尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母及其制备方法与应用

本发明涉及生物技术领域中，尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母及其制备方法与应 用。

酵母菌作为单细胞真核生物，是生物技术领域应用非常广泛的微生物，在大宗发 酵产品、精细医药化学品和蛋白质药物的生产中发挥着非常重要的作用。多型汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)是一种甲醇营养型酵母，能以甲醇为唯一碳源生长和诱导蛋白的 高效表达；最适生长温度为37℃，对热胁迫、金属胁迫和氧胁迫等多种环境胁迫具有很好的 耐受性，因此对工业环境具有广泛的适应性；外源DNA在染体上的稳定、高拷贝整合保证 了蛋白质表达的高效性、稳定性和均一性；蛋白质分泌途径和翻译后修饰机制更接近于高 等真核生物，降低了重组蛋白的免疫原性风险；是公认的安全微生物(Generally recognized as safe,GRAS)，获得国家食品药品监督管理局(CFDA)批准认可；一些在其他 表达系统不能实现功能表达的大分子蛋白、膜蛋白及结构复杂蛋白在多形汉逊酵母中得到 功能性的有效表达。因此多形汉逊酵母成为高效合成重组蛋白药物及其他高值化蛋白最为 理想的微生物细胞工厂。

筛选标记是对微生物菌株进行遗传改造所必需的重要工具。多形汉逊酵母遗传改 造中常用的筛选标记包括抗生素抗性筛选和营养缺陷互补筛选。与抗生素抗性筛选相比， 通过功能互补的营养缺陷筛选标记具有生物安全性高、假阳性率低的特点，在食品用及药 用重组蛋白的高效表达中具有更广泛的应用。但目前使用的多形汉逊酵母营养缺陷型菌株 多数来源于传统的物理或化学诱变，遗传稳定方面的缺陷影响筛选效率；而且原始菌株基 本为美国模式菌种收集中心(American type culture collection,ATCC)的模式菌株，在 产业化应用中受到限制。从源头开发具有营养缺陷筛选标记的、遗传稳定的多形汉逊酵母 菌株，是充分发挥多形汉逊酵母在重组蛋白表达中的优势，实现产业化应用亟待解决的问 题。

本发明所要解决的技术问题是如何制备尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母及如何 在尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母中表达蛋白质。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母 (Hansenula polymorpha)的制备方法。

本发明所提供的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)的制 备方法，包括：敲除多形汉逊酵母出发菌株中尿嘧啶合成途径中基因或降低所述多形汉逊 酵母出发菌株中所述尿嘧啶合成途径中基因编码蛋白质的含量或使所述多形汉逊酵母出 发菌株中所述尿嘧啶合成途径中基因编码蛋白质失活，得到尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵 母；所述多形汉逊酵母出发菌株含有所述尿嘧啶合成途径中基因。

所述多形汉逊酵母出发菌株可为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha) HP20110424，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.7.89。

上述方法中，所述尿嘧啶合成途径中基因可为乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因。

上述方法中，所述乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因可为如下A1)或A2)或A3)或A4)：

A1)编码序列是序列表中序列1的DNA分子；

A2)编码序列是序列表中序列1的第634-1425位的DNA分子；

A3)与A1)或A2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述乳清 苷-5′-磷酸脱羧酶的DNA分子；

A4)在严格条件下与A1)或A2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述乳清苷-5′-磷 酸脱羧酶的DNA分子。

上述方法中，所述敲除多形汉逊酵母出发菌株中尿嘧啶合成途径中基因可为下述 M1)和/或M2)：

M1)使所述尿嘧啶合成途径中基因的编码提前终止；

M2)在所述尿嘧啶合成途径中基因中插入外源DNA片段。

M1)具体可通过在所述多形汉逊酵母出发菌株所述乳清苷-5′-磷酸脱羧酶编码基 因编码序列的第5-6位间插入腺嘌呤核苷酸实现，即将所述多形汉逊酵母出发菌株的所述 乳清苷-5′-磷酸脱羧酶基因的序列由序列1的第634-1425位，改变为序列2的第620-1412 位。

所述外源DNA片段的插入位置为所述尿嘧啶合成途径中基因的限制性内切酶识别 序列间。所述限制性内切酶可为Sac Ⅰ。所述外源DNA片段的插入位置为序列2的第1075- 1076位间或序列1的第1088-1089位间。所述外源DNA片段的插入可以导致所述尿嘧啶合成 途径中基因功能丧失。

在本发明的实施例中，所述外源DNA片段的序列为CYC1TT及其上下游序列或序列 表中序列5的第1434-5590位。

上述方法中，所述外源DNA片段的插入可通过限制性内切酶完成。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母的制 备方法制备的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母。

