一种根瘤固氮菌株系RY3菌株及其应用

技术领域

本发明属于植物营养和牧草栽培技术领域，具体涉及一种生物固氮技术，尤其是涉及一种能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌。

背景技术

柱花草(Stylosanthes guianensis SW.)又名热带苜蓿、巴西苜蓿，原产于南美洲。1982年由中国热带农业科学院引自国际热带农业中心(CIAT)，并在海南试种成功，现在已大面积推广于华南各省(区)。柱花草在盛花期的干物质中含粗蛋白质16.0～20.0％，粗脂肪1.8～2.5％，租纤维17.0～19.0％，无氮浸出物38.0～44.0％，粗灰分8.0～10.0％，是一种优良的热带豆科牧草。中国南方如广东、广西等省(区)，将柱花草与果树间种，除了用于饲草外，还可起到覆盖、保持水土和改土培肥的作用。如果与禾本科牧草如狗尾草等混播，可建成良好的人工草地用于放牧。

柱花草通常选择排水良好、土层深厚、土质较好的沙壤或壤土种植。但在贫瘠土壤中，柱花草幼苗不能形成根瘤，或仅有一些由土著根瘤侵染形成的无效根瘤，在贫瘠的土地上豆科植物结种根瘤菌可增加产量15～50％。为提高柱花草结瘤率，固氮肥土，宜用柱花草根瘤菌拌种，可有效提高柱花草的结瘤率及固氮效率。因此筛选能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌具有重要的意义。

柱花草以其高产、优质及耐粗放管理的特性在引进后很快成为我了我国南方豆科牧草的主推品种。在柱花草引进之初由于种植地土壤中柱花草土著菌的含量极低，柱花草不能很好的结瘤固氮，主要依靠施肥获得高产。这样就不能体现出真正的高产和耐粗放管理。后来我国从澳大利亚引进了根瘤菌菌剂施用于柱花草种植地，对柱花草的产量有了一定的提高。但是由于澳大利亚的根瘤菌菌剂是基于澳大利亚的土壤和气候环境选出的高效菌株，到我国的气候和土壤环境只是能少量的提高柱花草产量，并不能达到澳大利亚那样的高产效果。目前我国还没筛选出适合于我国气候土壤条件的菌株，故从我国种植柱花草的不同类型土壤条件的土著菌中筛选适合于特定区域的柱花草高效固氮根瘤菌有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种根瘤固氮菌株系RY3，一种能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌。

本发明人于2009年2月27从云南省农业科学院热区生态农业研究所(E101.49N25.50H1084)采集到一株结瘤较大生长茂盛的花草的根瘤，剪掉柱花草地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温保存，经分离及纯化得到一种根瘤固氮菌株系RY3(Bradyrhizobiumsp.RY3)，于2009年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209267。其16sDNA序列如SEQ ID NO 1所示。

本发明的另一个目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY3的培养方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

将采集到的根瘤，剪掉柱花草地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温保存，以备后续的分离和纯化操作。

具体的分离及纯化过程包括以下步骤：

(1)将柱花草的根系冲洗干净，将根瘤带2mm的根剪下于培养皿中用2级水将表面冲洗干净；

(2)将冲洗干净的根瘤灭菌后捣碎，蘸取乳白汁液在YMA固体培养基上划线，将划好的板倒置于保鲜袋中置于28±1℃培养箱黑暗中培养；

(3)在培养的第3天开始检查培养基上是否有长出菌落，直至第15天左右，将菌落标记出来记录形态和光泽度；

(4)排除非根瘤菌菌落后根据上述标记的菌落将生长单菌落的时间相差3天以上的菌落及板上生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜不一致的菌落挑出，在新的YMA培养基上划板并编号。每一次对新划板的菌落都采用上述方法进行一次纯化直至同一块板上的菌落生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜一致为止。通过逐级纯化将纯化后的板进行镜检和回接后划入YMA斜面中保存。

所述菌株菌落形态：根瘤菌生长初期菌落水样的半透明或白不透明点状物后期菌落为圆形、乳白、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养2～4天菌落直径达2～4mm为快生型根瘤菌，培养5～10天菌落才1mm的为慢生型根瘤菌。

