金龟子绿僵菌IPPMHB614及其应用

本发明属于蝗虫治理技术领域，具体涉及一种金龟子绿僵菌IPPMHB614及其应用。

我国是世界上蝗灾发生最为频繁的国家之一，严重影响人们的生活质量和生存条件。东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)是一种暴发性的农业害虫，数量大，迁徙性强，容易形成蝗灾，给农业生产带来严重威胁。目前蝗虫的控制主要采用化学防治方法。化学农药的大量使用，致使蝗虫的抗药性逐步提高、增加了治理成本和难度，带来严重的农药残留和环境污染，农残超标率居高不下，导致一系列严重的食品和生态安全问题。因此，开发环境友好、可持续的生物防治药剂已成首要任务。

昆虫病原真菌是一类最大的在自然界中控制昆虫种的病原微生物，对作物和人类安全，不污染环境，常常具有流行潜力，并且害虫不易产生抗性，是国内外生物防治研究的重点。绿僵菌是最早用于防治蝗虫的微生物之一，具有多种不同的菌株类型，是一类广谱的昆虫病原菌。绿僵菌能够寄生于多种害虫，至今全世界已经发现约有200多种昆虫能被绿僵菌感染致死，具有生产方法简单、安全，对寄主有专一性、触杀性、致死率较高等优点。目前，绿僵菌已经在金龟子、蝗虫、椰心叶甲、蟑螂、白蚁等害虫防治中发挥重要作用。东亚飞蝗对于普通绿僵菌抗性较强，防治东亚飞蝗的效果不明显，急需筛选一株较强杀灭东亚飞蝗的绿僵菌，达到实际应用效果，为东亚飞蝗生防制剂的研制提供参考。

本发明的目的在于提供一种金龟子绿僵菌IPPMHB614及其应用。

一种金龟子绿僵菌IPPMHB614，其特征在于，所述绿僵菌IPPMHB614已于2019年12月11日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.19035，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

所述金龟子绿僵菌IPPMHB614在防治东亚飞蝗中的应用。

本发明的有益效果：本发明主要开展绿僵菌菌株对东亚飞蝗的杀虫活性测定，并通过对菌株的酶活分析，确定不同菌株的酶活力强弱，筛选出高效侵染东亚飞蝗的绿僵菌菌株，为东亚飞蝗生防制剂的研制提供参考。

图1为不同菌株生长速度。

图2为不同菌株的产孢量。

图3为不同菌株对东亚飞蝗的控制效果。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1

1.东亚飞蝗的饲养

1.1东亚飞蝗的孵化

孵化时，将保存在4℃冰箱里的卵块取出，卵粒放在盛有2/3灭菌蛭石(含水为55％，以用手捏时不出水、不成块、沙呈松散状为宜)的塑料孵化盒中进行孵化。孵化温度29℃，光照2000Lux以上，湿度控制在60％的范围内。

1.2蝗蝻的饲养

蝗蝻孵出后用毛笔挑出，放在笼罩内饲养。每天喂食新鲜小麦。待生长至3龄蝗蝻时，挑取健康活泼个体作为供试虫进行试验。

2.金龟子绿僵菌的培养

2.1培养基配方

PDAY培养基：土豆200g、蔗糖20g、酵母粉5g、琼脂18g、水1000ml。

2.2绿僵菌菌株的培养

实验所用菌株包括：IPPM2028E05、IPPM2028E37、IPPM2028E13、IPPM2028E24、IPPM2028E33、IPPMHB614、IPPM3003、IPPM0027、IPPM3013-3、IPPMB084

挑取菌株的孢子粉于吐温水中，用震荡仪打散孢子。然后用移液吸取100μl孢子液于平板上，用涂布棒涂布均匀，放到25℃培养箱中培养。7、8天后将培养皿从培养箱中拿出，放置在低温条件下，使培养基里的水分蒸发，便于刮取孢子粉，刮取的孢子粉放入4℃冰箱低温保存。

挑单菌落接种于PDAY平板后，从接种后的第7大开始，游标卡尺每天测量1次菌落纵横两个方向的直径，取其平均值，计算每日菌落生长直径，并计算生长速度，比较其差异。每个菌株接种三皿，重复三次。

