合成任何有机分子，其亦在溶液中或固体支持物上合成。
[0271]
在一个实施方案中，液相合成方法包括从头(或不依赖模板的)合成、模板依赖性合成和核酸组装。
[0272]
如本文所用，术语“从头合成”是指通过反复连接有机分子构建块(building block)直到获得所需的聚合有机分子来合成任意长度的有机分子的方法。从头合成方法适用于任何类型的聚合有机分子，包括肽、核酸分子、碳水化合物及其缀合物。在从头合成中，新合成的有机分子的序列不受任何模板的影响。
[0273]
在从头合成(即，无模板)的情况下，所述方法通常包括以下步骤——尽管这些步骤中的一步或多步可以根据要合成的有机分子进行修改或调整，且这对于本领域技术人员来说是显而易见的：
[0274]
(a)提供官能化的支持物，任选地用充当合成起始物的生物分子官能化；
[0275]
(b)使所述官能化的支持物与至少一个包含保护基团的有机分子构建块在适合于将所述有机分子构建块与官能化支持物(任选地用充当合成起始物的生物分子官能化)偶
联的条件下接触，从而获得受保护的偶联产物；
[0276]
(c)洗涤过量的所述受保护的有机分子构建块；
[0277]
(d)使所述官能化的载体与至少一种脱保护试剂在适合于从受保护的偶联产物中去除保护基团的条件下接触，由此完成聚合有机分子的液相合成的一个循环；
[0278]
(e)重复步骤(b)至(d)，直到获得所需的聚合有机分子。
[0279]
应当理解，术语“有机分子构建块”是指任何有机分子，其在与其他有机分子(例如，在液相合成中)顺序或循环偶联时将形成相应的聚合有机分子。
[0280]
通常，sps中的有机分子构建块可包括天然或合成的构建块，例如氨基酸、核苷酸、核苷、单糖及其衍生物或类似物。然而，如本文所用，术语“有机分子构建块”可进一步包括二聚体、三聚体等。
[0281]
在一个实施方案中，有机分子构建块选自包含以下或由以下组成的组：氨基酸、肽、核苷酸、核苷和糖。
[0282]
在一个实施方案中，受保护的有机分子构建块选自包含以下或由以下组成的组：n-受保护的氨基酸、n-受保护的肽、o-受保护的核苷酸、o-受保护的核苷和o-受保护的糖。
[0283]
还应理解的是，术语“聚合有机分子”是指可以在与有机分子构建块(例如，在液相合成中)顺序或循环偶联时形成的任何有机分子。聚合有机分子的性质取决于有机分子构建块的特性。通常，在sps中制备的聚合有机分子可以包括生物分子，例如肽、多肽、寡核苷酸、多核苷酸、寡糖和多糖。还包括其缀合物，例如肽-寡核苷酸缀合物、肽-多糖缀合物和寡核苷酸-寡糖缀合物等。
[0284]
如本文所用，术语“模板依赖性合成”通常应用于核酸的合成，并且是指涉及合成与感兴趣的模板链互补的核酸链的方法。在模板依赖性合成中，新合成的核酸链的序列由与感兴趣的模板链的互补性碱基配对决定。
[0285]
在模板依赖性合成的情况下，特别是在核酸合成领域，所述方法通常包括以下步骤——尽管这些步骤中的一步或多步可以进行修改或调整，且这对于本领域技术人员来说是显而易见的：
[0286]
(a)提供官能化的支持物，其任选地用核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸官能化，所述核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸充当：
[0287]-用于合成核酸链的引物，所述核酸链与和所述引物杂交的游离核酸模板的至少一部分互补；或
[0288]-用于合成其游离互补核酸链的核酸模板；
[0289]
(b)在以下条件下，使所述官能化的支持物与至少一种有机分子构建块接触，特别是与核苷酸或核苷接触：
[0290]-所述条件适合于以与游离核酸模板互补的方式将有机分子构建块与充当引物的核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸偶联；或
[0291]-所述条件适合于以与充当核酸模板的核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸互补的方式将有机分子构建块彼此偶联；
[0292]
(c)重复步骤(b)，直到获得所需的核酸分子。
[0293]
模板依赖性合成的典型实例包括酶促扩增过程，例如聚合酶链式反应(pcr)，其允许从核酸模板(例如，dna模板或rna模板)合成dna(使用例如dna或rna依赖性dna聚合酶)或
rna(使用例如dna或rna依赖性dna聚合酶)链。作为示例性实施方案，模板依赖性rna合成的方法描述在实施例6中。
[0294]
如本文所用，术语“核酸组装”通常应用于核酸的合成，并且是指在连接酶的存在下，使用基于延伸的多重组装反应、基于连接的多重组装反应或其组合，组装多个(即，两个或更多个)小核酸片段以产生更长核酸片段的过程。
[0295]
在一个实施方案中，上述液相合成方法可进一步包括使用经修饰的有机分子构建块对聚合物有机分子进行合成后标记的步骤。此类经修饰的有机分子构建块包括例如带有荧光染料的构建块。
[0296]
在一个实施方案中，本发明的肽支架可以在分子生物学和生物化学测定中用作可溶性支持物。
[0297]
可使用本发明的肽支架的分子生物学和生物化学测定的实例包括但不限于配体结合测定、免疫测定、酶测定、核酸杂交测定、亲和纯化等。
[0298]
如本文所用，术语“配体结合测定”是指依赖于配体与靶分子(例如，受体、抗体或任何其他大分子)的结合的生物化学测试，例如用于筛选、检测和/或定量与给定靶分子结合的配体分子。在本发明的上下文中，肽支架用所述靶分子官能化。
[0299]
配体/靶分子对的实例包括但不限于底物/酶，酶/底物，抗原/抗体，抗体/抗原，多糖/凝集素，凝集素/多糖，核酸/互补碱基序列，激素/受体，受体/激素，聚(a)核酸序列/包含聚(u)核酸序列的rna，金属离子/聚融合蛋白，以及多融合蛋白/金属离子。
[0300]
如本文所用，术语“免疫测定”是指特定类型的配体结合测定，在该测定中通过使用抗体或抗原作为靶分子来测量溶液中分子的存在和/或浓度。在本发明的上下文中，肽支架用所述抗体或抗原官能化。通过免疫测定检测的分子称为“被分析物”，其可以是但不限于蛋白或可被抗体或抗原识别或结合的任何其他类型的分子。
[0301]
免疫测定的实例包括但不限于酶联免疫吸附测定(elisa)、酶联免疫吸附斑点(elispot)、放射变应原吸附试验(rast)、放射免疫测定、放射结合测定和免疫荧光测定。
[0302]
如本文所用，术语“酶测定”是指测定酶活性的特定类型的配体结合测定，例如用于研究酶动力学和/或酶抑制。通常，测量作为靶分子的所述酶对底物的消耗或产物的生产。在本发明的上下文中，肽支架用所述酶官能化。
[0303]
如本文所用，术语“核酸杂交测定”或简称“杂交测定”是指检测两条互补核酸链的退火的特定类型的配体结合测定。在本发明的上下文中，肽支架用已知或未知序列的寡核苷酸官能化。
[0304]
如本文所用，术语“亲和纯化”是指配体结合测定的变化形式，生物化学混合物在其中基于配体与其靶分子之间的特定相互作用而分离。
[0305]
在一个实施方案中，分子生物学和生物化学测定不是或不包括细胞递送测定。
[0306]
如本文所用，术语“细胞递送测定”是指依赖于有机分子的细胞内或细胞表面递送的生物化学测试。
[0307]
本发明还涉及包含本发明的肽支架的试剂盒。
[0308]
在一个实施方案中，试剂盒包括肽支架，所述肽支架包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列，如上文所述。
