一种与奶牛乳房炎抗性相关的CNV片段及其应用

本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及一种与奶牛乳房炎抗 性相关的CNV片段。

奶牛乳房炎是奶牛最常见、危害最大的疾病之一，也是影响世界 奶牛养殖的主要疾病之一，全世界每年因该病引起的牛奶生产损失高 达380万吨。奶牛乳房炎不仅会影响奶牛的产奶量，降低原料奶的品 质，还会影响奶牛正常生理功能，延长产后发情时间，严重的会造成 奶牛过早淘汰。目前奶牛乳房炎主要采用抗生素等药物进行，然 而效果并不理想而且会造成其它负面影响，因此众多专家学者正在寻 求通过其他途径来解决该问题，而遗传途径被认为是一种降低奶牛乳 房炎发病率的长期策略。

然而奶牛乳房炎的遗传力较低，仅为0.02-0.04，导致传统的育种 方法遗传进展慢，选择效果不明显。随着分子遗传学、数量遗传学和 分子生物学技术的飞速发展，以基因组选择技术为代表的分子育种技 术逐步应用到畜禽育种中去，并产生巨大的影响。拷贝数变异(Copy Number Variation，CNV)是指与基因组参考序列相比，基因组中大 于1kb的DNA片段插入、缺失或扩增及其互相组合衍生出的复杂变异。 在模式动物和人类医学研究表明CNVs与复杂疾病、疾病的易感性等 有重要关系。因此，可将CNVs作为一个分子遗传标记应用于分子育 种。

分子育种，即分子标记辅助选择育种，是指利用DNA分子遗传标 记对育种材料进行选择，综合改良畜禽重要经济性状。分子育种综合 利用了遗传标记信息、系谱信息和个体表型信息，是传统遗传育种与 现代分子生物学有机结合的育种方法。遗传标记是指能够遗传的、可 识别的并能准确反映遗传多态性的生物特征。分子育种为畜禽育种开 辟了一条新的途径，随着分子生物学技术的发展，检测成本的降低， 目前分子遗传标记已经应用于畜禽育种，并取得了巨大的影响。在奶 牛育种中，通过选择与奶牛重要经济性状关联显著，且与数量性状基 因座紧密连锁的DNA分子标记，来实现早期选择、加快遗传进展和提 高选择准确性等目标，从而加快育种进程。

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与奶 牛乳房炎抗性相关的CNV片段。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明首先提供一种与奶牛乳房炎抗性相关的CNV 片段，所述CNV片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该片段位于 中国荷斯坦牛TRAPPC9基因，存在拷贝数变异。

本发明经试验发现，所述片段拷贝数低的中国荷斯坦牛乳房炎抗 性显著高于该片段拷贝数高的中国荷斯坦牛。

进一步地，本发明提供用于扩增所述CNV片段的引物，所述引物 的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-3所示，该引物可以高特异性地扩增目 标片段。

进一步地，本发明提供了含有前述引物的试剂盒。

所述试剂盒还可包括其他常规组分，如SYBR Green Master， ddH2O等。

实际应用中，为了实现对奶牛乳房炎抗性的鉴定或检测，所述试 剂盒还包括扩增内参基因BTF3基因的引物，以便在检测时通过与内 参基因的比较，更好的对结果进行判断。所述内参基因BTF3基因的 拷贝数稳定，其引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4-5所示，该引物能 够高特异性地扩增BTF3基因。

所述内参基因也可以使用已被证明具有稳定拷贝数的基因作为 内参基因的。

第二方面，本发明提供了前述CNV片段在鉴定乳房炎抗性奶牛品 种中的应用。

所述应用非疾病的诊断和目的，仅用于鉴定奶牛的乳房炎抗 性性状。

进一步地，所述应用为利用前述CNV片段的拷贝数变异(拷贝数 高低)来鉴定奶牛乳房炎抗性。

具体操作为：以待测样品的基因组DNA为模板，利用前述引物与 前述内参基因BTF3基因的引物进行荧光定量PCR反应，利用2-ΔΔct方 法计算待测样品CNV片段的拷贝数，所述CNV片段拷贝数低的奶牛 乳房炎抗性显著高于该片段拷贝数高的奶牛，低拷贝数的个体为乳房 炎抗性优势个体。

更进一步地，本发明针对荧光定量PCR反应提供优选的扩增体 系和反应条件。

其中，所述扩增体系为20μL：50ng/μL基因组DNA模板1μL， 10pmol/μL正向引物F 1μL和反向引物R 1μL，SYB Green Master 10μL，ddH2O 7μL。

