人胆道癌细胞系及应用

本发明属于微生物动物细胞系领域，具体涉及人胆道癌细胞系及应用。

尽管目前在诊断和技术方面有所进步，但是胆道癌病人生存预后性差。先前 的研究报道手术切除是该病的唯一方法，尚无有效的化疗方案用于未手术或术后复发 病人。探索该肿瘤生物学的本质对于改善胆道癌病人的预后性极为重要。与此同时，目前在 胆道癌效果不佳的现状，其中一个主要原因是缺乏完善的体外培养体系。然而目前体 外培养的肿瘤细胞系在肿瘤发生、发展、侵袭、转移机制和早期诊断、评价等许多领域 的研究中起着不可替代的作用。

本发明的第一个目的在于，针对目前国内缺乏中国人来源的胆道癌细胞系，尤 其是可应用于免疫裸鼠成瘤的人胆道癌细胞系，而提供了该类型的来源于中国人胆道癌 细胞系。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

人胆道癌细胞系，包括：分别命名为人胆囊癌细胞系ZJU-0430、人肝门部胆管癌细 胞系 ZJU-0826和人肝门部胆管癌细胞系ZJU-1125，且保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号分别为：CCTCC NO:C2017174、CCTCC NO:C2017175和CCTCC NO:C2017176 的人胆道癌细胞系。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术 方案：

优选地，所述人胆道癌细胞系还包括：分别命名为人胆囊癌细胞系ZJU-0430、人肝 门部胆管癌细胞系ZJU-0826和人肝门部胆管癌细胞系ZJU-1125，且保藏于中国典型培养物 保藏中心，保藏编号分别为：CCTCC NO:C2017174、CCTCC NO:C2017175和CCTCC NO: C2017176的人胆道癌细胞系的子代细胞系。

优选地，所述人胆道癌细胞系在体外培养时，光镜下为典型的多边形上皮样细胞， 电镜下为典型的恶性上皮特征。

优选地，所述人胆道癌细胞系在胆道癌临床诊断为腺癌，裸鼠移植瘤病理显示也 为腺癌；核型分析结果显示其在染体数目和结构上均出现异常。

优选地，所述人胆道癌细胞系在化疗药Gemcitabine(吉西他滨)抑制实验中，仅人 肝门部胆管癌细胞系ZJU-0826对Gemcitabine在高浓度下有部分抑制效果。

优选地，所述人胆道癌细胞系在支原体检测试剂盒检测时，PCR结果为阴性，均未 受到支原体污染；核型分析结果为人胆囊癌细胞系ZJU-0430染体数目为70-74、人肝门部 胆管癌细胞系ZJU-0826染体数目为77-80和人肝门部胆管癌细胞系ZJU-1125染体数目 为 58-69。

本发明的第二个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供人胆道癌细胞系的 应用。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

根据前面所述人胆道癌细胞系在胆道癌发病机制研究的细胞模型中的应用。

本发明还有一个目的在于，针对现有技术中存在的不足，提供一种人胆道癌细胞 系的用途。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种人胆道癌细胞系的用途，根据前面所述人胆道细胞系ZJU-0430和ZJU-1125用 于制备在免疫缺陷哺乳动物中产生胆道癌的模型，成瘤率为100％。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术 方案：

优选地，所述免疫缺陷哺乳动物为免疫缺陷裸小鼠。

本发明的人胆道癌细胞系中人胆囊癌细胞系ZJU-0430人来源于一例胃癌和胆囊 癌69岁男性患者手术切除的胆囊癌组织标本、人肝门部胆管癌细胞系ZJU-0826来源于从一 例66岁女性患者手术切除的肝门部胆管癌组织标本和人肝门部胆管癌细胞系ZJU-1125来 源于从一例肝门部胆管癌57岁女性患者手术切除的肝门部肿瘤组织标本。经原代培养并建 系成功后，分别命名为ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125。

本发明的人胆道癌细胞系ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125细胞体外生长活力高， 细胞多呈扁平不规则多边形，呈贴壁单层生长，胞浆内常可见空泡；细胞经过冻存复苏后仍 具有良好的活力；上述细胞系目前均已传代110代左右，已能永生化。