[0309]
在一个实施方案中，肽支架进一步包含至少一个芳香族氨基酸，如上文所述。
[0310]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:3或seq id no:4所示的氨基酸序列或由如seq id no:3或seq id no:4所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0311]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:5至seq id no:22中任一项所示的氨基酸序列或由如seq id no:5至seq id no:22中任一项所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0312]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:26或seq id no:27所示的氨基酸序列或由如seq id no:26或seq id no:27所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0313]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:28至seq id no:45中任一项所示的氨基酸序列或由如seq id no:28至seq id no:45中任一项所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0314]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:24所示的氨基酸序列或由如seq id no:24所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0315]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:25所示的氨基酸序列或由如seq id no:25所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0316]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:48所示的氨基酸序列或由如seq id no:48所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0317]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:49所示的氨基酸序列或由如seq id no:49所示的氨基酸序列组成，如上文所述。
[0318]
在一个实施方案中，肽支架被官能化，如上文所述。
[0319]
在一个实施方案中，肽支架用至少一个生物分子官能化，如上文所述。
[0320]
在一个实施方案中，肽支架进一步包括接头或间隔物，所述接头或间隔物结合至所述肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团，例如结合至所述肽支架的至少一个赖氨酸(lys)残基的ε-氨基或结合至所述肽支架的至少一个半胱氨酸(cys)残基的巯基，如上文所述。
[0321]
或者，试剂盒可包含：
[0322]-肽支架，其包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列，如上文所述；任选地，所述肽支架进一步包含至少一个芳香族氨基酸，如上文所述；
[0323]-接头或间隔物，其包含蛋白连接基团，如上文所述；任选地，接头或间隔物被官能化，如上文所述；任选地，接头或间隔物用至少一个生物分子官能化，如上文所述；和
[0324]-将接头或间隔物与肽支架偶联的说明。
[0325]
或者，试剂盒可包含：
[0326]-肽支架，其包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列，如上文所述；任选地，所述肽支架进一步包含至少一个芳香族氨基酸，如上文所述；
[0327]-生物分子，其包含蛋白连接基团，如上文所述；和
[0328]-将生物分子与肽支架偶联的说明。
[0329]
或者，试剂盒可包含：
[0330]-肽支架，其包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x5)n氨基酸序列，如上文所述；任选地，所述肽支架进一步包含至少一个芳香族氨基酸，如上文所述；
[0331]-接头或间隔物，其包含蛋白连接基团，如上文所述；
[0332]-生物分子，如上文所述；和
[0333]-将接头或间隔物以及生物分子与肽支架偶联的说明。
[0334]
在任何前述实施方案中，所述试剂盒可进一步包含适用于将接头或间隔物和/或生物分子偶联至肽支架的任何试剂。
[0335]
在任何前述实施方案中，所述试剂盒可进一步包含适将肽支架用作可溶性支持物的任何试剂。在任何前述实施方案中，所述试剂盒可进一步包含适合使用肽支架作为可溶性支持物进行有机分子合成方法和/或分子生物学和生物化学测定的任何试剂，如上文所述。
[0336]
在任何前述实施方案中，所述试剂盒可进一步包括使用说明。
[0337]
本文公开了肽支架，其包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中：
[0338]“n”是2至20范围内的整数，并且
[0339]
x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)和精氨酸(arg，r)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；并且
[0340]
x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)；
[0341]
其中所述肽支架用与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团结合的至少一个有机分子进行官能化。
[0342]
在一个实施方案中，所述至少一个有机分子是选自核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、氨基酸残基、肽、多肽、蛋白、单糖、二糖、寡糖、多糖的生物分子。
[0343]
在一个实施方案中，所述至少一个有机分子通过接头或间隔物共价结合至所述至少一个赖氨酸残基的ε-氨基。
[0344]
在一个实施方案中，肽支架进一步包含至少一个芳香族氨基酸，所述芳香族氨基酸选自氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)和组氨酸(his，h)，优选选自氨酸(trp，w)和酪氨酸(tyr，y)。
[0345]
在一个实施方案中，肽支架包含具有seq id no:3的(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，或具有seq id no:4的(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中“n”、x2、x3、x4和x5如上文所定义。