具体而言，扩增CNV时，使用SEQ ID NO.2-3所示的引物，扩增 内参基因时，使用SEQ ID NO.4-5所示的引物。

其中，所述反应条件为：①预变性95℃，10min；②扩增反应： 95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，45个循环；③融解曲线生 成：95℃5s，65℃1min，97℃10s；④40℃冷却。

第三方面，本发明提供了前述CNV片段在奶牛辅助育种中的应 用。具体为利用荧光定量PCR方法检测前述CNV片段的拷贝数，根据 拷贝数的高低筛选乳房炎抗性优势品种进行选育。

作为优选，所述奶牛为中国荷斯坦牛。

本发明的有益效果在于：

本发明对中国荷斯坦奶牛的TRAPPC9基因的拷贝数进行检测，并 对该基因的拷贝数与奶牛的乳房炎抗性进行关联分析，通过SAS9.0 软件的卡方检验和Excel的T检验分析发现，乳房炎患病牛TRAPPC9 基因的拷贝数显著高于健康牛(P<0.05)，利用SAS9.0软件进行方差 分析也发现TRAPPC9基因的拷贝数显著影响奶牛体细胞评分。该拷贝 数变异的检出为中国荷斯坦奶牛乳房炎抗性的分子标记辅助选择提 供了科学依据。

本发明提供的CNV片段不受奶牛个体年龄、性别等限制，可用于 中国荷斯坦牛的早期选育，从而大大加快了中国荷斯坦奶牛的育种进 程。

图1为TRAPPC9基因拷贝数在所检测中国荷斯坦牛体中分布。

图2为不同乳房健康状态中国荷斯坦牛TRAPPC9基因拷贝数。

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要 理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对 本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和 精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方 法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商 业途径得到。

实施例1与中国荷斯坦奶牛乳房炎抗性相关的CNV标记的检测

1.1待测中国荷斯坦奶牛血液DNA提取

尾静脉采集待测中国荷斯坦奶牛血液，常温放置3-4小时待血液 凝固，此时血液分为血清和凝血块两部分，血清呈清亮黄，凝血块 为暗红，牛血液中只有白细胞内含有DNA，存在于凝血块中。

利用天根血液/细胞/组织基因组DNA样品提取试剂盒从凝血块 中提取基因组DNA，具体步骤如下：

用眼科剪剪取0.2-0.3mL的凝血块放入已灭菌的2mL圆底离心管 中，加入500μL的细胞裂解液CL；

利用手持匀浆仪将血块充分匀浆，振荡15s，12000rpm离心1min， 弃去上层暗红上清液；

再次加入700μL细胞裂解液CL，充分振荡使下层沉淀散开悬浮， 12000rpm离心1min，弃去上清液；

加入200μL缓冲液GS，充分涡旋至沉淀充分悬浮；

加入20μL蛋白酶K和250μL缓冲液GB，充分混匀；

将离心管用封口膜封好放入到56℃杂交炉中消化3-4小时，为确 保充分消化，消化过程中需要颠倒混匀数次，最终溶液变成清亮透明， 简短离心；

加入200μL冰镇无水乙醇，上下颠倒混匀15s，此时可能会出现 絮状沉淀；

将上一步所得溶液转入吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中， 12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

向吸附柱CB3中加入500μL去蛋白缓冲液GD，静置2min， 12000rpm离心30s，弃去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW,12000rpm离心30s，弃 去收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；

向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW,12000rpm离心30s，弃 去收集管中的废液；

将吸附柱放入收集管中，12000rpm离心2min，弃去废液，将吸 附柱置于室温放置数分钟，彻底挥发吸附柱上残余的乙醇；

将吸附柱转入至一个新的离心管中，加入100μL 56℃预热的TE 缓冲液，室温放置5min，12000rpm离心2min，基因组DNA则存在 于离心管中。

利用NanoDrop2000紫外分光光度计检测基因组DNA提取的质 量与浓度，并取出一部分DNA，稀释到统一的浓度。

1.2引物设计

采用Primer 3.0和Oligo 6.0软件分别设计目的基因TRAPPC9和 内参就BTF3的荧光定量PCR引物，对于CNV区段(CNVR)分成 上下两段，每段取10Kb的序列来筛选合适的引物；对于基因表达， 采取跨越不同外显子的方法进行设计，引物设计过程中遵循以下原 则：