本发明的人胆道癌细胞系ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125细胞系及其子代细胞系 的细胞倍增时间分别约为24h，24h，48h。核型结果分析显示：染体数目和结构均出现异 常，染体数目大多分布在58-80之间，结构异常包括染体增加、缺失和易位等；光镜下显 示细胞核分裂相明显活跃，胞核大，核浆比例增大，可见巨核细胞；电镜下典型上皮特征，可 见桥粒、微丝、丰富细胞器(线粒体、核糖体及粗面内质网)和核质比大。

本发明的人胆道癌细胞系采用目前最权威的检测方法为ATCC(美国模式培养物集 存库， American type culture collection)推荐的STR(短串联重复序列，Short Tandem Repeat)检测法，检测结果确定三个人胆道癌细胞系均是人源的；与ATCC和DSMZ两个全球最 著名的培养物保藏机构中的细胞遗传信息进行比对，发现均未受到其他细胞污染。

本发明的人胆道癌细胞系对化疗药Gemcitabine敏感性检测，发现人肝门部胆管 癌细胞系 ZJU-0826随着药物浓度的提高，细胞部分发生死亡；而另外两种细胞系人胆囊癌 细胞系 ZJU-0430和人肝门部胆管癌细胞系ZJU-1125活力均没有影响。

本发明的人胆道癌细胞系成瘤实验结果发现，所建立的细胞系除ZJU-0826外在裸 鼠体内均具有良好的体外成瘤性。通过将一定数量的上述人胆道癌细胞系ZJU-0430和ZJU- 1125细胞接种于裸小鼠的皮下，建立了胆道癌的动物模型。

本发明提供了所述的胆道癌细胞系的子代细胞，所述的子代细胞基本或全部保留 了亲代细胞的特性。

本发明又提供了所述的人胆道癌细胞系在作为胆道癌发生机理研究的细胞模型 中的应用。由于本发明的人胆道癌细胞系ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125是从中国人来源 建立的，且建系时间较短，生物遗传性状稳定，以该胆道癌细胞系作为研究模型，对于了解 中国人的原发性胆道癌的发病机制有很大帮助。

再一方面，本发明提供了一种胆道癌样本组织中建立不同病人来源的胆道癌细胞 系的制备方法，包括以下步骤：

(1)标本采集及保存的方法：确定肿块在切除的胆道组织中的位置，肿瘤组织取自 瘤体增生活跃的表层部分。标本的采集均在病理科医师指导下进行，防止对病理报告的诊 断产生影响；当标本暂不做后续操作时，可将其保存在4℃RPMI 1640中，一般可放置24h左 右。

(2)原代培养：组织经PBS洗涤三次，机械剪碎，胶原酶消化，离心及洗涤，接种及传 代培养和观察培养。

(3)纯化细胞：采取多次胰酶-EDTA差速消化获得肿瘤细胞，具体为待细胞近汇合 时，丢弃培养基，PBS洗涤三次，加入胰酶-EDTA消化液，镜下观察上皮细胞和成纤维细胞在 胰酶消化后的变化，成纤维细胞对胰酶较敏感，待长梭形变椭圆形甚至圆形时，加入含血清 的新培养终止消化。

(4)如果镜下观察还有成纤维细胞可行多次消化去除成纤维细胞。

图1为人胆道癌细胞系ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125细胞的光学显微镜图；

图2为人胆道癌细胞系ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125细胞的透射电镜图；

图3为人胆道癌细胞系ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125细胞的细胞生长曲线图；

图4为人胆道癌细胞系ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125支原体检测；

图5为人胆道癌细胞系ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125细胞对化疗药Gemcitabine 敏感性实验；