为解决上述技术问题，本发明还提供了表达目的蛋白的方法。

本发明提供的表达目的蛋白的方法，包括：将含有目的蛋白的编码基因的表达载 体导入所述尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母中，得到重组多形汉逊酵母，实现所述目的蛋 白的表达。

上述表达目的蛋白的方法中，所述表达载体含有所述尿嘧啶合成途径中基因。

在本发明的一个实施例中，所述目的蛋白为葡聚糖酶。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母在表 达蛋白质中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种用于表达蛋白质的成套试剂。

本发明所提供的成套试剂，由所述尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母与所述表达载 体组成。

多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)HP20110424也属于本发明的保护范围，多 形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)HP20110424在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心的保藏号为CGMCC No.7.89。

本发明以具有自主知识产权的多形汉逊酵母为出发菌株，通过PCR介导的基因突 变及mazF-zeoR表达盒介导的无筛选标记基因阻断技术构建了乳清苷-5′-磷酸脱羧酶功能 缺失的、遗传稳定的多形汉逊酵母菌株，该菌株除具有尿嘧啶合成途径阻断产生的营养缺 陷表型外，其他生长特性与野生型菌株没有明显差异，可用作代谢工程或合成生物学改造 的底盘细胞，以及高效表达重组蛋白的细胞工厂。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)

生物材料的菌株编号：HP20110424

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：CGMCC

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所，：100101

生物材料的保藏日期：2017年05月02日

生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.7.89

图1为野生型菌株多形汉逊酵母CGMCC 7.89及尿嘧啶缺陷菌株的生长谱比较。

图2为反向筛选敲除筛选标记菌株的PCR验证。其中，M为DNA分子量标准。

图3为尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌HP7.89-ura3和野生型多形汉逊酵母菌 CGMCC 7.89的生长曲线。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为 常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的质粒pEBCMZC(Song PP,Liu S,Guo XN,Bai XJ,He XP,Zhang BR.Scarless gene deletion in methylotrophic Hansenula polymorpha by using mazF as counter-selectable marker.Anal Biochem,2015,468:66-74)公众可从申请人 处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的YEp352载体(Hill JE,Meyers AM,Koerner TJ,et al.A yeast/ E.coli shuttle vectors with multiple unique restriction sites.Yeast,1993,9: 163-167)带有酿酒酵母URA3基因，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重 复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的抗生素Zeocin为Invitrogen公司产品，产品目录号为R25001。

实施例中用到的各种培养基：

YPD固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母粉、蛋白胨、葡萄糖和琼 脂粉，溶剂为水；溶质的浓度如下：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖和10g/L琼脂 粉，自然pH。

YPM固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母粉、蛋白胨、甲醇和琼脂 粉，溶剂为水；溶质的浓度如下：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、10ml/L甲醇和10g/L琼脂粉，自 然pH。

SC固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母氮源培养基(Yeast Nitrogen Base,YNB)和葡萄糖，溶剂为水；溶质的浓度如下：6.7g/L YNB、10g/L葡萄糖和 10g/L琼脂粉，自然pH。

SCM固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母氮源培养基(Yeast Nitrogen Base,YNB)和甲醇，溶剂为水；溶质的浓度如下：6.7g/L YNB、10ml/L甲醇和10g/L 琼脂粉，自然pH。

SCU固体培养基：该培养基由溶质和溶剂组成；溶质为酵母氮源培养基(Yeast Nitrogen Base,YNB)、葡萄糖和尿嘧啶，溶剂为水；溶质的浓度如下：6.7g/L YNB、10g/L葡 萄糖、30mg/L尿嘧啶和10g/L琼脂粉，自然pH。

以上培养基的液体培养基由不添加其中的琼脂粉制成，其余成分以及浓度均相 同。

实施例1、尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母HP7.89-ura3的构建

本实施例以多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)HP20110424为出发菌，构建了 尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母，多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)HP20110424在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)的保藏号为CGMCC No.7.89，以 下简称多形汉逊酵母CGMCC 7.89。

一、用于破坏乳清苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因URA3的重组质粒构建

(一)利用引物URA3-2K-F与URA3-2K-R以多形汉逊酵母CGMCC 7.89的基因组DNA为 模板进行PCR扩增，得到序列表中序列1所示的URA3基因，该URA3基因与NCBI中多形汉逊酵 母DL-1的URA3及其侧翼序列一致性为95.93％。将该URA3基因连接到克隆载体pEASY-blunt simple中，得到重组质粒pEASY-URA3。其中序列1的第634-1425位为URA3基因的编码序列。 引物序列如下：