[0346]
在一个实施方案中，肽支架包含如seq id no:5至22中任一项所示的氨基酸序列，优选包含seq id no:24或seq id no:25的氨基酸序列。
[0347]
在一个实施方案中，肽支架包含具有seq id no:26的(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，或具有seq id no:27的(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列，其中“n”、x2、x3、x4和x5如上文所定义。
[0348]
本文还公开了生产本发明的肽支架的方法，其包括以下步骤：
[0349]
a.产生包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列的肽，其中
[0350]“n”是2至20范围内的整数；
[0351]
x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)和精氨酸(arg，r)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；并且
[0352]
x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)；
[0353]
b.纯化步骤a中产生的肽；
[0354]
从而获得肽支架，
[0355]
c.将肽支架官能化，其中肽支架的官能化包括：
[0356]
(i)将所述肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团与有机分子偶联，优选与接头或间隔物和/或生物分子偶联；和
[0357]
(ii)任选地，在(i)之前、与(i)同时或在(i)之后，用肽基-脯氨酰基异构酶将所述肽支架的脯氨酸(pro)残基的脯氨酰基肽键异构化。
[0358]
在一个实施方案中，生物分子或接头或间隔物包含能够直接或间接与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团反应的蛋白连接基团。
[0359]
本文还公开了本发明的肽支架作为可溶性支持物的用途。
[0360]
在一个实施方案中，肽支架在有机分子合成方法中用作可溶性支持物。
[0361]
在一个实施方案中，有机分子合成方法是核酸、肽、碳水化合物或其缀合物的合成方法，优选地，有机分子合成方法是酶促核酸合成方法。
[0362]
在一个实施方案中，肽支架在分子生物学和生物化学测定中用作可溶性支持物。
[0363]
在一个实施方案中，分子生物学和生物化学测定是配体结合测定、免疫测定、酶测定、核酸杂交测定或亲和纯化。
[0364]
本文还公开了试剂盒，其包含：
[0365]-包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)n氨基酸序列的肽支架，其中
[0366]“n”是2至20范围内的整数；
[0367]
x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)和精氨酸(arg，r)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；并且
[0368]
x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)
[0369]-生物分子和/或接头或间隔物，任选地，所述连接头或间隔物用至少一个生物分子官能化；其中所述生物分子或接头或间隔物包含能够直接或间接与肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团反应的蛋白连接基团；
[0370]-将生物分子和/或接头或间隔物与肽支架偶联的说明。
[0371]
附图简要说明
[0372]
图1是具有seq id no:24的肽的maldi-tof/tof谱。x轴：分子量，以m/z显示，其中z＝1；y轴：强度，以％显示。
[0373]
图2是显示在三种不同浓度(1、5和10mg/ml)下具有seq id no:24的肽在280nm(x轴)处出现峰值的吸光度(y轴)的分光光度光谱。
[0374]
图3是600nm处的分光光度光谱，显示了600nm处的吸光度(y轴)随时间(x轴，以分钟显示)的变化。
[0375]
图4示出了包含5'nhs-羧基-c10部分的33-mer寡核苷酸[33-mer]。
[0376]
图5显示了使用nhs偶联策略用33-mer寡核苷酸官能化的具有seq id no:24的肽支架。
[0377]
图6示出了氧化的5'c6二巯基33-mer寡核苷酸[33-mer]。
[0378]
图7示出了减少的5'c6巯基修饰的33-mer寡核苷酸[33-mer]。
[0379]
图8示出了5'-c2醛33-mer寡核苷酸[33-mer]。
[0380]
图9显示了本发明的肽支架与n-boc-氨基氧乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯的反应过程。
[0381]
图10显示了官能化、脱保护的肽支架与5'-c2醛33-mer寡核苷酸的反应过程。
[0382]
图11是使用用作为合成起始物的33-mer寡核苷酸官能化的肽支架通过酶促核酸合成法新合成的寡核苷酸电泳时的尿素-聚丙烯酰胺凝胶(15％)照片。第一泳道：33-mer寡核苷酸起始物(对照)；第二泳道：33-mer+1，在一个合成循环后；第三泳道：33-mer+2，在两个合成循环后；第四泳道：33-mer+3，在三个合成循环后；第五泳道：33-mer+5，在五个合成循环后。
[0383]
图12是3％琼脂糖凝胶的照片，显示了在末端转移酶测定中官能化肽支架功效优于传统使用的固体支持物(磁珠)或游离ssdna引物。泳道1：mw梯；泳道2：未纯化的官能化肽支架；泳道3&4：游离ssdna引物
±
酶；泳道5&6：具有4个oligo 1的肽支架
±
酶；泳道7&8：具有6个oligo 1的肽支架
±
酶；泳道9&10具有oligo 1的固体珠子
±
酶。
[0384]
图13a-f是一组六张图，说明了使用本发明的肽框架的rna合成方法的示例性步骤。
[0385]
图14a-c是一组三张图，说明了使用本发明的肽框架的rna合成方法的示例性步骤。
[0386]
图15是3％琼脂糖凝胶的照片，显示了使用用t7终止引物官能化的肽支架对感兴趣的基因进行pcr扩增的效力。泳道1：游离的单链oligo 2(即t7终止引物)；泳道2：模板质粒，无引物；泳道3：游离的单链oligo 2+模板质粒；泳道4：具有4个oligo 2的肽支架+模板质粒；泳道5：具有5个oligo 2的肽支架+模板质粒；泳道6：具有6个oligo 2的肽支架+模板质粒。
实施例
[0387]
本发明通过以下实施例进一步说明。
[0388]
实施例1：肽支架的合成、纯化和表征
[0389]
材料和方法
[0390]
由“plateforme de prot
é
omique de l’institut de biologie paris-seine”(法国巴黎)合成具有seq id no:24(pkpkpkpkpkpkpkpkpypwp)的肽。
[0391]
使用fmoc化学，使用自动肽合成仪在基于聚苯乙烯的固体支持物上，从c端到n端进行合成。
[0392]
合成后，通过反相hplc纯化肽，冻干并称重。