表1 不同菌株的生长速度

菌株 日均生长量(mm/d) IPPM2028E05 3.44±0.01 IPPM2028E37 3.54±0.04 IPPM2028E13 3.34±0.03 IPPM2028E24 3.53±0.04 IPPM2028E33 3.62±0.04 IPPMHB614 4.16±0.07 IPPM3003 3.84±0.22 IPPM0027 3.83±0.02 IPPM3013-3 3.69±0.01 IPPMB084 3.80±0.07

不同菌株在真菌培养基PDAY上的生长速度试验结果表明，IPPMHB614生产速度最快，显著高于其它菌株，为4.16mm/d；其次为IPPM3003和IPPM0027，生长速度分别3.84mm/d、3.83mm/d；IPPM2028E13的生长速度最慢，为3.34mm/d(表1、图1)。

用内口直径φ＝5.00mm的打孔器在生长15d的菌落正中取一菌块，置于含5ml0.1％Tween-80溶液的试管中，旋涡振荡仪充分振荡打散，稀释10倍，在光学显微镜下用血球计数板计数，测定孢子浓度，比较各菌株之间的差异。每个菌株接种三皿，重复三次。

表2 不同菌株的产孢量

菌株 产孢量(10⁸sp/cm²) IPPM2028E05 1.41±0.23 IPPM2028E37 1.45±0.13 IPPM2028E13 1.44±0.21 IPPM2028E24 1.48±0.12 IPPM2028E33 1.53±0.21 IPPMHB614 2.05±0.13 IPPM3003 2.13±0.12 IPPM0027 1.91±0.31 IPPM3013-3 1.58±0.11 IPPMB084 1.72±0.20

对以上的10个菌株进行产孢量的测定，结果发现各菌株产孢量介于1.41～2.13×108sp/cm2之间。其中IPPM3003的产孢量最高，为2.13×108sp/cm2、其次是IPPMHB614，为2.05×108sp/cm2，但是二者之间差异不显著。菌株IPPM2028E05的产孢量最低，为1.41×108sp/cm2(表2、图2)。

实施例2不同绿僵菌菌株对东亚飞蝗杀虫活力测定

饵剂配置：麦麸(100℃干热灭菌1h)2g、菌株孢子粉0.1g、大豆油200μl；先将麦麸与大豆油放入灭菌的培养皿中拌匀，再加入孢子粉拌匀，分3等份，分别放入培养皿中，备用。

采用饵剂饲喂法测定不同菌株对东亚飞蝗的毒力，每个菌株重复3次。

在室内利用东亚飞蝗3龄幼虫进行生物测定来筛选高毒力菌株。用84消毒液处理生测筐(37×25×16cm)，晾干。在每个生测筐底部铺上一层报纸，每筐放入15头大小一致的3龄幼虫，用消毒的玻璃板盖上。将分装好的饵剂分别放入装有3龄蝗蝻的生测筐内，每个菌株重复3次，做好标记，在室温条件下培养。蝗蝻取食24小时后，将饵剂取出，及时补充麦苗。连续12天记录每筐内蝗虫的死亡数和活虫数，并将死亡的蝗虫取出进行保湿，记录僵虫率，进行数据分析。

以东亚飞蝗3龄幼虫为生测对象，测定了10个菌株的杀虫活性。接种3天后，供试幼虫开始死亡，死亡虫体出现典型的僵虫症状(虫体变红)，之后白菌丝透出死亡虫体表面，最后长出绿孢子。统计感染蝗虫12天的数据，通过LD50的BASIC程序计算致死时间与死亡率的回归方程和致死中时(LT50表3)。综合分析不同菌株的累积死亡率(表4，图3)可知，不同菌株之间的毒力存在明显差异。菌株IPPMHB614、IPPM3003、IPPM0027、IPPM2028E13的毒力较高。其中菌株IPPMHB614毒力最高，12天累计死亡率达到96.43％；其次是菌株IPPM3003和IPPM0027。

表3 不同菌株对东亚飞蝗幼虫的致死中时(LT50)

表4 不同菌株在不同时间对东亚飞蝗幼虫的累积死亡率(％)

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。