图6为人胆道癌细胞系ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125代表性单细胞的核型分析；

图7为人胆道癌细胞系ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125STR鉴定图；

图8为人胆道癌细胞系ZJU-0430和ZJU-1125细胞的成瘤试验。

参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述。

实施例1

从一例胃癌和胆囊癌69岁男性患者、一例肝门部胆管癌66岁性患者和一例肝门部 胆管癌57岁女性患者原位肿瘤组织中取样，剔除坏死和脂肪等组织，用含双抗的生理盐水 洗3次。将组织置入无菌培养皿中，组织块表面滴加少许胶原酶消化液，用不同的无菌眼科 小剪刀充分剪碎至体积约1-2mm3大小；将剪碎的肿瘤组织用胶原酶消化液收集后置于15ml 离心管中，加入一定量的消化液，并放入37℃CO2培养箱中消化过夜；消化过夜的标本组织 及细胞悬液离心(300×g，7min)，弃去上清，再用生理盐水洗涤离心3次；RPMI 1640+10％ FBS+ 双抗重悬沉淀置于培养皿中，置入37℃CO2培养箱培养，至少2天内不要移动培养皿， 利于原代肿瘤细胞贴壁；待细胞在皿中长至70-80％时丢弃培养基，PBS洗涤3次，加入1-2ml EDTA-胰酶，镜下观察，待长梭形成纤维细胞变椭圆形甚至圆形时，加入含血清的新培养终 止消化，放入培养箱继续培养。次日。镜下观察是否还有成纤维细胞存在，如有可进行多次 EDTA-胰酶消化。建系成功后，分别命名为人胆囊癌细胞系ZJU-0430、人肝门部胆管癌细胞 系ZJU-0826和人肝门部胆管癌细胞系ZJU-1125，于2017年9月30日保藏于中国典型培养物 保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号分别为：CCTCC NO: C2017174、CCTCC NO:C2017175和 CCTCC NO:C2017176。其细胞形态如图1，图1中：A: ZJU0430；B:ZJU-0826；C:ZJU-1125。

实施例2

样品准备：将1×107个培养的ZJU-0430，ZJU-0826和ZJU-1125细胞胰酶消化后收 集于 15ml离心管中，离心收集细胞后再次洗涤离心收集；

固定：向细胞中加入2.5％戊二醛固定液固定2h，0.1M磷酸缓冲液洗涤3次，加入 1％饿酸固定液固定2h，0.1M磷酸缓冲液洗涤3次；

脱水：在4℃冰箱内进行分别50％乙醇→→70％乙醇→→90％乙醇→→90％乙醇+ 90％丙酮(1:1)→→90％丙酮→→100％丙酮(3次)，每道工序维持15-20min；

包埋：纯丙酮+包埋液(2:1)室温3-4h→→纯丙酮+包埋液(1:2)室温过夜→→纯包 埋液37℃2-3h；

固化：37℃烘箱过夜→→45℃烘箱12h→→60℃烘箱24h；

超薄切片制备：用超薄切片机切取50-60nm厚度切片；

染：3％醋酸铀-枸橼酸铅双重染；

观察拍片：用透射电镜(日立HT7700)观察及拍片。

结果如图2所示，胞浆内可见丰富细胞器(线粒体、核糖体及粗面内质网)，细胞链 接之间可见桥粒，细胞质内微丝，凹陷的核膜和微绒毛样突起。图2为细胞透射电镜照片，图 2 中：A,B:ZJU0430；C,D:ZJU-0826；E,F:ZJU-1125。

实施例3

将培养的ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125细胞胰酶消化后，重悬于RPMI 1640+ 10％FBS 培养基中并进行计数，经浓度调整后获得终浓度为2.5×104/ml和5×104/ml的细 胞悬液；将其分别接种在96孔板中，每孔200μl,每组设6个复孔，只加培养基的孔作为空白 对照；将培养板放入37℃培养箱中培养，于0、12、24、36、48、60和72h时间点加入CCK-8孵育 2.5h，随后450nm处测定吸光值。结果如图3所示，体倍增时间分别约为：24h，24h和48h，图 3中：A:ZJU0430；B:ZJU-0826；C:ZJU-1125。

实施例4

对生长出癌细胞需要同时进行支原体感染情况的检测，本研究采用的是PCR法，利 用杭州华安生物公司的支原体PCR检测试剂盒(HuaAn PCR Mycoplasma Test Kit)，可同时 检测常见的48种支原体，步骤如下：

1.试剂盒组成：

①PCR反应液400μl(20μl/次，20次反应)

②Taq酶20μl(1μl/次，20次反应)

③DNA释放液1000μl(40μl/次，25次反应)

④DNA阳性对照1管(冻干粉末)

⑤液体石蜡1000μl

⑥使用说明书1份

2.样本收集及处理：

①收集细胞：将生长至近汇合的人胆道癌细胞系ZJU-0430，ZJU-0826和ZJU-1125 上皮细胞分别用细胞刮刀从培养皿中刮落，将含癌细胞的培养液分别移至15ml离心管中；