[0393]
为了评估肽的纯度和完整性并确认其氨基酸序列，通过maldi串联飞行时间(tof/tof)质谱法，在配备有nd:yag激光器(l＝355nm，200hz)和反射器模式的4700蛋白质组学分析仪(applied biosystems)上对肽进行分析。
[0394]
为了评估肽的溶解度和均一性，通过吸收分光光度法在600nm处分析3mg/ml的肽4分钟。将结果与cnbr树脂(purolite life sciences)的悬浮液的结果进行比较，cnbr树脂是一种高度交联的预活化的基于琼脂糖的基质，通常在分子生物学和生物化学测定(蛋白纯化、定制亲和谱介质的制备等)中用作固体支持物，并且适用于偶联包括寡核苷酸、肽等在内的生物分子。
[0395]
结果
[0396]
合成后，maldi-tof/tof分析显示肽是纯的，分子量为2461g/mol(图1)，对应于seq id no:24(pkpkpkpkpkpkpkpkpypwp)所示的序列。
[0397]
引入芳香族氨基酸残基酪氨酸(tyr，y)和氨酸(trp，w)用于分光光度法监测，其吸收谱允许对肽浓度直接进行a
280
测量(图2)。
[0398]
600nm处的分光光度法显示，与cnbr树脂(图3)相反，所测量的肽的吸光度没有随时间产生任何变化，这表明肽是均一且可溶的，因此适合用作可溶性支持物。
[0399]
结论
[0400]
使用常规方法可以成功地合成和纯化具有seq id no:24(pkpkpkpkpkpkpkpkpypwp)的肽。还使用相同的常规方法成功地合成和纯化了另一种具有seq id no:25(akpgkplkpakpgkplkpgkpypwp)的肽。
[0401]
质谱法和分光光度法证实，与通常在生物化学测定中用作支持物的树脂相反，所述肽是纯的、均一的且可溶的，这支持了该肽作为替代的可溶性支持物的用途。
[0402]
实施例2：生物分子偶联
[0403]
在本实施例中，利用作为生物分子的寡核苷酸，对具有seq id no:24(pkpkpkpkpkpkpkpkpypwp)和seq id no:25(akpgkplkpakpgkplkpgkpypwp)的肽支架在其赖氨酸(lys)残基的ε-氨基上进行官能化。然而，任何其他生物分子根据在合成方法或分子生物学和生物化学测定中的预期用途都可以容易地与肽支架偶联。
[0404]
以下描述了三种偶联生物分子的策略。然而，本实施例不旨在限于这些特定策略。
[0405]
nhs偶联
[0406]
包含5'nhs
–
羧基
–
c10的33-mer寡核苷酸购自genelink(图4)。在本实施例中，nhs部分用作氨基反应性蛋白连接基团，羧基-c10部分用作接头或间隔物。
[0407]
根据genelink的方案，以4mgε-胺比200纳摩尔寡核苷酸的比率进行偶联(具有seq id no:24的肽支架包含8个赖氨酸残基，因此包含8个ε-胺)。
[0408]
一个5'nhs
–
羧基
–
c10
–
33-mer成功地偶联在赖氨酸残基的每个游离伯胺上(图5)。
[0409]
sh-cn偶联
[0410]
在kaneka eurogentec购买了氧化的5'c6二巯基33-mer寡核苷酸(图6)。
[0411]
使用该策略，第一步是还原二巯基寡核苷酸的二硫键，以获得5'c6巯基修饰的33-mer寡核苷酸。
[0412]
一个合适的方案分为两个主要的子步骤：(1)形成硫醇和(2)去除副产物。
[0413]
对于硫醇的形成，将氧化的5’c6二巯基33-mer寡核苷酸溶解在100mm dtt/100mm磷酸钠缓冲液(ph 8.3-8.5)中并孵育1小时。或者，可以使用tcep代替dtt。
[0414]
为了去除副产物，将反应混合物在nap-10柱上利用100mm磷酸钠缓冲液(ph 6.0)洗脱。
[0415]
还原后，可以使用emcs(6-马来酰亚胺己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯)将5'c6巯基修饰的33-mer寡核苷酸(图7)与肽支架的赖氨酸(lys)残基的ε-氨基偶联，如ghosh et al.,1990.bioconjug chem.1(1):71-6中所述。
[0416]
在该实施例中，c6部分用作接头或间隔物。
[0417]
肟醚偶联
[0418]5’‑
c2醛33-mer寡核苷酸购自kaneka eurogentec(图8)。在该实施例中，c2部分用作接头或间隔物。
[0419]
使用该策略，偶联发生在3个步骤中：(1)(boc-氨基氧基)乙酸的活化；(2)官能化的肽支架的纯化和脱保护；(3)5
’‑
c2醛33-mer寡核苷酸与官能化的肽支架的偶联。
[0420]
首先，(boc-氨基氧基)乙酸在其羧基上用nhs部分活化，以获得n-boc-氨氧基乙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯，其进一步与肽支架的赖氨酸(lys)残基的ε-氨基反应(图9)。
[0421]
其次，纯化官能化的肽支架，然后在tfa/h2o/tis(80/16/4)的存在下将其脱保护以去除boc部分。因此，脱保护的肽支架包含羟胺基。
[0422]
最后，将脱保护的肽支架与5'-c2醛33-mer寡核苷酸(每个羟胺基为1.2当量的5'-c2醛33-mer寡核苷酸)反应，形成肟醚连接(图10)。
[0423]
结论
[0424]
可以使用本领域公知的各种偶联策略，用33-mer寡核苷酸对具有seq id no:24(pkpkpkpkpkpkpkpkpypwp)的肽进行成功官能化。
[0425]
因此，官能化肽支架可以用作酶促核酸合成的可溶性支持物。
[0426]
然而，根据肽支架的官能化，本领域技术人员可以容易地在需要支持物(例如固体支持物)或可以使用支持物(例如固体支持物)进行的任何方法中使用肽支架。
[0427]
实施例3：酶促核酸合成
[0428]
将实施例2中生产的可溶性官能化肽支架用于酶促核酸合成方法中，肽支架替代常用的固体支持物。33-mer寡核苷酸用作合成起始物。所述方法使用3'-o-nh
2-dntp作为有机分子构建块以及末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)作为反应酶进行。使用用乙酸缓冲至ph 4.5-5.0的含有700mm亚硝酸钠(nano2)的1m乙酸钠去除保护性3'-o-nh2基团。
[0429]
所述方法如本领域已知的那样进行，包括以下步骤：
[0430]
(a)在tdt存在下，在适合于将3'-o-nh
2-dntp偶联至33-mer寡核苷酸的3'末端的条件下，使官能化肽的支架与3'-o-nh
2-dntp接触，从而获得3'受保护的34-mer寡核苷酸；
[0431]
(b)洗涤过量的3'-o-nh
2-dntp和其他试剂，例如通过真空过滤；
[0432]
(c)使肽支架与脱保护试剂在适合于从3’受保护的34-mer寡核苷酸中去除保护基团的条件下接触，
[0433]
(d)任选地，重复(b)和(c)，
[0434]
(e)重复步骤(a)至(d)直到获得所需的寡核苷酸。
[0435]
结果
[0436]
如图11所示，可以使用实施例2中生产的可溶性官能化肽支架作为传统使用的固体支持物的替代物，进行多个循环的酶促核酸合成。
[0437]
特别是，可溶性肽支架，由于其大小(肽支持物本身为2.461kda，加上33-mer寡核苷酸是其8倍≈10kda)，允许真空过滤样品，从而容易洗涤和洗脱试剂和副产物，而不存在洗脱支持物和/或生长的寡核苷酸的风险。
