一种根瘤固氮菌株系RY2菌株及其应用

技术领域

本发明属于植物营养和牧草栽培技术领域，具体涉及一种生物固氮技术，尤其是涉及一种能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌。

背景技术

柱花草(Stylosanthes guianensis SW.)又名热带苜蓿、巴西苜蓿，原产于南美洲。1982年由中国热带农业科学院引自国际热带农业中心(CIAT)，并在海南试种成功，先已大面积推广于华南各省(区)。柱花草在盛花期的干物质中含粗蛋白质16.0～20.0％，粗脂肪1.8～2.5％，租纤维17.0～19.0％，无氮浸出物38.0～44.0％，粗灰分8.0～10.0％，是一种优良的热带豆科牧草。中国南方如广东、广西等省(区)，将柱花草与果树间种，除了用于饲草外，还可起到覆盖、保持水土和绿肥作用。如果与禾本科牧草如狗尾草等混播，可建成良好的人工草地用于放牧。

柱花草通常选择排水良好、土层深厚、土质较好的沙壤或壤土种植。但在贫瘠土壤播种柱花草不形成根瘤，或仅有一些由土著根瘤侵染形成的无效根瘤，在贫瘠的土地上豆科植物接种根瘤菌可增加生长量15～50％。为提高柱花草结瘤率，固氮肥土，宜用柱花草根瘤菌拌种，可有效提高柱花草的结瘤率。因此筛选能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌具有重要的意义。

柱花草以其高产、优质及耐粗放管理的特性在引进后很快成为我了我国南方豆科牧草的主推品种。在柱花草引进之初由于种植地土壤中柱花草土著菌的含量极低，柱花草不能很好的结瘤固氮，主要依靠施肥获得高产。这样就不能体现出真正的高产和耐粗放管理。后来我国从澳大利亚引进了根瘤菌菌剂施用于柱花草种植地，对柱花草的产量有了一定的提高。但是由于澳大利亚的根瘤菌菌剂是基于澳大利亚的土壤和气候环境选出的高效菌株，到我国的气候和土壤环境只是能少量的提高柱花草产量，并不能达到澳大利亚那样的高产效果。目前我国还没筛选出适合于我国气候土壤条件的菌株，故从我国种植柱花草的不同类型土壤条件的土著菌中筛选适合于特定区域的柱花草高效固氮根瘤菌有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种根瘤固氮菌株系RY2，一种能使柱花草高效结瘤并达到高产的根瘤菌。

本发明人于2008年11月14于云南省农业科学院热经所试验地内(N＝24°45.684′，E＝98°55.546′，H＝1023m)采集到一株结瘤多生长茂盛的柱花草的根瘤，剪掉柱花草地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温保存，经分离及纯化得到一种根瘤固氮菌株系RY2(Bradyrhizobium yuanmingense RY2)，于2009年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No：M 209266。其16sDNA序列如SEQ ID NO 1所示。

本发明的另一个目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY2的培养方法。

本发明将采集到的根瘤，剪掉柱花草地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温后续的保存备分离和纯化。

具体的分离及纯化过程：

从冰袋中取出柱花草的根系冲洗干净，转移到灭菌后的培养皿中，灭菌，将根瘤捣碎，蘸取乳白汁液在准备好的YMA固体培养基上划线。将划好的板倒置于保鲜袋中置于培养箱(28±1℃、黑暗)中培养。培养过程中注意检查培养基上是否有长出菌落，标记菌落，记录形态和光泽度，确定为根瘤菌。

排除非根瘤菌菌落后根据上述标记的菌落将生长单菌落的时间相差3天以上的菌落及板上生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜不一致的菌落挑出，在新的YMA培养基上划板并编号。每一次对新划板的菌落都采用上述方法进行一次纯化直至同一块板上的菌落生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜一致为止。通过逐级纯化将纯化后的板进行镜检和回接后划入YMA斜面中保存。

