一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母及其应用

一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，特别是一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母及其应用。

背景技术

木聚糖酶是指可将木聚糖降解成低聚糖和木糖的一组酶的总称，其在饲料、食品、造纸、医药及能源等领域的应用日益广泛。在饲料中添加木聚糖酶可降解植物细胞壁中的木聚糖，改善其营养价值，减少畜禽肠道疾病，增进畜禽健康，使畜禽体重均匀。在面包加工中适量添加木聚糖酶，能提高面团的机械加工性能，增大面包体积，改善面包芯质地。在造纸行业中，用少量的木聚糖酶处理草浆可显著改进草浆的滤水性、脆性等性能，提高纸浆白度和强度，使草浆有替代部分木浆生产高质量的纸制品。

甲醇蛋白是以工业甲醇为原料生产的单细胞蛋白，被称为第二代单细胞蛋白。它是通过微生物以甲醇为主要营养源进行生长、繁殖而得到的菌体蛋白。与天然蛋白相比，单细胞甲醇蛋白的粗蛋白含量比鱼粉和大豆都要高，并含有丰富的必需氨基酸、矿物质和维生素，营养价值极高，可用于部分代替鱼粉、大豆、骨粉、肉类和脱脂奶粉而应用于畜禽饲料或其他化工领域。

我国蛋白饲料供需缺口每年达几千万吨，随着人民生活水平的提高及养殖业的发展，饲料蛋白的供需矛盾进一步加剧。另据调查，我国现有饲料利用率低，养殖料肉比偏高，浪费了大量粮食资源。单细胞甲醇蛋白中的粗蛋白可替代植物蛋白用于饲料行业，是一个十分重要且极具发展前景的产品。目前，甲醇蛋白生产中存在产品单一，发酵工艺陈旧，成本高而效益低等难题。木聚糖酶等饲用酶制剂的应用，也可促进动物机体对营养成分的吸收，提高了养殖效率，减少兽药使用，保障食品安全。两者如能同时生产，不但简化了生产工艺，还可以降低原料消耗，节约能源使用，减轻环境污染。但目前尚未见同时联合发酵生产木聚糖酶与甲醇蛋白的有关报道。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的就是提供一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母及其应用，可有效解决现有甲醇蛋白生产中存在的产品单一，发酵工艺陈旧，成本高而效益低的难题。

本发明解决的技术方案是，一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母，分类命名为巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）hgd-xm-301菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M2013519，保藏日期为：2013年10月30日，保藏地址为：中国武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心。

一株同时生产甲醇蛋白和木聚糖酶的毕赤酵母的应用，具体步骤如下：

（1）一级种子的培养：取试管斜面保藏的菌株hgd-xm-301（即巴斯德毕赤酵母hgd-xm-301菌株），接入至一级种子培养基中，在30℃摇床中振荡培养22-26小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子；

（2）二级种子的培养：每升无机盐培养基中加入4mL的微量元素溶液后，再调整pH值到4.8-5.0，将一级摇瓶种子接种到已加入微量元素溶液后的无机盐培养基中，在30℃，pH4.8-5.0，通气量0.5-1.2v/v·m（每分钟气液比），搅拌转速400-650rpm，培养时间22-26h；

（3）高密度发酵：

A、在发酵罐中装入发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂，发酵培养基和聚醚改性硅消泡剂的体积比为7500：1；对发酵培养基加热，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌30分钟；灭菌结束后，对发酵罐中的发酵培养基进行冷却，当温度降至35℃时，向发酵罐中补加微量元素溶液，并调节pH值为4.8-5.0，微量元素溶液和发酵培养基的体积比为1：25；所述的发酵培养基为无机盐培养基；

B、将培养好的二级种子接入到A步骤发酵罐中的发酵培养基上，在温度30℃，通气量为0.4～0.5v/v·m，搅拌转速为60-80rpm的条件下进行培养，每隔4小时取样测定发酵液中菌体湿重，当湿重达到60g/L以上后，通气量加大至1.0～1.5v/v·m，搅拌转速提高到85-100rpm，保持发酵液pH5.0，16-20小时后，开始以30-40Kg/h的速度流加葡萄糖，葡萄糖流加阶段，发酵液pH值保持在4.5-5.0，当菌体湿重达到80-90g/L时，停止葡萄糖流加，以20-30Kg/h的速度流加甘油，使发酵液中菌体湿重继续上升，当菌体湿重达到120g/L以上时，停止流加甘油，当发酵罐中甘油消耗完，发酵液溶氧开始上升，菌体处于饥饿状态，饥饿培养1-2小时后，开始流加甲醇，发酵液中甲醇体积浓度控制在0.6%～1.0%，同时加大发酵罐通气量，保证发酵液中溶氧达到30%以上（以搅拌转速为100rpm，进气量为2m³/min定义为溶氧100%）；

（4）诱导产酶：甲醇流加24h后，降低发酵温度至26℃，降低发酵液pH至4.5-4.8，每隔3小时流加发酵液体积的0.1-0.2‰的微量元素溶液，当发酵液中菌体湿重达到450-480g/L时，酶活性达到26000U/mL且不再增长（其中，不再增长的判断标准是，当酶活性比前一次酶活性增长量低于5%时，即为不再增长），停止发酵，开始收集发酵液；

