高效低毒人肿瘤坏死因子

本发明涉及一种突变的人肿瘤坏死因子(Human Tumor Necrosis Factor－α，简称hTNF－α)。它是用蛋白质工程和重 组DNA的方法将hTNF－α的第二位精氨酸(Arg)突变为赖氨酸(Lys) 而获得的，命名为[Lys2]hTNF－α。在大肠杆菌中表达的[Lys2] hTNF－α具有高比活、低毒性的特点，对某些人肿瘤细胞表现出 高效的特异抑制活性，这一新型的重组人肿瘤坏死因子对某些肿 瘤病人有实际的效果。

人肿瘤坏死因子(hTNF－α)的最显著特征是能够选择性地杀 伤或抑制肿瘤细胞，尤其是和干扰素等联合使用时能发挥出很好 的效果。这一特性是其他细胞因子无可比拟的。然而，hTNF－α 的临床试验结果不尽人意，主要是毒副作用太大，一般认为hTNF －α对肿瘤病人的有效剂量是病人最大耐受剂量的5－25倍。

为了减轻hTNF－α对肿瘤病人的毒副作用，更好地发挥hTNF －α癌症病人的作用，通常的作法是用蛋白质工程的方法改 造hTNF－α，以期获得高效、低毒的hTNF－α突变体。hTNF－α 的N末端1－7个氨基酸是自由的或无构象的。已有地报道对hTNF －α的N－末端改造，主要是在N－末端缺失或延长方面，例如， 在N－末端缺失1－7个氨基酸或延长4个氨基酸等(例如：中国专利 审定号CN1016967B)。

本发明则是在N－端第二位氨基酸处进行突变而得到的新型 的hTNF－α突变体。实现这一突变的基本过程是：通过DNA合成仪 合成一个突变引物，该引物将编码hTNF－αN－末端第二位精氨 酸密码子CGT突变为编码赖氨酸的密码子AAA，用聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction，简称PCR)改造了hTNF－α基因， 将突变后的基因插入表达载体pKKH中，使该基因直接置于Ptoc启动 子控制之下，转化大肠杆菌71/18，转化菌在37℃培养16－20小 时，使[Lys2]hTNF－α基因在大肠杆菌中获得高效表达，[Lys2] hTNF－α的表达量占细菌总蛋白量的40％。菌体经离心后，用超 声波破碎细胞，离心后上清用硫酸铵盐析，沉淀物透析后先过阴 离子柱，再过阳离子柱，最后过一次分子筛，即可得高纯度的[L ys2]hTNF－α。

在以下实施例中对发明作进一步的详细描述：

图1是[Lys2]hTNF－α表达载体的构建示意图。

图2是[Lys2]hTNF－α的DNA序列和氨基酸序列图。

图3是[Lys2]hTNF－α在大肠杆菌中表达后的SDS－聚丙烯酰 胺凝胶电泳图谱。其中：1.标准蛋白质分子量对照；2.阴性对照 (E·coli 71/18)；3－8.分别为37℃培养10、12、14、16、18、 20小时。

图4是[Lys2]hTNF－α的纯化电泳图谱。其中：1.标准蛋白质 分子量对照；2.菌体裂解后直接走电泳；3.硫酸铵盐析后；4.阴 离子柱(DEAE)纯化后；5.阴离子柱(CM)纯化后；6.分子筛(S－200 纯化后。

实施例1，[Lys2]hTNF－α表达载体的构建。

参见图1、图2，在DNA合成仪上，选择大肠杆菌偏爱的密码 子及适当提高hTNF－α基因(该基因由南京大学朱德熙教授惠赠) 5’端突变引物中的嘌呤比例，设计并合成了hTNF－α基因的5’端 突变引物(5’－AGCCATGGTAAAATCTAGCTCTCGCACTCCATCTGACAAACCA －3’)，另一端为噬菌体M13通用引物，模板为含hTNF－α基因的 pUC19质粒，用聚合酶链反应(反应条件：变性，94℃60秒；复性， 52℃60秒；延伸，72℃90秒)改造hTNF－α基因，PCR产物用1％低 熔点胶回收后，用限制性内切酶NcoI和BamHI酶切，克隆进用同 样的限制性内切酶酶切的表达载体pKKH中，转化大肠杆菌71/18。 转化子(E·coli 71/18/pKKH-TK，存放标记为CCTCC NO：M94037 中国·武汉·武汉大学校内·中国典型培养物保藏中心)用碱裂 解法抽取质粒，用NcoI和BamHI酶切质粒后，走6％的聚丙烯酰胺 凝胶电泳鉴定，能切出500bp大小片段的质粒进一步用Sanger双脱 氧末端终止法测定基因序列。