所述菌落形态：根瘤菌生长初期菌落水样的半透明或白不透明点状物，后期菌落为圆形、乳白、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养2～4天菌落直径达2～4mm为快生型根瘤菌，培养5～10天菌落菌落直径才1mm的为慢生型根瘤菌。

b.菌体形态：标记初步确认为根瘤菌菌落，从中挑取菌苔涂片，进行革兰氏染，在100倍显微镜下观察。根瘤菌为(0.5～0.9)×(1.2～0.3)μm的小杆菌。内常含β-，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(G-)，无芽孢，菌体单个或成对。

本发明还有一个目的是提供所述根瘤固氮菌株系RY2制备得到的菌剂。通过将平板上的菌洗入液体YMA培养基中进行摇菌得到的菌悬液(含菌量大于1.0×109个)拌种、直接回接到植物根部或拌土。也可以混合菌体吸附材料例如例如草炭、蛭石或珍珠岩等制成菌剂使用，混合比例优选10ml菌液/50g草炭、10ml菌液/15g蛭石或10ml菌液/15g珍珠岩。。

本发明还有一个目的是提供柱花草接种所述根瘤固氮菌株系RY2菌的方法。所述根瘤固氮菌株系RY2菌通过摇菌制备得到液体菌剂可在播种前用菌液浸种、育苗前浸泡植株根部、移植后浇于柱花草根部土壤中，也可以将菌液混合菌体吸附材料例如草炭、蛭石、珍珠岩等制成菌剂移植前混施于土壤中。

本发明得有益效果是：

将RY2回接到TPRC2柱花草后使柱花草的固氮酶活性得到极大的提高。制成菌剂施用于土壤后对TPRC2产量的提高是TPRC5的一倍，如果大面积施用于单一种植TPRC2的大田中将会使柱花草干草产量增加3倍以上；RY2还是一个耐盐性比较强的根瘤菌菌株，在其他菌不能生长的盐浓度下RY2能很好生长，这对我国南方盐渍土壤中提高柱花草产量提供了技术保障。

附图说明

图1根瘤菌RY2回接检验图

图2根瘤菌RY2菌落图

图3根瘤菌RY2革兰氏染图片

图4回接根菌RY2后的结瘤情况

图5RY2琼脂糖凝胶电泳图

图6NCBI比对图

图7RY2根瘤菌聚类分析图

图8回接RY2TPRC2、TPRC5产量变化图

图9RY2耐酸菌液OD值

图10RY2耐NaCl菌液OD值

图11回接RY2对柱花草产量影响图

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图进一步详细说明本发明。

实施例1根瘤菌RY2的获得和培养

2008年11月14于云南省农业科学院热经所试验地内(N＝24°45.684′，E＝98°55.546′，H＝1023m)采集到一株结瘤多生长茂盛的柱花草的根瘤，剪掉柱花草地上部分将整个根系连同根瘤一起装入保鲜袋后置于冰袋中低温保存。经分离及纯化得到一种根瘤固氮菌株系RY2(Bradyrhizobium yuanmingense RY2)，于2009年11月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 209266。

(1)从冰袋中取出柱花草的根系在自来水下冲洗2～3遍将根系冲洗干净，用剪刀将新鲜完整、颜暗红的根瘤带2mm的根剪下于培养皿中用2级水将表面冲洗干净；此过程要确保根瘤表面的完整。

(2)将冲洗干净的根瘤转移到灭菌后的培养皿中，加入95％(体积比浓度)的酒精浸泡3分钟后，将酒精倒出，用无菌水冲洗4～5次，加入0.1％(质量体积浓度，0.1g HgCl2/100ml水)的HgCl2溶液灭菌2～3分钟，迅速将HgCl2倒出并加入无菌水，转移进超净工作台操作，用无菌水冲洗6遍以上，将无菌水倒出，选取根瘤转移至灭菌后的培养皿中(可在火焰上灭菌)，用灭菌后的的镊子和接种环将根瘤捣碎，蘸取乳白汁液在准备好的YMA固体培养基上划线。将划好的板倒置于保鲜袋中置于培养箱(28℃、黑暗)中培养。

YMA培养基配方如表1，调节PH值为6。

表1YMA(Yeast Mannitol Agar)培养基配方(L-1)

