经济海藻紫菜种质资源鉴定的方法及部分DNA序列

技术领域

本发明涉及紫菜种质资源的鉴定，即经济海藻紫菜种质资源鉴定的方 法及鉴定中所用的中国沿海紫菜栽培种DNA序列。

背景技术

紫菜是重要的经济海藻，应用历史悠久。紫菜营养价值极高，历来被 人们视为海昧珍品，蛋白含量高，氨基酸种类多、数量大，维生素的含量 也很丰富，此外，还含有大量的钙、磷、铁等无机盐等，许多国家把它誉 为“保健食品”。紫菜还具有重要的药用价值。我国古代的《食疗本 草》、《本草纲目》及近代的《中国海洋生物药》中记载：紫菜味甘、 寒，清热、软坚、补胃、利水肿；主治甲状腺肿大、水肿、慢性气管炎、 湿性脚气、喉炎、麻疹等症。《中国海藻志》记载紫菜有：坛紫菜 (Porphyra haitanensis)、条斑紫菜(P.yezoensis)、半叶紫菜(P. katadai)、边紫菜(P.marginata)、圆紫菜(P.suborbiculata)和冈村紫 菜(P.okamurai)等。

大多数紫菜依据其外部形态特征较难鉴别其种类，目前主要是采外形 和显微结果观察相结合的方法。随着分子生物学的迅猛发展，一些分子标 记技术诸如随机引物扩增多态性(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性 (RFLP)和简单序列重复间区(ISSR)等已被广泛的应用于重要经济海藻的鉴 定。由于这几种标记方法稳定性和重复性不高，从而影响了鉴定的准确 性。

核糖体DNA是编码核糖体RNA的基因，在植物细胞核中以头尾相连的 方式在染体上重复排列，每个细胞中的拷贝数目在1000到10000之 间。核糖体DNA中包含了进化速率不等的编码区、非编码区和非转录区， ITS(Internal transcribed spacer)是核糖体DNA中介于18S和5.8S之 间(ITS1)以及5.8S和26S之间(ITS2)的非编码转录间隔区，目前研究显 示，18S、5.8S和26S等rDNA基因的碱基对序列非常保守，不同植物间的 差别很小；而位于植物rDNA基因间的ITS1和ITS2的碱基对序列则差异 较大。由于ITS存在于高重复的核糖体DNA中，进化速率快且片段长度不 大(在红藻中ITS1在100-400bp之间，ITS2在400-1400bp之间)，加上 协调进化(concerted evolution)使该片段在基因组不同重复单元间十分 一致，因而十分适合于植物系统发育与进化和种质鉴定的研究。尤其是近 些年来，建立在PCR基础上直接测序方法的建立和广泛应用，ITS序列分 析已成为在序列水平上对科内属间及属下种间的植物进行命名、分类、亲 缘关系确定和系统进化研究的重要手段。

发明内容

本发明地目的在于提供一种经济海藻紫菜种质资源鉴定的方法及部分 DNA序列，使结果更可靠、更准确，用特定的DNA序列对中国沿海紫菜栽 培种进行鉴别。

为实现上述目的，本发明利用rDNA ITS区DNA序列鉴别中国沿海紫 菜，所采用的方法包括如下步骤：收集藻体材料，进行品种鉴定工作；

(1)总DNA提取：取新鲜健康的藻体材料，用无菌水处理后，在液氮 种研磨成粉末，提取总DNA；

(2)PCR扩增：利用以寡核苷酸作为聚合酶链式反应(PCR)的引物， 引物的设计分别参考海藻的18S和26S保守区段，

正向引物P1：5’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’，

反向引物P2：5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’；以步骤(1)提取 的DNA为模板，对总DNA进行PCR扩增反应，扩增ITS区段；

(3)RCR产物纯化；

(4)DNA序列测定：纯化后的DNA进行序列测定(应用直接测序技 术)，确立rDNA ITS区，包括ITS1、5.8S和ITS2区的全序列；

(5)DNA序列数据分析：待分析的rDNA ITS区的序列一经测定，用对 位排列软件进行对位排列，并辅以人工校对，用系统进化分析软件分析各 样品DNA序列与数据库中各个序列间的差异。

每一个样品从DNA提取到测序至少重复3次。

所述总DNA提取为新鲜的藻体加液氮研磨成粉末后，转移到提取缓冲 液中，63-65℃水浴30-60min后用氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)抽提 一次；上清液中加10％SDS和1/3体积的4M的KAC，冰浴10-20min后再 用氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)再抽提一次，取上清液加2/3体积异丙醇 沉淀DNA；DNA溶解在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5) 中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶异戊醇(体积比24∶1)抽提一次，加 1/3体积异丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在TE中；纯化部分 DNA；