②离心：将以上细胞悬液离心(12000rpm，5-l0min)；

③提取DNA：去上清，加入DNA释放液40μl，移入2ml EP管中，充分吹打，煮沸5min；

④再次离心(12000rpm，5～l0min)，取上清作为PCR反应样品模板备用。

3.配制PCR反应试剂：

①阳性对照准备：将DNA阳性对照粉末小瓶先在离心机上离心(5000rpm，5min)，再 打开瓶盖加入25μl去离子水，充分溶解，备用；

②配制PCR反应液：从-20℃冰箱中取出PCR反应液，3个重复检测样品加上阳性对 照(阳性DNA)和阴性对照(PBS)共应配制5个反应液，取PCR反应液l00μl，加入5μl Taq酶。一 次性配制所需反应体系，保持PCR反应的均一性。

③充分混匀PCR反应液和Taq酶，并以21μl/管分装至5个PCR反应管中；

④5个PCR反应管中各加入4μl备用样品(3个重复管)、DNA阳性对照及PBS阴性对 照；

⑤将PCR反应管离心(10000rpm，l0s)。

4.PCR反应及参数设置：将PCR反应管放入PCR仪，按以下参数进行PCR反应：

5.PCR产物的电泳检测：

①1×TAE缓冲液配制：取l ml 50×TAE电泳缓冲液加入49ml去离子水；

②2.0％琼脂糖凝胶制备：称取1.09g琼脂糖于三角烧杯中，加入50ml l×TAE；

电泳缓冲液，微波炉溶化琼脂糖，稍冷后加入5μl GelRed核酸染料，倒入凝胶模 中，冷却凝固，备用；

③上样：每个PCR管取8μl PCR扩增产物，加入琼脂胶板的胶孔中，扩增产物包含溴 酚蓝指示剂；

④电泳：110V电泳20min后根据溴酚蓝指示剂停止电泳。

6.凝胶成像分析：将电泳后的胶板取出放入Bio-Rad凝胶成像分析仪中观察并拍 照保存，出现与阳性对照相同的条带即为支原体阳性样本。如图4中所示，与阳性和阴行对 照相比，所建立的人胆道癌细胞系ZJU-0430，ZJU-0826和ZJU-1125均未受支原体污染。

实施例5

细胞准备：将培养的原代胆道癌细胞ZJU-0430、ZJU-0826和ZJU-1125用胰酶消化 后悬浮于RPMI l640培养液中并进行计数，经浓度调整后获得终浓度为2.5×104/ml的细胞 悬液；

细胞接种：将以上浓度的细胞悬液分别接种到96孔板中，每孔0.2ml(含5000个细 胞)，每组6个复孔，只加培养液不含细胞的孔作为空白对照；

化疗药处理：待接种细胞贴壁后对每组分别加入适量的化疗药Gemcitabine，设置 不同浓度为10-3μM，10-2μM，10-1μM，1μM，10μM，102μM，103μM，放入培养箱中继续培养24h；

CCK-8检测：在特定的处理时间后分别对以上每组细胞用CCK-8(1:10稀释，37℃孵 化2.5h) 进行活性检测，并记录每组细胞在450nm的吸光度值，利用Gradpad软件绘制曲线。 结果如图5所示，不同浓度的化疗药Gemcitabine能部分抑制人肝门部胆管癌细胞系ZJU- 0826增殖，但对人胆囊癌细胞系ZJU-0430和人肝门部胆管癌细胞系ZJU-1125均没有明显抑 制作用。

实施例6

①向指数生长期的三株胆道癌细胞培养液中加入秋水仙素(终浓度为0.05mg/ml) 作用6 h；

②弃去培养液后洗涤并用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤离心后将细胞收集于15ml 离心管底部；

③低渗处理：加入已于37℃水浴锅中充分预热的低渗KCl溶液(0.075mol/L)4- 5ml，于37℃水浴中作用20min，充分膨胀细胞；

④预固定：于上述低渗液中直接加入l ml新鲜配制的固定液(甲醇：冰醋酸，3：l，V /V)，轻轻吹打均匀，固定5min后离心(1500rpm，10min)，弃上清；