(1)PCR扩增片段长度100-200之间；

(2)引物G/C含量在40-60％之间；

(3)引物长度在18-24bp之间，退火温度(Tm值)在58-62℃；

(4)引物的3’末端尽可能不要以A或T结尾，同时3’端避免发 生连续3个碱基相连的情况，避免发卡结构和引物二聚体；

(5)尽量避免上下游引物或引物自身出现发卡结构或引物二聚 体。

对于拷贝数的引物，需要利用UCSC PCR进行引物特异性检测。

1.3引物检测

利用梯度PCR进行引物扩增特异性和退火温度检测，特异性强 的引物目的条带明亮，没有二聚体和非特异性杂带；对退火温度不敏 感的引物在很大温度范围内扩增结果变化不大。

利用等倍比稀释而成的标准品进行荧光定量PCR扩增来绘制标 准曲线检测引物的扩增效率，同时结合扩增曲线、融解曲线和融解峰 来综合评判引物是否合适。具体步骤如下：

①将DNA样品用Nuclease—free water按照5倍比稀释4个梯度， 即1、1/5、1/25、1/125；

②以此模板为标准品，对每对引物进行荧光定量PCR反应；

③根据仪器的操作说明进行扩增效率的计算、标准曲线和融解曲 线的绘制。

荧光定量PCR反应体系为：标准品基因组DNA模板1μL， 10pmol/μL正向引物F 1μL和反向引物R 1μL，SYB Green Master 10μL，ddH2O 7μL。反应条件为①预变性95℃，10min；②扩增反应： 95℃变性10sec，60℃退火10sec,72℃延伸10sec，45个循环；③融 解曲线生成：95℃5sec，65℃1min，97℃10sec；④40℃冷却。

具体而言，扩增CNV时，使用SEQ ID NO.2-3所示的引物，扩增 内参基因时，使用SEQ ID NO.4-5所示的引物。

1.4待测样本拷贝数变异检测

将稀释到统一浓度的待检测DNA样品分别进行目的基因 TRAPPC9和内参基因BTF3的荧光定量PCR反应，每个样本3个重 复，反应体系和条件与上一步相同。根据仪器的操作说明得到CT值， 然后利用2-ΔΔct方法计算待测中国荷斯坦牛TRAPPC9基因的拷贝数。

1.5上述CNV标记在中国荷斯坦牛乳房炎抗性优势品种选育中 的应用

该CNV标记可作为分子遗传标记对奶牛直接进行基因选择或者 标记辅助选择，从而加快中国荷斯坦牛乳房炎抗性优势品种的选育。

实施例2中国荷斯坦奶牛TRAPPC9基因拷贝数与乳房炎抗性的关 联分析与检测应用

按照实施例1的方法，对采自中国北方地区不同养殖场的133头 中国荷斯坦牛进行TRAPPC9基因拷贝数的分析，分析结果如表1、 图1所示，TRAPPC9基因拷贝数为4个的个体在荷斯坦牛体中频 率最高，达36.8％，其次是5个拷贝数的个体，占荷斯坦牛体的 27.8％，最低的是8个拷贝数的个体，频率仅0.8％。

利用SAS9.0软件ANOVA程序分析TRAPPC9基因的拷贝数与 体细胞等级的关联关系，分析时以个体的体细胞数作为划分标准为： SCC≤20万，等级为1；20万

y＝μ+hys+p+m+g+e

其中，y：观察值，μ：体均值，hys：场年季效应，p：胎次效 应，m：泌乳阶段效，g：拷贝数效应，e：随机残差效应。分析结果 如表2所示。

表1TRAPPC9基因的拷贝数

表2中国荷斯坦奶牛TRAPPC9基因拷贝数与乳房炎抗性性状关联分析

表2中的数值表示为最小二乘均值±标准误，表中相同字母表示 差异不显著，不同字母表示差异显著(P<0.05)，*表示显著相关 (P<0.05)。

通过Excel的T检验分析发现，乳房炎患病牛TRAPPC9基因的 拷贝数显著高于健康牛(P<0.05)，结果如图2所示。

由表2、图2可知，TRAPPC9基因的拷贝数对中国荷斯坦牛乳房 炎抗性的影响达到显著水平(P<0.05)。低拷贝数牛乳房炎抗性显著 高于高拷贝数的牛。

实施例3用于扩增本发明所述CNV片段的引物

所述引物包括：

正向引物F1：5’-CAAGACTCTGCTGAGATGACG-3’；

反向引物R1：5’-CGACCATCACCCAGACTATGC-3’。

实施例4试剂盒

所述试剂盒包括：

1、实施例3所述的引物；

2、内参基因BTF3基因的引物：

BTF3正向引物F2：5’-TCAGGGAGATTACTAAGGGT-3’；

BTF3反向引物R2：5’-GAAGCAGAAGTCTAAGCAAC-3’。

3、SYB Green Master：购自ROCHE公司。

4、ddH2O。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。