(3)在培养的第3天开始检查培养基上是否有长出菌落，直至第15天左右，将菌落标记出来记录形态和光泽度。

在培养过程中从以下3点来确定是否为根瘤菌：

a.菌落形态：根瘤菌生长初期菌落水样的半透明或白不透明点状物，后期菌落为圆形、乳白、半透明、边缘整齐、粘质或多或少。培养2～4天菌落直径达2～4mm为快 生型根瘤菌，培养5～10天菌落菌落直径才1mm的为慢生型根瘤菌。

b.菌体形态：标记初步确认为根瘤菌菌落，从中挑取菌苔涂片，进行革兰氏染，在100倍显微镜下观察。根瘤菌为(0.5～0.9)×(1.2～0.3)μm的小杆菌。内常含β-，即折射强的似空洞的颗粒或使菌体呈环节状，革兰氏阴性(G-)，无芽孢，菌体单个或成对；

C.通过将分离出的根瘤菌在无菌条件下回接到柱花草上，能结瘤的则为根瘤菌。

根瘤菌RY2的形态特征：

根瘤菌RY2为慢生根瘤菌属的一种，培养50小时后沿第一笔涂布的痕迹开始有水样带状半透明的突起，到第4天以后突起开始明显并逐渐独立成为单独的菌落，第5天后最后一笔出现1.0～2.0mm的菌落圆形，边缘完整，表面光滑，凸起水珠状，无透明度极高，粘性分泌物较少。见附图2所示RY2根瘤菌菌落。

RY2号的最适生长条件为：温度28℃，pH值为6，转速180r/min。能够广泛的应用碳原和氮原，在各种植物来源的综合抽提液上能很好的生长，在YMA培养基上比在蛋白胨培养基上生长好。

根瘤菌RY2的生理特性

根瘤菌RY2经革兰氏染在显微镜下呈紫，形状为小短杆状体，大小为0.5～0.9μm×1.2～3.0μm，细胞单个或成对，常可见成排列。为革兰氏阴性菌。见附图3所示根瘤菌RY2革兰氏染图片。

(4)排除非根瘤菌菌落，根据上述标记的菌落将生长单菌落的时间相差3天以上的菌落及板上生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜不一致的菌落挑出，在新的培养基上划板并编号。每一次对新划板的菌落都采用上述方法进行一次纯化直至同一块板上的菌落生长形态、菌落大小、菌落透明度、及灯光下的折射、菌落颜一致为止。通过逐级纯化将纯化后的板进行镜检和回接后划入YMA斜面中保存。

(5)回接验证柱花草根瘤菌

a.菌液的准备

将分离纯化出来的根瘤RY2用无菌水洗入准备好的液体YMA培养基中，用封口膜封口，在摇床中180r/min摇菌3天后测定菌液的OD值，当OD大于0.6时(即每ml菌液含菌量多于1.0×109个即得菌液，可使用于回接。所述液体YMA培养基是在表1的培养基中将琼脂除去，并调节PH值为7。

b.无菌种苗的准备

精选柱花草种子数粒在95％的乙醇中浸泡5分钟，取出后在0.2％的HgCl2中处理5分钟，用无菌水冲洗5～10遍，然后排在灭过菌、放好发芽纸的培养皿中，用灭过菌的0.05mmol/L硫酸钙溶液浸湿发芽纸，放在28℃的培养箱中黑暗催芽3天。待苗长到4厘米时候把苗移入准备好的灭过菌的沙培箱中，待用。

c.回接

从沙培箱中选取壮实的苗放到培养皿中用步骤(5)a制备得到的菌液浸泡15分钟，用镊子将种苗栽种在装满灭菌砂的小花盆中，每盆中呈菱形状栽植4株，每棵种苗加入菌液1～2ml，保证每裸种苗的接菌量达到1.0×109个以上。大约四周后拔起苗查看是否结瘤，结瘤则为根瘤菌。根瘤RY2经回接检验后结瘤明显，可证明分离物为纯的根瘤菌。见 附图1所示根瘤菌RY2回接检验结果。