（5）酶的提取：发酵液经板框过滤器过滤，上清液为木聚糖酶液，重相为单细胞甲醇蛋白菌体，上清液再经板框过滤器过滤后，用截留分子量5000Ku的超滤膜浓缩，获得木聚糖酶浓缩液，向木聚糖酶浓缩液中加入木聚糖酶浓缩液体积重量5%-10%的玉米淀粉作为载体，搅拌均匀，送入喷雾干燥机进行喷雾干燥；所述的体积重量是指液体以ml计，固体以g计；

（6）酶液喷雾干燥：调节喷雾干燥机进风口温度至135～155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为450-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集干粉即为木聚糖酶；

（7）单细胞甲醇蛋白的获得：将上述步骤（5）获得的重相收集在储液罐中，边加清水边搅拌，得悬液，悬液中菌体湿重为750-800g/L，然后送入到喷雾干燥机中喷雾干燥，调节喷雾干燥机进风口温度至145～160℃、出风温度至70-80℃，调节进料流量为400-500L/h，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白；

所述的一级种子培养基为YPD培养基，是由重量百分比计的酵母浸膏1%（Oxiod公司产品，公知技术，以下同）、胰蛋白胨2%、葡萄糖2%和余量的水混合在一起组成；

所述的无机盐培养基是由磷酸12.6g、二水硫酸钙0.18g、硫酸钾4.4g、硫酸亚铁0.38g，七水硫酸镁7.12g、氢氧化钾1.45g和甘油40g加水至1L制成，用氨水调pH值至4.8-5.0；

所述的微量元素溶液是由五水硫酸铜2.2g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4.5g，二水钼酸钠0.3g，硼酸0.02g，六水合氯化钴0.1g，氯化锌8g，七水合硫酸亚铁32g，质量浓度98%的浓硫酸3mL和生物素0.2g加水至1L制成。

本发明将菌株hgd-xm-301先进行单细胞甲醇蛋白菌体生长，达到一定湿重后开始产生木聚糖酶，产酶过程中其菌体湿重还保持增长，实现了木聚糖酶与甲醇蛋白的共发酵生产，不但能使装置多用，降低了生产成本，提高了生产效益，并且简化了生产工艺，降低原料消耗，节约能源使用，减轻环境污染。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例

（1）一级种子的培养：一级种子培养基采用YPD培养基，用2000mL三角瓶分装，每瓶装液量为500mL，瓶口用8层纱布包裹，121℃灭菌30min后冷却备用，取3-5支试管斜面保藏的菌株hgd-xm-301（又称试管斜面），用接种环刮下并接入至有500mL一级种子培养基的三角瓶中，每支试管斜面接种两瓶，接种后在30℃摇床中振荡培养22-26小时，摇床转速为200-300rpm，获得一级摇瓶种子；

（2）二级种子的培养：二级种子培养基采用无机盐培养基，121℃灭菌30min后冷却，再在每升无机盐培养基中加入4mL经0.22μm微孔滤膜过滤除菌的微量元素溶液，得培养液，先在发酵罐中放入60L培养液，进行实罐灭菌，冷却后用磷酸或氨水调整培养液pH值到4.8-5.0，取样镜检一级摇瓶种子生长情况，将个体较大，发芽2-3个，无杂菌感染的一级摇瓶种子3-4L接入到发酵罐中的培养液上，在30℃，pH4.8-5.0，通气量0.5-1.2v/v·m（每分钟气液比），搅拌转速400-650rpm，培养时间20-26h，得二级种子；

（3）高密度发酵：在5m³发酵罐装1.5m³的发酵培养基和200mL聚醚改性硅消泡剂，打开发酵罐上的盘管的进出口蒸汽阀门，使蒸汽进入盘管并对发酵培养基加热，待温度升至80℃时，打开蒸汽阀门，使蒸汽分别从发酵罐的底部放料口、空气进口、取样口进入到发酵罐内，使发酵培养基温度上升至121-123℃，保持罐压1.1-1.4MPa，灭菌30min，同时，用蒸汽依次对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，待发酵培养基冷却后，向发酵罐中补加经过滤除菌的微量元素溶液60L，并用氨水调节pH至4.8-5.0；

将上述培养好的二级种子60L接入到上述5m³发酵罐中的发酵培养基上进行培养，在30℃，通气量为0.4～0.5v/v·m，搅拌转速为60-80rpm的条件下开始培养，每隔4小时取样测定发酵液中菌体湿重，当湿重达到60g/L以上后，通气量加大至1.0～1.5v/v·m，提高搅拌转速到85-100rpm，保持发酵液pH5.0，16-20小时后，发酵培养基中甘油消耗完，溶氧开始上升，此时，开始以30-40Kg/h的速度流加葡萄糖，在葡萄糖流加阶段，发酵液pH保持在4.5-5.0，当发酵液中菌体湿重达到80-90g/L时，停止葡萄糖流加，以20-30Kg/h的速度流加甘油，使发酵液中菌体湿重继续上升，当菌体湿重达到120g/L以上时，停止流加甘油，当发酵罐中甘油消耗完后，发酵液溶氧开始上升，菌体处于饥饿状态，饥饿培养1-2小时后，开始流加甲醇，发酵液中甲醇体积浓度控制在0.6%～1.0%，同时加大通气量，保证发酵液中溶氧达到30%以上（以搅拌转速为100rpm，进气量为2m³/min定义为溶氧100%）；