菌体形态：标记初步确认为根瘤菌菌落，从中挑取菌苔涂片，进行革兰氏染，在100倍显微镜下观察。根瘤菌为(0.5～0.9)×(1.2～0.3)μm的小杆菌。内常含-，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(G-)，无芽孢，菌体单个或成对。

本发明同时提供了所述根瘤固氮菌株系RY3菌株回接柱花草的方法，包括以下步骤：

(1)将分离纯化出来的根瘤RY3用无菌水洗入液体YMA培养基中，用封口膜封口，在摇床中180r/min摇菌3天后测定菌液的OD值，当OD大于1时得菌液；

(2)将柱花草种子在95％(体积比浓度)的乙醇中浸泡后在用0.1％(质量体积浓度，0.1g HgCl2/100ml水)的HgCl2溶液处理，用无菌水冲洗，排放于培养皿中灭菌的发芽纸上，用灭菌的0.05mmol/L硫酸钙溶液浸湿发芽纸，放在28℃的培养箱中黑暗催芽3天，待苗长到4厘米时移入灭菌沙培箱中；

(3)从步骤(2)所述沙培箱中选取壮实的苗用步骤(1)制备得到的菌液浸泡15分钟后栽种在装满灭菌砂的花盆中，每棵种苗加入菌液1～2ml，保证每裸种苗的接菌量达到1.0×109个以上。

本发明还有一个目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY3制备得到的菌剂。将保存的RY3根瘤菌活化于YMA固体培养基中，4～5天后菌落布满平面，在超净工作台中用无菌水将平面的菌落洗入灭菌后的YMA液体培养基中(PH为5.5～6)。封口后在恒温摇床中(28±1℃，180r/min)进行摇菌繁殖。摇菌3～5天后于波长600nm的分光光度计上测定菌液OD值，当OD值大于0.6时(菌液含菌量大于1.0×109个/ml)，即可用于接种柱花草。

本发明还有一个目的是提供柱花草接种所述根瘤固氮菌株系RY3菌的方法。将上 述根瘤菌的菌液直接用于浸泡柱花草种子、种苗，或者将菌液浇于新移植的柱花草的跟部。也可以混合菌体吸附材料例如草炭、蛭石或珍珠岩等制成菌剂使用，在播种或移栽前施用于大田中，混合比例优选10ml菌液/50g草炭、10ml菌液/15g蛭石或10ml菌液/15g珍珠岩。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种根瘤菌RY3，回接到柱花草TPRC2、TPRC5后使柱花草的鲜重和干重都比对比增加2.5倍以上。经沙培回接菌液和土培施用RY3与菌体吸附材料制备的菌剂也具有这样的增产效果。它的特性表现在柱花草接种根瘤菌后浸染能力强能使TPRC2、TPRC5柱花草的鲜重和干重都达到最大，见附图8、附图9、附图10回接根菌RY3后植株生长情况。当菌体被释放到自然环境中时，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而增加了土壤间根瘤菌的体，对柱花草的结瘤固氮有促进的作用。

附图说明

图1根瘤菌RY3回接检验图

图2根瘤菌RY3菌落图

图3根瘤菌RY3革兰氏染图片

图4回接根菌RY3后的结瘤情况

图5RY3琼脂糖凝胶电泳图

图6NCBI比对图

图7RY3根瘤菌聚类分析图

图8TPRC2、TPRC5接种不同菌株后鲜重

图9TPRC2、TPRC5接种不同菌株后干重

图10TPRC2、TPRC5施用不同草炭菌剂后干重

图11RY3在不同PH条件下的生长曲线

图12RY3在不同盐浓度下的生长曲线

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图进一步详细说明本发明。

实施例1根瘤菌RY3的获得和培养

于2009年2月27从云南省农业科学院热区生态农业研究所(E101.49N25.50H1084)采集到一株结瘤较大生长茂盛的花草的根瘤，剪掉柱花草地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温保存，经分离及纯化得到一种根瘤固氮菌株系RY3(Bradyrhizobium sp.RY3)，于2009年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209267。

(1)从冰袋中取出柱花草的根系在自来水下冲洗2～3遍将根系冲洗干净，用剪刀将新鲜完整、颜暗红的根瘤带2mm的根剪下于培养皿中用2级水将表面冲洗干净；此过程要确保根瘤表面的完整。