实施例2，[Lys2]hTNF－α在大肠杆菌中的表达、纯化和鉴 定。

参见图3、图4，将含目的基因(即突变后的基因)的转化子在 37℃培养过夜，取一小部分细胞培养液离心后，菌体加样品缓冲 液，走15％SDS－PAGE鉴定[Lys2]hTNF－α的表达量，另一部分细 菌离心5分钟(5000转/分)收集菌体，按5－10g湿菌加100mlPBS缓 冲液(pH7.4)超声破碎细胞后，离心10分钟(15000转/分)取上清， 加固体硫酸铵至40％饱和度，冰浴静置2－4小时，离心10分钟 (15000转/分)去除沉淀杂蛋白，上清继续加固体硫酸铵至65％饱 和度，4℃静置过夜，离心10分钟(15000转/分)，收集硫酸铵40 －60％饱和度沉淀组分，对20mMTris-HCl(pH8.0)透析除盐，中途 更换透析液2－3次，上DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子柱，用 含20mMNaCl的20mMTri-HCl(pH8.0)充分平衡柱后，以NaCl盐梯度 (0.02－0.35M)线性梯度洗脱，收集[Lys2]hTNF－α洗脱峰，加固 体硫酸铵置665％饱和度，冰浴静止4小时后，离心10分钟(15000转 /分)，收集沉淀对磷酸缓冲液(pH5.9)透析除盐，上CM-Sepharose Fast Flowy阳离子柱，用磷酸缓冲液充分平衡柱后，用NaCl盐梯 度(0－0.4M)线性梯度洗脱，收集[Lys2]hTNF－α洗脱峰，走分 子筛Sephacryl S－200HR柱，用PB(pH7.4)洗脱，即可得纯度 大于95％的[Lys2]hTNF－α。

实施例3，[Lys2]hTNF－α及hTNF－α的活性测定。

96孔细胞培养板每孔接2×104个L929细胞，37℃，5％CO2培 养箱中培养过夜，加不同稀释度的[Lys2]hTNF－α或hTNF－α及 放线菌素D(终浓度为1ug/ml)，37℃，5％CO2培养箱继续培养16个小 时，结晶紫染，570nm处读光密度值，以杀伤50％L929细胞时的 稀释度为一个活性单位，测得[Lys2]hTNF－α的比活为6.9(±0.5) ×107单位/毫克蛋白，hTNF－α的比活为1.5(±0.5)×107单位/ 毫克蛋白，[Lys2]hTNF－α比hTNF－α的比活高4倍还多。

实施例4，[Lys2]hTNF－α及hTNF－α对人体肿瘤细胞株的 抑制作用。

肿瘤细胞株为：M₇₉₀₆人体结肠癌细胞株，MGC人体胃癌细胞株，
L_AX人体的肺腺癌细胞株，OS人体骨肉瘤细胞株，SPC人体小细胞
肺癌细胞株。取靶细胞以1×10⁴细胞/孔的浓度加入到96孔细胞
培养板中，再加入不同浓度的[Lys²]hTNF－α或hTNF－α，37℃，
5％CO₂培养箱培养24小时后，加入H³－TdR0.5微居里/孔，用多头
细胞器收集细胞，液闪仪上测定CPM值，计算肿瘤细胞抑制率(表1)

表1－A不同浓度的[Lys²]hTNF－α对人体肿瘤细胞的抑制作用

表1及以后出现的表格中，rTNF－α即[Lys2]hTNF－α，对 照组则用生理盐水。

从表1中可见，[Lys2]hTNF－α对MGC，LAX细胞随着药物浓度 的变化而有不同程度的抑制作用，在0.05－0.5ug/ml浓度下已表 现出明显的抑制作用，而在相应条件下无明显的抑制作用，另外 还可看出[Lys2]hTNF－α的抗癌谱发生了变化。

实施例5，[Lys2]hTNF－α及hTNF－α对小鼠肿瘤细胞株的 抑制作用。

靶细胞为：小鼠白血病L1210细胞，小鼠白血病P388细胞，小鼠 黑素瘤B16，小鼠Ehchich(Ec)腹水癌细胞，小鼠YAC－1细胞， 方法完全同人体肿瘤细胞株(见表2)。从表2可见，[Lys2]hTNF－ α对小鼠肿瘤细胞L1210，P388，B16，Ec，YAC－1的增殖均有不同程 度的抑制作用，其中以B16，YAC－1，Ec较为明显。hTNF－α虽 然对这些肿瘤细胞也有一定的抑制作用，但不及[Lys2]hTNF－α 强。 表2－A不同浓度的[Lys2]hTNF－α对小鼠肿瘤细胞的抑制作用

实施例6，[Lys2]hTNF－α及hTNF－α对小鼠移殖性肿瘤Ec 白血病的抑瘤效果。

取生长旺盛的小鼠Ec腹水癌，用生理盐水1∶3稀释后给每只
DBA/2小鼠腹腔接种0.2ml/鼠，随机分为给药组及对照组，次日
起每日腹腔给药1次，共5次，观察并记录动物死亡时间，计算小
鼠生命延长率，并与对照组进行比较(表3)。

实验证明，[Lys2]hTNF－α0.25－2ug/鼠对小鼠移殖性肿瘤 Ec腹水癌有一定的疗效，并随着剂量的增加抑制作用明显，而 hTNF－α则效果较差。 表3不同剂量的[Lys2]hTNF－α与hTNF－α对小鼠Ec白血病肿 瘤细胞的抑制作用比较： 表3