⑤再固定：加入6-8ml新鲜配制的固定液，常温固定30min；

⑥吹片：将以上标本离心后再加5-6滴固定液，试取1滴，滴在4℃蒸馏水玻片上，在 酒精灯火焰上迅速烘烤并吹片；

⑦Giemsa染：将吹好的以上玻片表面滴加适量Giemsa工作液染10-15min，自 来水冲洗玻片后自然晾干即得到中期染体标本。

图6为ZJU-0430，ZJU-0826，ZJU-1125细胞代表性单细胞的核型分析。(A)ZJU-0430 第45 代单细胞代表性的核型；(B)ZJU-0826第67代单细胞代表性的核型；(C)ZJU-1125第87 代单细胞代表性的核型。核型图谱显示均在染体数目和结构上所建立的三株细胞均出现 异常，染体数为亚三倍体核型，大多分布在65-80之间，结构异常包括染体增加、缺失和 易位等。

实施例7

1.ZJU-0430，ZJU-0826和ZJU-1125细胞样本准备：

a.将培养的ZJU-0430，ZJU-0826和ZJU-1125细胞胰酶消化后悬浮于PBS中并进行 计数，经浓度调整后获得终浓度为2×106/ml的细胞悬液；

b.取上述细胞悬液0.2ml,加到FTA标本采集卡的圆圈中，在超净台中风干；

c.用Harris打孔器于圆圈中央取1.2mm直径的FTA卡样品，备用。

2.使用18D试剂盒进行DNA扩增：

1mlD 5×Master Mix

1ml18D 5×Primer Pair Mix

25μl 2800M Control DNA,10ng/μl

5×1,250μl Water,Amplification Grade

a.扩增后试剂盒组份(米黄盖)：

50μl18D Allelic Ladder Mix

2×150μl CC5Internal Lane Standard 500

b.按下表在MicroAmp 96孔反应板中配置18D系统扩增混合液；

c.将备用的1.2mm直径的FTA卡样品加入到96孔反应板中样本孔内；

d.设置扩增的阳性对照和阴性对照：将2800M Control DNA稀释到5ng/μl,取1μl 的 DNA稀释液加入到含有25μl PCR扩增反应液的反应孔中作为阳性对照，制作1.2mm直径 的空白FTA卡片作为阴性对照，可用来检测打孔装置有无交叉污染。

e.在PCR system 9700热循环仪上设置如下扩增热循环参数：

f.使用ABI3500×1型遗传分析仪检测分析扩增片段；

g.在1D-X分析软件中导入步骤3中的片段数据进行分析；

h.将以上分析结果E-mail到ATCC(STRtesting@atcc.org)进行鉴定分析；

i.ATCC出具种属鉴定检测报告。

如图7所示，STR检测结果证实新建立的三株胆道癌细胞系：人胆囊癌细胞系ZJU- 0430，人肝门部胆管癌细胞系ZJU-0826和人肝门部胆管癌细胞系ZJU-1125，与ATCC和DSMZ 两个全球最著名的培养物保藏机构中的细胞遗传信息进行比对，发现均未受到其他细胞污 染。ATCC number:STRA6989,STRA6988，STRA6986；图7中：A-D:ZJU-0430；E-H:ZJU-0826；I- L: ZJU-1125。

实施例8

1.细胞准备：将指数生长期的三株胆道癌细胞胰酶消化后离心(800rpm，5min)后 用无血清培养基洗涤离心3次；

2.将细胞重新悬浮于PBS缓冲液中，计数调整细胞密度为5×107/ml；

3.将0.2ml的以上细胞悬液(含约1×107个细胞)注射到4-6周的BABL/c小鼠背部 皮下 (n＝3)，小鼠饲养于SPF级的层流间内；

4.观察4周，每周触诊并测量瘤体直径大小；

5.4周后将小鼠安乐死，取出瘤体测量拍照，取部分瘤体浸泡于10％福尔马林溶 液，进行常规石蜡包埋及切片制作，备用。

如图8所示，ZJU-0430和ZJU-1125在BABL/C裸鼠上均成瘤，且随着接种时间的延 长，移植瘤瘤体体积逐渐增大，病理检查显示均为腺癌，而ZJU-0826不成瘤，图8中：A:ZJU- 0430,B: ZJU-1125。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，仅为本发明的优选实施例，而不是对本 发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改、等同 替换、改进等，都落入本发明的保护范围。