(2)将冲洗干净的根瘤转移到灭菌后的培养皿中，加入95％的酒精浸泡3分钟后，将酒精倒出，用无菌水冲洗4～5次，加入0.1％的HgCl2灭菌2～3分钟，迅速将HgCl2倒 出并加入无菌水，转移进超净工作台操作，用无菌水冲洗6遍以上，将无菌水倒出，选取根瘤转移至灭菌后的培养皿中(可在火焰上灭菌)，用灭菌后的镊子和接种环将根瘤捣碎，蘸取乳白汁液在准备好的YMA固体培养基上划线。将划好的板倒置于保鲜袋中置于培养箱(28±1℃、黑暗)中培养。

YMA培养基配方如表1：

表1YMA(Yeast Mannitol Agar)培养基配方(L-1)

(3)在培养的第3天开始检查培养基上是否有长出菌落，直至第15天左右，将菌落标记出来记录形态和光泽度。

在培养过程中从以下三点来确定是否为根瘤菌：

a.菌落形态：根瘤菌生长初期菌落水样的半透明或白不透明点状物后期菌落为圆形、乳白、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养2～4天菌落直径达2～4mm为快生型根瘤菌，培养5～10天菌落才1mm的为慢生型根瘤菌。

b.标记初步确认为根瘤菌菌落，从中挑取菌苔涂片，进行革兰氏染，在100倍显微镜下观察。根瘤菌为(0.5～0.9)×(1.2～0.3)μm的小杆菌。内常含β-，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(G-)，无芽孢，菌体单个或成对；

C.通过将分离出的根瘤菌在无菌条件下回接到柱花草上，能结瘤的则为根瘤菌。

根瘤菌RY3的形态特征：

根瘤菌RY3为慢生根瘤菌属的一种，培养4天后沿第一笔涂布的痕迹开始有水样带状半透明的突起，到第4天以后突起开始明显并逐渐独立成为单独的菌落，第5天后最后一笔出现1.0～2.0mm的半透明、乳白粘质较多的单菌落。到第七天以后菌落生长很快粘质分泌较多菌落间连在一起成为乳状菌带，无法分别出单菌落，常可以在两条菌带之间的空白部分到一些单菌落。见附图2所示RY3根瘤菌菌落。

RY3号的最适生长条件为：温度28℃，pH＝6，转速180r/min。能够广泛的应用碳原和氮原，在各种植物来源的综合抽提液上能很好的生长，在YMA培养基上比在蛋白胨培养基上生长好。

根瘤菌RY3的生理特性

根瘤菌RY3经革兰氏染在显微镜下呈紫形状为杆状体为革兰氏阴性菌。菌体细胞常由于积聚有不染且折光性强的聚b-颗粒，而染不均匀或成环节状。细胞外可形成大量粘液物质。见附图3所示根瘤菌RY3革兰氏染图片。

(4)排除非根瘤菌菌落，根据上述标记的菌落将生长单菌落的时间相差3天以上的菌落及板上生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜不一致的菌落挑出，在新的培养基上划板并编号。每一次对新划板的菌落都采用上述方法进行一次纯化直至同一块板上的菌落生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜一致 为止。通过逐级纯化将纯化后的板进行镜检和回接后划入YMA斜面中保存。

(5)回接验证柱花草根瘤菌

a.菌液的准备

将分离纯化出来的根瘤RY3用无菌水洗入准备好的液体YMA培养基中，用封口膜封口，在摇床中180r/min摇菌3天后测定菌液的OD值，当OD大于0.6时(即每ML菌液含菌量多于1.0×109个)即得菌液，可用于回接。所述液体YMA培养基是在表1的培养基中将琼脂除去，并调节PH值为7。

b.无菌种苗的准备

精选柱花草种子数粒在95％的乙醇中浸泡5分钟，取出后在0.1％的HgCl2中处理5分钟，用无菌水冲洗5～10遍，然后排在灭过菌、放好发芽纸的培养皿中，用灭过菌的0.05mmol/L硫酸钙溶液浸湿发芽纸，放在28℃的培养箱中黑暗催芽3天。待苗长到4厘米时候把苗移入准备好的灭过菌的沙培箱中，待用。