[0438]
实施例4：新合成的寡核苷酸的回收
[0439]
使用固体支持物的酶促核酸合成面临的主要限制在于，支持物本身的空间位阻阻碍了酶到达支持物附近的寡核苷酸并释放它们。因此，最终回收了仅15-20％的合成寡核苷酸。这一损失是巨大的。
[0440]
使用本发明的可溶性肽支架，克服了这一缺点。
[0441]
已经成功地实施了两种策略以在合成后释放所合成的寡核苷酸，尽管本领域技术人员可以容易地调整这些策略。
[0442]
第一种策略涉及消化肽支持物本身，以释放合成的寡核苷酸，包括：
[0443]-lys残基或lys-pro二肽；
[0444]-任选地，当存在时，接头或间隔物；
[0445]-合成起始物(例如，33-mer寡核苷酸)；和
[0446]-合成起始物上游的新合成的寡核苷酸序列。
[0447]
有数种方法适于实现第一种策略，包括使用：
[0448]-脯氨酰内肽酶，其在每个脯氨酸残基的c末端侧切割肽支架中的肽键，从而释放具有lys-pro二肽的合成的寡核苷酸；
[0449]-lys-c和/或lys-n内肽酶，其分别在每个赖氨酸残基的c末端侧和n末端侧切割肽支架中的肽键，从而释放具有lys残基或lys-pro二肽的合成的寡核苷酸。
[0450]
该第一种策略的优点之一是保持固定序列(合成起始物)，该序列可以用作例如探针杂交或pcr扩增的启动位点。
[0451]
第二种策略涉及使用核酸内切酶。本领域技术人员可以容易地选择任何内切核酸酶，尤其是根据合成起始物的序列进行选择。
[0452]
因此，使用在合成起始物的最后一个核苷酸和新合成的寡核苷酸的第一个核苷酸之间正确切割的内切核酸酶，可以回收用合成起始物保持官能化的肽支架，以进行进一步的酶促核酸合成方法，或需要这样的官能化支持物的任何其他方法。
[0453]
实施例5
[0454]
在本实施例中，在核酸合成测定之前，利用作为生物分子的寡核苷酸对具有seq id no:25(akpgkplkpakpgkplkpgkpypwp)的肽支架在其赖氨酸(lys)残基的ε-氨基上进行官能化。
[0455]
肽支架的合成、纯化和表征
[0456]
如实施例1中所述，合成具有seq id no:25(akpgkplkpakpgkplkpgkpypwp)的肽支架。
[0457]
在偶联之前，在肽中引入了数个合成后修饰：
[0458]-肽的n末端用乙酰基(co-ch3；ac)保护；
[0459]-肽的c末端用conh2基团保护；
[0460]-通过合成后化学修饰，将氨氧乙酸接头(-co-ch
2-o-nh2)添加至赖氨酸(lys)的每个ε-氨基的反应性侧链基团，从而在每个反应性侧链末端暴露伯胺(具有更长的臂)。
[0461]
然后使用0.1％ tfa水溶液作为缓冲液a，含0.1tfa的乙腈溶液作为缓冲溶液b，通过hplc分析在100
×
4.6mm c18柱上对肽支架进行表征。在λ＝220nm处检测到主峰，其相对面积为85.37％。
[0462]
电喷雾电离离子阱质谱(esi-itms)分析证实了3229.7da的预期分子量。
[0463]
偶联
[0464]
如实施例2中所述，使用以下两种不同的寡核苷酸进行肟醚偶联：
[0465]-oligo 1，由具有seq id no:46的5'-c3醛30-mer寡核苷酸(在位置6处的胸苷上包含6-fam标记)组成；和
[0466]-oligo 2，由具有seq id no:47的5'-c3醛22-mer寡核苷酸(在位置6处的胸苷上包含6-fam标记)组成。
[0467]
官能化肽支架的分离与纯化
[0468]
在偶联并在oligo 1和肽支架之间形成醚肟键后，将样品装载在4％琼脂糖凝胶上，并在135v下在tbe缓冲液1x中迁移80分钟。
[0469]
从凝胶中切下与含4(约120-mer)或6(约180-mer)个寡核苷酸的肽支架相对应的感兴趣条带。将这些条带干磨并与150μl超纯h2o混合。
[0470]
在乙醇沉淀之前，将样品在50℃同时以2000rpm振荡下孵育45分钟。
[0471]
对于乙醇沉淀，向150μl样品添加15μl乙酸铵(1:10(v/v))。然后添加3倍体积(495μl)的无水乙醇(在-20℃下预冷)，并将样品在-80℃下孵育30分钟。然后在4℃下以18000g离心30分钟。丢弃上清液，并向沉淀添加1ml 75％乙醇(在-20℃下预冷却)。然后在4℃下以18000g离心15分钟。丢弃上清液。
[0472]
在4％琼脂糖凝胶上进行电泳以验证纯度。对于每种提取物(+4和+6)，都检测到独特的条带。
[0473]
官能化肽支架通过无模板末端转移酶活性用于ssdna延伸
[0474]
利用以下在水中制备酶反应混合物：
[0475]
50mm(最终)tris-hcl ph 8.0；
[0476]
5mm(最终)mn
2+
；
[0477]
4mm(最终)4种dntp的混合物；和
[0478]
5.1μm(最终)专有的热稳定性古细菌酶。
[0479]
然后将36μl的该反应混合物添加到4μl的任意以下(最终体积为40μl)：
[0480]-160nm(最终)的单链oligo 1，其偶联至肽支架；
[0481]-500nm(最终)的游离单链oligo 1；
[0482]-450nm(最终)的单链oligo 1，其偶联至固体珠子。
[0483]
酶促测定如下进行：
[0484]-对于携带单链oligo 1的官能化的肽支架：
[0485]
■
伸长：70℃30分钟，和
[0486]
■
反应停止：40μl甲酰胺，在95℃下孵育2分钟；
[0487]-对于游离的单链oligo 1：
[0488]
■
伸长：70℃30分钟，和
[0489]
■
反应停止：40μl甲酰胺，在95℃下孵育2分钟；
[0490]-对于携带单链oligo 1的固体珠子：
[0491]
■
伸长：70℃30分钟，和
[0492]
■
反应停止：用40μl水在磁分离架(来自thermofisher的dyna
tm
mag 2磁铁)上洗涤酶促混合物，两次；和
[0493]
■
在凝胶迁移前，使用32μl水、4μl cutsmart缓冲液(37℃下预热)和4μl user
tm
酶(来自neb)在37℃下孵育30分钟，然后放置在磁性分离架上以收集40μl上清液(向其中添加40μl甲酰胺)，去除磁珠并释放ssdna。
[0494]
然后将样品加载至含有2.5％ sybrgreen ii的3％琼脂糖凝胶上，并在tbe1x缓冲液中以135v迁移1小时。
[0495]
图12显示了该测定的结果。从凝胶中可以看出，在等体积反应时，在进行酶促反应之前，与珠子相比，在肽支持物上可以偶联的遗传物质多20倍；此外，与游离ssdna上的合成相比，肽支架-oligo 1复合物的构型不干扰末端转移酶活性。
[0496]
使用肽支持物时sybrgreen ii的固定和过量荧光强度也证实了ssdna片段的长度正在延伸。
[0497]
实施例6
[0498]
使用固定在肽支架上的t7终止引物的pcr用于大规模mrna生产
[0499]