（4）诱导产酶：甲醇流加24小时后，发酵液中菌体湿重达140-150g/L，酵母细胞内开始形成酶蛋白，此时，开始进行诱导木聚糖酶生产，即降低发酵温度至26℃，调整发酵液pH至4.5-4.8，每隔3小时流加发酵液体积0.1-0.2‰的微量元素溶液，诱导产酶80-100小时后，发酵液中菌体湿重达到450-480g/L，酶活性达到26000U/mL，随后每隔2小时取样测定酶活性，当酶活性比前一次酶活性增长量低于5%时，即为不再增长，收集发酵液；

（5）酶的提取：发酵液经板框过滤器将单细胞甲醇蛋白与木聚糖酶分离，方法是，发酵液经板框过滤器过滤，上清液为木聚糖酶液，重相为单细胞甲醇蛋白菌体，上清液再经板框过滤器过滤后，用截留分子量5000Ku的超滤膜浓缩，获得木聚糖酶浓缩液，向木聚糖酶浓缩液中加入木聚糖酶浓缩液体积重量5%-10%的玉米淀粉作为载体，搅拌均匀，送入喷雾干燥机进行喷雾干燥；

（6）酶液喷雾干燥：调节喷雾干燥机进风口温度至135～155℃、出风温度至60-75℃，调节进料流量为450-500L/h，进行喷雾干燥，喷雾干燥结束后，收集干粉即为木聚糖酶；

（7）单细胞甲醇蛋白的获得：将上述步骤（5）获得的重相收集在2m³储液罐中，边加清水边搅拌，得悬液，悬液中菌体湿重为750-800g/L，然后送入到喷雾干燥机中喷雾干燥，调节喷雾干燥机进风口温度至145～160℃、出风温度至70-80℃，调节进料流量为400-500L/h，喷雾干燥结束后，收集的干粉即为单细胞甲醇蛋白。

本发明是根据巴斯德毕赤酵母hgd-xm-301菌株营养需求及发酵生理特性，以无机盐、氨水、微量元素等为混合基质，以葡萄糖、甘油及甲醇为碳源，通过液体深层通风搅拌的好氧培养方法进行高密度发酵生产，生产工艺采用变温发酵，在菌体增殖阶段采用菌体最适生长温度进行培养，当菌体达到一定湿重时，开始流加甲醇作为主要营养物质，同时采用降温发酵培养，诱导菌体产生木聚糖酶并分泌胞外，产木聚糖酶过程中其菌体湿重还保持增长，实现木聚糖酶与甲醇蛋白的共同发酵生产，发酵结束时，发酵液中菌体浓度达到450-480g/L，木聚糖酶酶活性达到26000U/mL，该菌株hgd-xm-301所生产的单细胞甲醇蛋白的粗蛋白含量不低于50%，氨基酸总量不低于48%，灰分不高于8%，生产的木聚糖酶最适pH值为5.5，最适作用温度为37℃。

本发明和现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明株性能稳定，能够实现高密度发酵，最终菌体浓度高，达到450-480g/L，同时联产木聚糖酶产品，放罐时酶活达到26000U/mL，生产效率高。

2、发酵装置利用率高，高产甲醇蛋白的同时，联产木聚糖酶产品，降低了生产成本。

3、生产工艺特殊，发酵过程中采用饥饿培养和变温发酵控制工艺，主要营养物质为无机盐和甲醇，原料来源广泛，本发明中甲醇和木聚糖酶的发酵生产效率高，甲醇蛋白生产效率对数期达到不低于3Kg/h/m³，甲醇蛋白单耗甲醇在2.0-2.2：1。

经高效液相谱对照法检测证明，本发明制备出的木聚糖酶为β-1,4-内切木聚糖酶，可从β-1,4-木聚糖主链内部水解木糖苷键，将木聚糖降解为木二糖、木二糖以上的寡聚木糖及少量木糖和阿拉伯糖。并经实验证明，在日粮中添加β-1,4-内切木聚糖酶，可明显改善麦类和糠麸的营养价值，显著提高畜禽生长速度和饲料转化率，具体如下：

对饲喂大麦基础日粮的公牛，添加日粮0.5%的本发明木聚糖酶为主的酶制剂，可使饲料转化率提高11%，日增重比只饲喂大麦日粮的公牛增加0.85±0.07kg，在猪饲料中，饲喂添加日粮0.3%的本发明木聚糖酶的麦麸饲粮后，仔猪日生长速度比未添加本发明木聚糖酶的麦麸饲粮的仔猪日生长速度显著提高，且仔猪成活率高达98%，在鸡饲料中，在小麦型日粮中添加本发明木聚糖酶，肉鸡生长性能和饲料转化率与玉米相同。