实施例2根瘤菌RY2的16S rDNA序列测序及类别的确定

为了确定根瘤菌RY2的系统发育地位，对所分离得到的菌株的16SDNA系列进行测序。首先利用omega公司的试剂盒进行总DNA的提取，然后利用引物进行PCR特异性扩增。

上游引物35fc：CTKAAGAGTTTGATCMTGGCTCAGATTGAAC；

下游引物1492r：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。

反应条件如下：

PCR反应

Primer：35fc，1492r

PCR recipe：

10×Reaction Buffer            5.0μL

dNTPs(10mM)                    1.0μL

P35fc(25Pmol)引物              0.5μL

P1492r(25Pmol)引物             0.5μL

Taq DNA聚合酶(5u/μL)          1.0μL

模板DNA                        1.0μL

补超纯水至                     41μL

PCR procedure

94℃预变性：                   3min

94℃变性                       50s

56℃退火                       50s      35个循环

72℃延伸                       60s

72℃最后延伸                   5min

扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检验结果见附图5所示RY2琼脂糖凝胶电泳图，送北京奥科生物技术公司进行测序，测序结果如SEQID NO 1所示。

将所得的序列结果在美国美国国立生物信息中心(NCBI)进行比对，发现根瘤菌菌株RY2与已知菌株AB509380Bradyrhizobium yuanmingense相似性达100％，见附图6所示NCBI比对图。应用软件DNAStar和TREECONW对所测的菌株进行聚类，见附图7所示RY2根瘤菌聚类分析图。由比对结果和聚类图可知RY2为慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)的新株系，命名为热研2号(RY2)。

实施例3根瘤菌RY2的应用实验

为了确认RY2对柱花草的作用，采用两个主要的柱花草品种(TPRC2、TPRC5)，用沙培的方法将根瘤RY2回接到柱花草根部，每个处理4个重复(菌、砂和种苗的处理参见回接实验步骤)，以不接种根瘤为对照(CK)，进行回接对比。整个过程中采用低氮营养液进行浇灌。柱花草TPRC2、TPRC5回接根瘤菌RY2后对柱花草的生理指标影响见表2和附图8。附图8中左边方柱(a)为TPRC5，右边方柱(b)为TPRC2(附图8中其他方柱图为现有根瘤菌对照结果，与本发明技术没有直接关系，未做标注)。

由表2可以看出回接根瘤菌RY2后柱花草TPRC2、TPRC5的根瘤数、根瘤干重、株高、植株鲜重、和固氮酶活性都比对应的对照(CK)大幅度增加，差异达到极显著。特别是固 氮酶活性非常高。以如此少的根瘤就能有这么大的固氮酶活性，若改变栽培措施能形成更多的根瘤，那么RY2将会提高TPRC5的固氮酶活性，为植株、土壤和间作植物提高大量的氮。

固氮酶活性是衡量根瘤菌和植株结合后孤单能力大小的指标，固氮酶活性活性大则表示菌株和对应的植株结合后能很好的固氮，植株就有很高的增产潜力。柱花草根瘤是根瘤菌和柱花草的共生的专一性体系，不同品种的柱花草和不同菌系的搭配所表现的结果也不同。

表2根瘤菌RY2回接到TPRC2、TPRC5后对柱花草生理指标的影响

通过实验研究总结，根瘤菌RY2和TPRC2柱花草共生后，使TPRC2柱花草的株高大大提高，同时比TPRC5高出许多，结瘤后根瘤的固氮酶活性值也大大提高，对TPRC2有很强的增产潜力，为TPRC2间作为其他植物供氮提供了好的菌株。见附图4回接根瘤菌RY2后的结瘤情况。