大规模合成信使rna分子是一个主要的工业挑战，这主要是由于传统方法的低产量以及这些分子在室温下本身的不稳定性。事实上，为了生产信使rna分子，常规方法需要第一步：将感兴趣的模板基因接植到官能化的谱树脂上，或者将模板基因克隆到质粒载体中，以双链dna的形式；随后进行体外转录步骤。第二步在生物反应器中进行，需要使用合成酶或酶促复合物，例如噬菌体t7的rna聚合酶，但也需要使用专门用于在5'端添加帽和在3'端添加聚腺苷酸化的熟化酶。最后，生产的信使rna分子必须通过谱纯化，从而与合成酶和模板dna分离。然而，尽管在实验室规模上掌握了合成方法，但这些步骤中没有一个针对工业化和大规模生产进行了优化，反应产率与起始物质的数量直接相关，并且取决于不同的阶段。此外，除了与连续使用多种酶相关的问题外，还应注意的是rna聚合酶产生大量不成功的链，这通常导致截短的rna链的合成。
[0500]
本发明的肽支架可以通过增加起始模板dna的数量来克服这些问题。
[0501]
rna聚合
[0502]
在第一步中，将一个或多个拷贝的待转录基因的互补链(单链dna形式)偶联至本发明的肽支架。可以将该互补链的全长与肽支架偶联；或者，仅将待转录基因的互补片段偶联至肽支架，作为在ssdna形式的模板基因存在下的扩增第一步的引物，从而产生与肽支架
偶联的基因的完整互补链(图13a)。
[0503]
在第二步中，可以进行多个合成循环，其包括三个连续步骤并且重复1至50次：
[0504]
a.在对附着至肽支架的互补链的3'末端特异的rna引物和热稳定rna聚合酶(例如cozens et al.,2012.proc natl acad sci usa.109(21):8067-72描述的来自thermococcus gorgonarius的突变tgo dna聚合酶)的存在下，将该互补链在95℃下变性(图13b)。变性可以在能够搅拌、控制温度和过滤的生物反应器中进行，或者直接在热循环仪中进行；
[0505]
b.在约50℃至约70℃的温度下，在互补链上杂交rna引物；
[0506]
c.在约60℃至约75℃的温度下，使用聚合酶，合成与模板ssdna链互补的信使rna链(图13c)。
[0507]
在第三步中，用缓冲液或水对反应介质进行连续超滤或过滤，以去除盐、核苷酸和聚合酶。该洗涤步骤允许仅保留附着至肽支架的rna链和模板链。过滤可以在能够搅拌、控制温度和过滤的生物反应器中进行，或者直接在超滤单元中进行。
[0508]
最后，可以在能够对新产生的信使rna进行5'加帽和3'聚腺苷酸化的酶混合物的存在下孵育样品(图13d)，然后进行额外轮次的洗涤和任选的dnase/蛋白酶处理(图13e)，最终回收信使rna链(图13f)。
[0509]“一锅法”rna合成
[0510]
在第一步中，将一个或多个拷贝的待转录基因的互补链(单链dna形式)偶联至肽支架。所附着的链应在其5’末端具有多个脱氧胸苷，优选连续的多个脱氧胸苷，优选在200和300个之间。与本发明的肽支架的偶联可以在5’端、3’端或不加区别在两者上进行。如前所述，该互补链的全长可以与肽支架偶联；或者，仅将待转录基因的互补片段与肽支架偶联(在5'末端具有其多个脱氧胸苷)，作为在ssdna形式的模板基因存在下扩增第一步的引物，从而产生与肽支架偶联的基因的完整互补链(图14a)。
[0511]
在第二步中，可以进行多个合成循环，其包括三个连续步骤并且重复1至50次：
[0512]
a.在对该互补链3'末端特异的5’加帽的rna引物和热稳定rna聚合酶(例如cozens et al.,2012.proc natl acad sci usa.109(21):8067-72描述的来自thermococcus gorgonarius的突变tgo dna聚合酶)的存在下，将附着至肽支架的互补链在95℃下变性(图14b)。变性在能够搅拌、控制温度和过滤的生物反应器中进行，或者直接在热循环仪中进行；
[0513]
b.在约50℃至约70℃的温度下，在互补链上杂交rna引物；
[0514]
c.在约60℃至约75℃的温度下，通过聚合酶，合成与模板ssdna链互补的信使rna链(图14c)。
[0515]
在第三步中，用缓冲液或水对反应介质进行连续超滤或过滤，以去除盐、核苷酸和聚合酶。该洗涤步骤允许仅保留附着至肽支架的rna链和模板链。过滤可以在能够搅拌、控制温度和过滤的生物反应器中进行，或者直接在超滤单元中进行。
[0516]
最后，可以任选地在dnase/蛋白酶的存在下孵育样品，然后进行额外轮次的洗涤，最终回收信使rna链。
[0517]
实验数据
[0518]
获得实施例5中描述的与oligo 2偶联的肽支架。官能化的肽支架的纯化表明，有
4、5、6或7个寡核苷酸有效地偶联至该肽支架。
[0519]
如实施例5中所述，通过切下与携带4、5、6或7个寡核苷酸的肽支架相对应的感兴趣条带并用乙醇沉淀，来分离它们。或者，将切下的条带插入具有200μl tbe缓冲液的透析管(mw截止值＝10kda)中，并浸入电泳槽中，其中施加5v/cm的电场，持续20分钟。最后将dna溶液从透析管中取出并置于1.5ml管中。
[0520]
为了扩增感兴趣的基因，使用q5聚合酶mix 2x(neb)并按照制造商的方案进行pcr。感兴趣的基因在t7启动子的控制下，并以质粒形式(插入长度＝1200bp)在pcr混合物中提供。
[0521]
测试了多种条件：
[0522]-游离的单链oligo 2(即t7终止引物)(阴性对照)；
[0523]-模板质粒，无引物(阴性对照)；
[0524]-游离的单链oligo 2(即t7终止引物)+游离的单链t7启动子引物+模板质粒(阳性对照)；
[0525]-与肽支架偶联的单链oligo 2(+4、+5和+6)+游离的单链t7启动子引物+模板质粒。
[0526]
pcr后，使用dpni消化模板质粒。
[0527]
结果如图15所示。它表明，使用肽支架的扩增总是高于阳性对照(阳性对照呈现模糊的高分子量带，其可能对应于非特异性扩增)。
[0528]
实施例7
[0529]
在本实施例中，具有seq id no:48(apkapkapkapkapkapkapkwpw)的肽支架在其赖氨酸(lys)残基的ε-氨基上利用作为生物分子的寡核苷酸进行官能化。
[0530]
肽支架的合成、纯化和表征
[0531]
如实施例1中所述，合成具有seq id no:48(apkapkapkapkapkapkapkwpw)的肽支架。
[0532]
在偶联之前，该具有seq id no:48的肽支架在合成后进行如下修饰：
[0533]-肽的n末端用乙酰基(co-ch3；ac)保护；
[0534]-通过在室温下与琥珀酸酐在dmf中反应5小时，将琥珀酰接头(-co-ch
2-ch
2-cooh)添加至赖氨酸(lys)的每个ε-氨基的反应性侧链基团，从而在每个反应性侧链的末端暴露羧酸基团。
[0535]
由此，从肽支架上的琥珀酰接头暴露的酸部分作用类似于seq id no:1或seq id no:2的肽支架，其中x1是天冬氨酸或谷氨酸残基。
[0536]
然后在100
×
4.6mm c18柱上，使用0.1％tfa水溶液作为缓冲液a以及含0.1tfa的乙腈溶液作为缓冲液b，通过hplc分析对肽支架进行表征。在λ＝220nm处检测到主峰，其相对面积为97.25％。
[0537]
电喷雾电离离子阱质谱(esi-itms)分析证实了3300.4da的预期分子量。
[0538]
偶联
[0539]
使用“oligo 3”进行胺羧酸偶联，所述寡核苷酸3由具有seq id no:46的5'-c6-胺30-mer寡核苷酸组成，且在位置6处的胸苷上包含6-fam标记。
[0540]
反应在25mm mes ph 4.5中，在edc(乙基-3(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)
的存在下进行，以从羧酸和胺基基团形成酰胺键。
[0541]