c.回接

从沙培箱中选取壮实的苗放到培养皿中用步骤(5)a制备得到的菌液浸泡15分钟，用镊子将种苗栽种在装满灭菌砂的小花盆中，每盆中呈菱形状栽植4株，每棵种苗加入菌液1～2ml，保证每裸种苗的接菌量达到1.0×109个以上。大约四周后拔起苗查看是否结瘤，结瘤则为根瘤菌。根瘤RY3经回接检验后结瘤明显，可证明分离物为纯的根瘤菌。见附图1所示根瘤菌RY3回接检验结果。

实施例2根瘤菌RY3的16S rDNA序列测序及类别的确定

为了确定根瘤菌RY2的系统发育地位，对所分离得到的菌株的16SDNA系列进行测序。首先利用omega公司的试剂盒进行总DNA的提取(此方法不是常规的方法，用试剂盒提取是一种高效、便捷的方法，但和常规方法相比成本有点稍高)，然后利用引物进行PCR特异性扩增

上游引物35fc：CTKAAGAGTTTGATCMTGGCTCAGATTGAAC；

下游引物1492r：TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。

反应条件如下：

PCR反应

Primer：35fc，1492r

PCR recipe：

10×Reaction Buffer                5.0μL

dNTPs(10mM)                        1.0μL

P35fc(25Pmol)引物                  0.5μL

P1492r(25Pmol)引物                 0.5μL

Taq DNA聚合酶(5u/μL)              1.0μL

模板DNA                            1.0μL

补超纯水至                         41μL

PCR procedure

94℃预变性：                       3min

94℃变性                           50s

56℃退火                           50s    35个循环

72℃延伸                           60s

72℃最后延伸                       5min

扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检验结果见附图5所示，RY3琼脂糖凝胶电泳图，送北京奥科生物技术公司进行测序，测序结果如SEQID NO 1所示。

将所得的序列结果在美国美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对，发现根瘤菌菌株RY3与已知菌株AY039015.1(Bradyrhizobium sp.ORS3295)相似性达100％，见附图6所示NCBI比对图。应用软件DNAStar和TREECONW对所测的菌株进行聚类，见附图7所示RY3根瘤菌聚类分析图。由比对结果和聚类图可知RY3为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的新株系，命名为热研3号(RY3)。

实施例3根瘤菌RY3的应用实验

为了确认RY3对柱花草的作用，采用两个柱花草品种(TPRC2、TPRC5)，用沙培的方法将根瘤RY3回接到柱花草根部，每个处理4个重复(菌、砂和种苗的处理参见回接实验步骤)，以不接种根瘤为对照(CK)，进行回接对比。整个过程中采用低氮营养液进行浇灌。柱花草TPRC2、TPRC5回接根瘤菌RY3后对柱花草的生理指标影响见表2和附图8、附图9。附图8和附图9中，左边方柱(a)为TPRC2，右边方柱(b)为TPRC5。(附图8和附图9中其他方柱图为现有根瘤菌对照结果，与本发明技术没有直接关系，未做标注)。

由表2、附图8和附图9可以看出TPRC2、TPRC5回接根瘤菌RY3后除根瘤数和根瘤鲜重比其他菌株稍低外，固氮酶活性、株高、干鲜重等指标都要高于参比菌株。株高比对照高出1倍以上，柱花草鲜重是CK的2倍以上，干重比CK高出3倍以上。

柱花草主要用于青饲和干草生产，所以鲜重和干重是衡量柱花草生产能力的最终指标，只有能使柱花草干重达到最大的菌株才是适合柱花草生产的菌株。根瘤菌菌株RY3能使柱花草的鲜重和干重都比参比菌株增产25％以上，故RY3对于TPRC2、TPRC5柱花草来说是高效菌株。在生产中可以大力开发利用。