提取缓冲液的组成为：10mmol L-1 Tris.HCl，pH 8.0，20mmol L-1 EDTA，1.4M NaCl，1.5-2.5％CTAB，1-2％SDS；提取所用的KAc浓度为 4.0-5.0M，pH值范围在5.2-7.5；PCR扩增的反应液含10mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase 1U，4种dNTP各2mmol/L，两个引物各4-6mmol/L，DNA模板40-100 ng；PCR扩增的反应循环参数为95℃预变性5分钟；90℃1分钟，50- 53℃2分钟，5个循环；72℃1分钟；90℃1分钟，58-60℃1分钟， 72℃1分钟，28-35个循环；72℃延伸10分钟；所述ITS区扩增后测序 所采用的引物为，正向引物P3：5’CGTTTCCGTAGGTGAACC3’，反向引物 P2：5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’。

本发明还提供经济海藻紫菜ITS1、5.8S和ITS2扩增的特异DNA序 列，即中国沿海紫菜栽培种ITS(转录间隔区)区DNA序列，具有序列表 SEQ ID NO：1～9中任意一组碱基序列，其可应用于经济海藻紫菜种质资 源鉴定方法中。

申请人从中国沿海不同地点采集了9个样品，所有样品都经过红藻专 家鉴定。分析结果显示，几种中国紫菜的ITS序列长度在1050左右，与 Genebank中已经注册的几种紫菜(ITS1，5.8S rDNA和部分ITS2)的序列相 似度在90％左右，说明紫菜ITS序列的保守性比较强。如果单独考虑 ITS1，所测得同种紫菜在DNA水平的变异百分率范围为0.76-3.80％，紫 菜种间DNA序列的差异为0.76-9.62％；如果考虑整个ITS区(包括 ITS1、5.8S和ITS2)，同种紫菜在DNA水平的差异为2.07-3.01％，紫菜 种间DNA序列差异为2.07-8.18％。

本发明具有如下优点：

1.本发明首先提供了一种有效的提取紫菜高质量DNA的方法。

2.本发明提供了利用经济海藻紫菜的DNA序列对紫菜种质资源进行鉴 定的方法，也即利用经济海藻紫菜的ITS1及5.8S rDNA和ITS2部分或全 部DNA序列及利用该序列鉴定其种质资源的方法。

3.本发明对中国沿海紫菜的rDNA ITS区序列进行了测序，获得了 rDNA ITS(包括ITS1，5.8S和ITS2)的全序列。

附图说明

图1为采用相同的PCR反应程序用两套不同的引物扩增紫菜的ITS序 列电泳结果图。

图2为采用P1和P2为引物，用两套PCR扩增程序进行扩增电泳结果图。

具体实施方式

下面详细描述所述方法：

实施例1

(1)总DNA提取(简单高效法)

新鲜的藻体加液氮研磨成粉末，转移到提取缓冲液[10mmol L-1 Tris.HCl，pH 8.0，20mmol L-1 ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA)，1.4M NaCl，2％cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)， 1.5％sodium dodecyl sulfate(SDS)]中，65℃水浴1h后用氯仿∶异戊 醇(24∶1)抽提一次。上清液中加10％SDS和1/3体积的4M的KAC，冰浴 10min后再用氯仿∶异戊醇(24∶1)再抽提一次，取上清液加2/3体积异丙 醇沉淀DNA。DNA溶解在TE中，加入Rnase除去RNA后用氯仿∶异戊醇 (24∶1)抽提一次，加1/3体积异丙醇沉淀DNA，干燥后的DNA重新溶解在 TE中。部分DNA用北京生物发展科学与技术有限公司提供的试剂盒(商品 号MK 001-3)进行纯化。琼脂糖凝胶电泳后染显示提取的基因组DNA大 小在23Kb以上。

(2)PCR扩增

紫菜ITS区扩增的引物为P1和P2，序列如下：

P1(正向)为5’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’位于18S上，

P2(反向)为5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’，位于26S上。

PCR反应扩增反应在20μL的体系种完成，反应液含10mmol/L Tris- HCl，pH 8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，Taq polymerase 1U， 4种dNTP各2mmol/L，两个引物各5mmol/L，DNA模板约50ng。反应循 环参数为95℃预变性5分钟；90℃1分钟，50℃2分钟，5个循环；72 ℃1分钟；90℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃延伸 10分钟。以ddH2O代替模板DNA做空白对照。