当菌体被释放到自然环境中时，对人、动物和植物无害，不会污染环境，反而增加了土壤间根瘤菌的体，对柱花草的结瘤固氮有促进的作用。

南方土壤普遍pH值低，柱花草适应南方酸性土壤除了其自身的耐酸体制外，根瘤菌也起到了平衡酸的作用。在抗性实验中发现，根瘤菌能使培养基的pH上升，生长越快的菌株其pH值上升也越大。各菌株经活化后，接种于YMA液体培养基中，置恒温振荡器中28±1℃下培养，待OD600约为1，分别吸取50μl菌悬液接种到pH值为4、4.5、4.8、5、5.5、6、7(体积为50ml)，置恒温振荡器中28±1℃180rpm振荡培养，以培养液浑浊度的变化来检测菌的生长情况，培养72小时后用分光光度计测量OD600。每个处理3个重复。RY2在不同PH中的生长情况见附图9。从附图9可以看出RY2根瘤菌在PH小于4.8时生长不正常，不能形成大于109个菌/ml的菌液。当PH为5时可以形成正常的菌液，当PH值为5.5时RY2的生长达到最好。PH大于6后生长活性稍微下降。

大多数能使豌豆和三叶草等豆科植物结瘤的根瘤菌对盐都很敏感，而且高浓度NaCl会降低豆科植物接菌剂中根瘤菌的数目。所以，根瘤菌的耐盐性对提高它们在土壤中的存活能力和竞争性是很重要的。耐盐抗性实验采用添加NaCl的YMA液体培养基培养根瘤菌，3天后用分光光度计测定菌液的OD值，OD值的大小可以反映菌生长快慢的情况。各菌株经活化后，接种于YMA液体培养基中，置恒温振荡器中28±1℃下培养，待OD600约为1，分别吸取50μl菌悬液接种到NaCl浓度为0、0.05、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/ LYMA液体培养基中(pH6.0、体积为50ml)，置恒温振荡器中28±1℃、180rpm振荡培养，以培养液浑浊度的变化来检测菌的生长情况，培养72小时后用分光光度计测量OD600。每个处理3个重复。RY2在不同盐浓度中的生长情况如附图10，附图10中曲线RY2为根瘤菌RY2的耐盐性曲线，其他几条曲线为现有豆科植物根瘤菌的实验曲线，与本发明技术无关，所以未作标注。从附图10可以看出RY2的耐盐性很强，当盐浓度为0.1mol/L时还能形成109个菌/ml菌液，而大多数能使豌豆和三叶草等豆科植物结瘤的根瘤菌在浓度为0.08mol/L时基本不生长。盐条件对RY2生长的的限制可达0.25mol/L。RY2在无盐或低浓度盐时生长不及其他菌快，当盐度大于0.05mol/L时RY2的生长就超过其他菌。故RY2极适用于盐渍土壤中，对柱花草的增产和盐渍土壤的改良都有极大的促进作用。

实施例4根瘤菌RY2菌剂及应用

所述菌剂可以在摇菌后进行拌种处理、以液体菌剂浇于刚移苗的柱花草根部。也可以混合菌体吸附材料例如草炭、蛭石或珍珠岩等吸附剂制成菌剂移植前混施于土壤中。所述混合比例为10ml菌液/50g草炭、10ml菌液/15g蛭石或10ml菌液/15g珍珠岩。

如上沙培方法准备无菌种子和育苗。将根瘤菌从固体培养基上洗入三角瓶中28℃培养96小时，用无菌水洗脱菌体，并用无菌水稀释，用漩涡打旋器均匀菌体，测定OD值(入＝600nm)，保证田间接种时每粒种子的含菌量大于109个。将草炭粉碎(过2mm筛孔)后在121℃灭菌40分钟后冷却备用。在播种前将不同菌液按10ml菌液：50g草炭的比例倒入草炭中，并充分混合让草炭吸收菌液。育苗前将混合好的菌剂混施于土壤中。小区面积为20m2，设四个重复。三个月后收样，其结果见附图11，附图11中右边方柱(a)为TPRC5，左边方柱(b)为TPRC2(附图11中其他方柱图为现有根瘤菌对照结果，与本发明技术没有直接关系，未做标注)。

从附图11可见在不回接根瘤菌的时候TPRC2和TPRC5的地上不分产量差别不大。在回接了不同的菌以后产量和对照相比都有所提高。对RY2来说柱花草TPRC5的产量和回接其他的菌的差别不大，但是柱花草TPRC2的产量就有大幅提高，是CK的4倍以上。