表2根瘤菌RY3回接到TPRC2、TPRC5后对柱花草生理指标的影响

通过实验研究总结可知，根瘤菌RY3回接到柱花草TPRC2、TPRC5后使柱花草的鲜重和干重都比对比增加3倍以上。植株鲜重是产量的一个指标，但常由于水分含量的不同常具不稳定性，植株干重能很稳定的反映出植株的产量大小。所以只有能使柱花草鲜重和干重都能达到高产的菌株才是高效菌株。菌株RY3就具有这样的增产效果。它的特性表现在柱花草接种根瘤菌后浸染能力强，能使TPRC2、TPRC5柱花草的鲜重和干重都达到最大， 见附图4回接根菌RY3后植株生长情况。当菌体被释放到自然环境中时，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而增加了土壤间根瘤菌的体，对柱花草的结瘤固氮有促进的作用。

实施例4根瘤菌RY3的对土壤的适应实验

根瘤菌、土壤环境和植株是一个相互作用的一个体系，只有将三者统一起来综合考虑才能达到真正的高产及高效。我国柱花草主要是种植于酸性土壤分布较广的华南地区。为了确定RY3对土壤主要影响因素(酸碱性、及盐碱性)的适应情况，通过如下方法确定柱花草的耐酸、耐盐性。为今后更加科学合理地使用RY3柱花草根瘤菌提供优选的技术支持。

将菌株RY3活化后，洗入YMA液体培养基中，于恒温摇床(28±1℃、180r/min)下培养，待OD600约为1，分别吸取50μl菌悬液接种到pH值为4、4.5、4.8、5、5.5、6、7(体积为50ml)YMA液体培养基中，置恒温振荡器中28±1℃、180rpm振荡培养，以培养液浑浊度的变化来检测菌的生长情况，培养72小时后用分光光度计测量OD600。每个处理3个重复。RY3在不同PH值条件中的生长情况见附图11。由附图11可知，RY3最适生长环境的PH值应为5.5左右，当PH值小于4.5时，RY3的生长不正常，不能形成有效菌液，当PH值在4.8～5或大于6时可形成有效菌液，但是菌的生长受到一定的抑制。

耐盐抗性实验采用添加NaCl的YMA液体培养基培养根瘤菌，3天后用分光光度计测定菌液的OD值，OD值的大小可以反映菌生长快慢的情况。各菌株经活化后，接种于YMA液体培养基中，置恒温振荡器中28±1℃下培养，待OD600约为1，分别吸取50μl菌悬液接种到NaCl浓度为0、0.05、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/L YMA液体培养基中(pH5.5、体积为50ml)，置恒温振荡器中28±1℃180rpm振荡培养，以培养液浑浊度的变化来检测菌的生长情况，培养72小时后用分光光度计测量OD600。每个处理3个重复。RY3在不同盐浓度中的生长情况见附图12。从RY3耐盐性的曲线可以看出RY3对盐的反应比较敏感，当盐浓度为0.05mol/L时菌RY3的生长很缓慢不能形成有效的菌液，故在实际生产应用中应注意施用RY3菌剂的土壤含盐量不能超过0.03mol/L。

实施例5根瘤菌RY3菌剂及应用

所述菌剂可以在摇菌后进行拌种处理、以液体菌剂浇于刚移苗的柱花草根部。也可以混合菌体吸附材料例如草炭、蛭石、珍珠岩等，混合比例优选10ml菌液/50g草炭、10ml菌液/15g蛭石、10ml菌液/15g珍珠岩，制成菌剂播种或移栽前混施于土壤中。

如前述沙培方法准备无菌种子和育苗。将根瘤菌从固体培养基上吸入三角瓶中28℃培养96小时，用无菌水洗脱菌体，并用无菌水稀释，用漩涡打旋器均匀菌体，测定OD值(入＝600nm)，保证田间接种时每粒种子的含菌量大于109个。将草炭粉碎(过2mm筛孔)后在121℃灭菌40分钟后冷却备用。在播种前将不同菌液按10ml菌液：50g草炭的比例倒入草炭中，并充分混合让草炭吸收菌液。育苗前将混合好的菌剂混施于土壤中。小区面积为20m2，设四个重复。三个月后收样，测单株产量其结果见附图12。由附图12可以看出在不回接菌的情况下两个品种的柱花草的产量差异不大，回接RY3根瘤菌以后，TPRC2和TPRC5的干重分别增加2.8倍和1.8倍。