oligo 3的量保持恒定在1.25nmol，而肽支架的量在0.3至3.7nmol之间变化，以筛选出获得最佳偶联效果的最佳比例。当寡核苷酸:活性位点的摩尔比为0.3:1(即，1.25nmol oligo 3和3.7nmol肽支架)时，100％的oligo与支架偶联，具有大量的+4和+5个偶联位点。
[0542]
实施例8
[0543]
如实施例1中所述，合成具有seq id no:49(apkapkapkapkapkapkapkapkapkapkapkapkwpw)的肽支架。
[0544]
为了评估纯度和完整性并确认其氨基酸序列，在配备有nd:yag激光器(l＝355nm，200hz)和反射器模式的4700蛋白质组学分析仪(applied biosystems)上，通过maldi串联飞行时间(tof/tof)质谱法对肽支架进行分析。验证了4079.6da的预期分子量。
[0545]
在偶联之前，具有seq id no:49的该肽支架在合成后进行如下修饰：
[0546]-通过在室温下与琥珀酸酐在dmf中反应5小时，将琥珀酰接头(-co-ch
2-ch
2-cooh)添加至赖氨酸(lys)的每个ε-氨基的反应性侧链基团，从而在每个反应性侧链末端暴露羧酸基团；
[0547]-或者向赖氨酸(lys)的每个ε-氨基的反应性侧链基团添加巯基接头，从而在每个反应性侧链末端暴露巯基基团。
[0548]
具有琥珀酰接头的seq id no:49
[0549]
如实施例7中所述，进行合成后修饰和与寡核苷酸的偶联。
[0550]
由此，从肽支架上的琥珀酰接头暴露的酸部分作用类似于seq id no:1或seq id no:2的肽支架，其中x1是天冬氨酸或谷氨酸残基。
[0551]
具有巯基接头的seq id no:49
[0552]
为了向赖氨酸(lys)的每个ε-氨基的反应性侧链基团添加巯基接头，反应分两步进行：
[0553]
a.在室温下用edc在无水dmf中催化3小时，使赖氨酸的ε-氨基和3-(三苯甲硫基)丙酸之间形成酰胺键；
[0554]
b.然后，在室温下在二氯甲烷中，用三(tca)对3-(三苯甲硫基)丙酰基部分进行脱三苯甲基化和脱保护2小时。
[0555]
由此，在肽支架上暴露的巯基部分作用类似于seq id no:1或seq id no:2的肽支架，其中x1是半胱氨酸残基。
[0556]
实施例9：与蛋白偶联
[0557]
如实施例1中所述，合成具有seq id no:49(apkapkapkapkapkapkapkapkapkapkapkapkwpw)的肽支架。
[0558]
在偶联之前，通过向赖氨酸(lys)的每个ε-氨基的反应性侧链基团添加琥珀酰接头(-co-ch
2-ch
2-cooh)，对具有seq id no:49的肽支架进行合成后修饰，如实施例8中所述，。
[0559]
由此从肽支架上的琥珀酰接头暴露的酸部分作用类似于seq id no:1或seq id no:2的肽支架，其中x1是天冬氨酸或谷氨酸残基。
[0560]
使用牛血清白蛋白(bsa)或his标记的重组蛋白进行胺-羧酸偶联，所述重组蛋白先前在大肠杆菌中表达并依次用ni-nta亲和谱和肝素柱纯化。
[0561]
反应通过以下步骤进行：
[0562]
a.在试管中混合19μmol的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和75μl dmso或75μl h2o；
[0563]
b.添加1.5nmol经琥珀酸修饰的肽支架；
[0564]
c.在30℃下预活化反应混合物1小时；
[0565]
d.向混合物中添加11μl bsa或his标记的重组蛋白(c
°
：138μmol)，并在30℃、试管振荡下孵育过夜。
[0566]
在琼脂糖凝胶(1-5％)迁移和考马斯蓝染后，观察偶联。
[0567]
讨论
[0568]
本发明的肽支架具有4000μmol寡核苷酸/g支持物的理论结合能力。
[0569]
迄今为止，我们的化学家和生化学家团队已成功结合了高达3400μmol寡核苷酸/g支持物(即，在75-85％的可用位点上偶联)。作为比较，固体支持物如us20190264017中所述的支持物具有15-350μmol寡核苷酸/g支持物的理论偶联能力，其取决于寡核苷酸的长度(us20190264017的表3)。
[0570]
本发明的肽支架的优点在于其低摩尔质量(约3kd)以及其在大的反应介质中可忽略的质量。由于该支架是可溶的，它允许考虑任何尺寸的生物反应器(从小型化(微流体)到数升的罐)。

技术特征：

1.肽支架，其包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列，其中：“n”是2至20的整数，并且x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；更优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；甚至更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；并且x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)；其中所述肽支架用与所述肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团结合的至少一个核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸进行官能化。2.根据权利要求1所述的肽支架，其中所述至少一个核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸共价结合至所述至少一个赖氨酸残基的ε-氨基，任选地通过接头或间隔物共价结合。3.根据权利要求1或2所述的肽支架，其进一步包含至少一个芳香族氨基酸，所述芳香族氨基酸选自氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)和组氨酸(his，h)，优选选自氨酸(trp，w)和酪氨酸(tyr，y)。4.根据权利要求1至3中任一项所述的肽支架，其中所述肽支架包含具有seq id no:3的(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列，或具有seq id no:4的(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列，其中“n”、x2、x3、x4和x5如权利要求1中所定义。5.根据权利要求1至4中任一项所述的肽支架，其中所述肽支架包含seq id no:5至22中任一项所示的氨基酸序列。6.根据权利要求1至5中任一项所述的肽支架，其中所述肽支架包含seq id no:24、25、48或49中任一项所示的氨基酸序列。7.根据权利要求1至3中任一项所述的肽支架，其中所述肽支架包含具有seq id no:26的(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列，或具有seq id no:27的(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列，其中“n”、x2、x3、x4和x5如权利要求1中所定义。8.生产权利要求1至7中任一项所述的肽支架的方法，其包括以下步骤：a.产生包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列的肽，其中“n”是2至20的整数；x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；更优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；甚至更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；并且x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬
氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)；b.纯化步骤a中产生的肽；从而获得肽支架，c.将所述肽支架官能化，其中所述肽支架的官能化包括：(i)将所述肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团与核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸进行偶联，任选地通过接头或间隔物进行偶联；和(ii)任选地，在(i)之前、与(i)同时或在(i)之后，用肽基-脯氨酰基异构酶对所述肽支架的脯氨酸(pro)残基的脯氨酰基肽键进行异构化。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸或所述接头或间隔物包含能够直接或间接与所述肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团反应的蛋白连接基团。10.根据权利要求1至7中任一项所述的肽支架作为可溶性支持物的用途。11.根据权利要求10所述的用途，其作为核酸合成方法中，优选核酸液相合成方法中的可溶性支持物。12.根据权利要求11所述的用途，其中所述核酸合成方法是从头核酸合成方法、模板依赖性核酸合成方法或核酸组装方法。13.根据权利要求10所述的用途，其作为分子生物学和生物化学测定中的可溶性支持物。14.根据权利要求13所述的用途，其中所述分子生物学和生物化学测定是核酸杂交测定。15.包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列的肽支架，作为有机分子合成方法中或分子生物学和生物化学测定中的可溶性支持物的用途，条件是所述分子生物学和生物化学测定不是或不包括细胞递送测定，其中：“n”是2至20的整数；并且x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；更优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；甚至更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；并且x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)；其中所述肽支架用与所述肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团结合的至少一个有机分子进行官能化。16.根据权利要求15所述的用途，其中所述至少一个有机分子通过接头或间隔物共价结合至所述至少一个赖氨酸残基的ε-氨基。17.根据权利要求15或16所述的用途，其进一步包含至少一个芳香族氨基酸，所述芳香族氨基酸选自氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)、苯丙氨酸(phe，f)和组氨酸(his，h)，优选选
自氨酸(trp，w)和酪氨酸(tyr，y)。18.根据权利要求15至17中任一项所述的用途，其中所述肽支架包含具有seq id no:3的(lys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列或具有seq id no:4的(pro-lys-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列，其中“n”、x2、x3、x4和x5如权利要求15中所定义。19.根据权利要求15至18中任一项所述的用途，其中所述肽支架包含seq id no:5至22中任一项所示的氨基酸序列，优选包含seq id no:24或seq id no:25的氨基酸序列。20.根据权利要求15至17中任一项所述的用途，其中所述肽支架包含具有seq id no:26的(cys-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列或具有seq id no:27的(pro-cys-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列，其中“n”、x2、x3、x4和x5如权利要求15中所定义。21.根据权利要求15至20中任一项所述的用途，其中所述有机分子合成方法是肽、碳水化合物或其缀合物的合成方法。22.试剂盒，其包含：-包含具有seq id no:1的(x
1-pro-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列或具有seq id no:2的(pro-x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-)
n
氨基酸序列的肽支架，其中“n”是2至20的整数；x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、丝氨酸(ser，s)、苏氨酸(thr，t)、酪氨酸(tyr，y)、组氨酸(his，h)、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)、半胱氨酸(cys，c)、天冬氨酸(asp，d)和谷氨酸(glu，e)的反应性氨基酸；更优选地，x1是选自赖氨酸(lys，k)和半胱氨酸(cys，c)的反应性氨基酸；甚至更优选地，x1是赖氨酸(lys，k)；并且x2、x3、x4和x5彼此独立，并且对于每个“n”重复独立地为不存在或为脂族氨基酸，所述脂族氨基酸优选选自丙氨酸(ala，a)、甘氨酸(gly，g)、异亮氨酸(ile，i)、亮氨酸(leu，l)、缬氨酸(val，v)和脯氨酸(pro，p)；-核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸，其任选地结合至接头或间隔物；其中所述核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸或所述接头或间隔物包含能够直接或间接地与所述肽支架的至少一个反应性氨基酸的反应性侧链基团反应的蛋白连接基团；-将所述核苷酸、寡核苷酸或多核苷酸与所述肽支架偶联的说明。

技术总结

本发明涉及包含一系列脯氨酸(Pro，P)和反应性氨基酸的官能化肽支架、其生产方法，以及其在任何需要支持物的方法中或可以使用支持物进行的方法中作为可溶性支持物的用途，例如用于合成方法或分子生物学和生物化学测定。用于合成方法或分子生物学和生物化学测定。用于合成方法或分子生物学和生物化学测定。

技术研发人员：

I

受保护的技术使用者：

辛希克斯

技术研发日：

2021.05.12

技术公布日：

2023/3/24