(3)PCR产物纯化

PCR产物用Watson试剂盒纯化，具体操作按试剂盒使用指南进行。

(4)DNA序列测定

用BigDyeTM测序试剂盒进行测序反应，测序反应参数为：Mix 1μL，纯 化后的DNA约30-50ng，Primer 1.5pmol，buffer 1.2μL，ddH2O适 量。测序反应条件为：95℃1min，95℃30s，50℃30s，60℃4min， 总共35各循环。用ABI 310全自动测序仪上进行序列测定。

(5)DNA序列数据分析

ITS1和ITS2的起止范围参照Genbank中已经注册的部分紫菜ITS1和 5.8S rDNA序列，所得序列输入计算机后用Clustal W软件进行比对排 列，并辅以人工校对。用MEGA 2.1分析软件包分析各样品DNA序列之间 的差异(同种间核苷酸序列碱基差异率一般应小于4％)。

实施例2

用1g新鲜的紫菜，采用CTAB法、SDS法和申请人提供的简单高效法 分别提取基因组DNA。

CTAB法：新鲜的藻体加液氮研磨成粉末，转移到提取缓冲液[5％ cetyltrimethyl ammonium bromide(CTAB)，100mmol Tris-HCl(pH 8.0)， 100mm EDTA(pH 8.0)，1.4mol NaCl，1％PVP]中，65℃水浴1h后加蛋 白酶k，再用氯仿抽提。向上清液中加2倍体积95％冷乙醇将DNA沉淀下 来，洗涤风干后溶于TE中。加入Rnase以除去RNA，用氯仿抽提一次后用 异丙醇沉淀，得到的DNA重新溶解在TE中备用。

SDS法：新鲜的藻体加液氮研磨成粉末，转移到提取缓冲液[100mmol L-1 Tris.HCl，pH 8.0，50mmol L-1 ethylenediaminetetra-acetic acid (EDTA)，0.2M NaCl，1％Proteinase K(20mg/ml)，1％sodium dodecyl sulfate(SDS)]中，65℃水浴1h后用氯仿抽提二次。上清液中加2/3体 积异丙醇沉淀DNA。风干后的DNA溶解在TE中，加入Rnase以除去RNA， 用氯仿抽提一次后用异丙醇沉淀，得到的DNA重新溶解TE中备用。

测定上述两种方法得到的DNA的得率和纯度(OD260/280)，与申请人提供 的简单高效法得到的结果进行比较，如下表1所示

表1

实施例3

在本试验中，以本申请提供的简单高效法提取基因组DNA；采用相同 的PCR程序用两套不同的引物扩增紫菜的ITS序列，他们分别是

P1(正向)5’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’和

P2(反向)5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’；

W1(正向)5’-AGCCATGTGAGCCCTCTATGAG-3’和

W2(反向)5’-GTTAGTTTCTTTTCCTCCGCTT-3’。

电泳结果结果(图1，图1上半部分：引物W1和W2扩增结果，下半部 分：引物P1和P2扩增结果)显示以W1和W2为引物扩增时，少数样品能 扩增出大小为1100bp左右的条带，大部分样品扩增出两到三条带，大小 在500-700之间；当以P1为P2为引物扩增时，所有样品都得到一条大小 为1050bp的条带。

实施例4

在本试验中，以本申请提供的简单高效法提取基因组DNA，以实施例3 中提供的P1和P2为引物，用两套PCR扩增程序进行扩增。程序a：95℃ 5分钟；90℃1分钟，50℃2分钟，5个循环；72℃1分钟；90℃1分 钟，60℃1分钟，72℃1分钟，30个循环；72℃10分钟。程序b：96 ℃3分钟；94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，2个循环；94℃1 分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟。电泳结果 (图2，图2上半部分：程序b扩增结果，下半部分：程序a扩增结果)显 示程序a能稳定地扩增出一条大小为1050bp左右的条带，程序b中大多 数样品能得到一条单一的大小约1050bp的条带，但有两三个样品不稳 定，有时有两条带。

实施例5

在本试验中，以本申请提供的简单高效法提取基因组DNA，以实施例3 中提供的P1和P2为引物，以实施例4提供的程序a作为PCR扩增的反应 参数，扩增后的产物用两套引物进行测序，他们分别是

P1(正向)5’GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCTGC3’和

P2(反向)5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’；

P3(正向)5’CGTTTCCGTAGGTGAACC3’和

P2(反向)5’GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGGT3’。

测序结果显示用P3和P2进行测序反应时，所有样品测序的讯号都很 强，基本上可以一次测通。而用P1和P2这对引物进行测序反应时，多数 样品测序讯号很弱，难以测出结果，或者需要二次测序。