URA3-2K-F：5’-AACCAGTGAATGAAAACGAAGAGC-3’；

URA3-2K-R：5’-GGTGAAGAAAACCGGGAAAAGAATT-3’。

(二)利用引物URA3RH-F1与URA3RH-R1以pEASY-URA3为模板进行PCR扩增，得到DNA 片段URA3-1，利用引物URA3RH-F2与URA3RH-R2以pEASY-URA3为模板进行PCR扩增，得到DNA 片段URA3-2，利用引物URA3RH-F1与URA3RH-R2以URA3-1与URA3-2为模板进行PCR扩增，得到 序列2所示的DNA片段。序列2中含有一个Sac Ⅰ的识别序列，序列2的第1071-1076位为Sac Ⅰ 的识别序列。该DNA片段在URA3基因编码序列第五位碱基后插入一个碱基A，使序列2的第 620-622位ATG后的TATAA突变为连续的两个终止密码子TAATAA，将该DNA片段命名为mURA3。 将mURA3连接到克隆载体pEASY-blunt simple中，得到重组质粒pEASY-mURA3。所用引物序 列如下：

URA3RH-F1：5’-AACGAAGAGCCCAACTACTACAAG-3’；

URA3RH-R1：5’-TCGCCCTTTCTCCATAAGATTTAtTACATGTTGATTATTATTCAGGGAAATGTTG- 3’；

URA3RH-F2：5’-CAACATTTCCCTGAATAATAATCAACATGTAaTAAATCTTATGGAGAAAGGGCGA- 3’；

URA3RH-R2：5’-GGTGAAGAAAACCGGGAAAAG-3’。

(三)利用引物Ps-F与Ps-R以质粒pEBCMZC为模板进行PCR扩增，得到序列3所示的 DNA片段C-mazF-zeoR，序列3的第4-9位和第3967-3972位为Sac Ⅰ的识别序列，序列3的第 22-392位和3580-3950位为CYC1TT的序列，序列3的第432-2725位为甲醇诱导的毒性基因 mazF表达盒的序列，序列3的第432-1959位为MOX启动子的序列，序列3的第2726-3950位为 zeoR表达盒的序列,序列3的第3205-3579位为zeoR的序列。所用引物序列如下：

Ps-F：5’-AGGGAGCTCATCCAATTGTGACACGTC-3’(下划线部分为Sac Ⅰ的识别序列)；

Ps-R：5’-AGGGAGCTCGATGCCAGCAACGCG-3’(下划线部分为Sac Ⅰ的识别序列)。

将C-mazF-zeoR用Sac Ⅰ酶切后的DNA片段与pEASY-mURA3用Sac Ⅰ酶切后的载体骨 架相连，得到重组质粒pmURA3-CMMZC，该重组质粒中C-mazF-zeoR插入到mURA3内部的SacI 识别序列间，该重组质粒带有zeocin抗性筛选标记zeoR和甲醇诱导的毒性基因mazF表达 盒。

二、用于破坏URA3基因的DNA片段

以重组质粒pmURA3-CMMZC为模板，利用引物对URA3RH-F1和P37进行PCR扩增，得到 4536bp的正确序列的DNA片段，该DNA片段包含mURA3的5’端序列、CYC1TT、mazF表达盒和 zeoR表达盒的5’端序列，将其命名为mUCMZ-1。

以重组质粒pmURA3-CMMZC为模板，利用引物对ZEO-F和URA3RH-R2进行PCR扩增，得 到1515bp的正确序列的DNA片段，该DNA片段包含zeoR表达盒的3’端序列和mURA3的3’端序 列，将其命名为ZmU-2。

其中DNA片段mUCMZ-1和ZmU-2之间存在259bp的重叠区，可以通过重组形成完整的 zeoR表达盒，使转化菌株表现出zeocin抗性。

其中，引物P37与ZEO-F序列均位于zeoR的基因序列中，序列如下：

P37：5’-CGTCCCGGAAGTTCGTGG-3’；

ZEO-F：5’-AAGTTGACCAGTGCCGTTCC-3’。

三、酵母菌转化及重组菌株筛选鉴定

(一)将DNA片段mUCMZ-1和ZmU-2等摩尔浓度混合，然后取10μg混合DNA片段电转化 多形汉逊酵母CGMCC 7.89，转化后菌液涂布于YPD+zeocin固体培养基上，在37℃静置培养 3-5d。将长出的单菌落接种于1mL无菌水中，室温静置2h，然后分别点于SC固体培养基和YPD 固体培养基上，37℃静置培养48h，获得在YPD培养基上正常生长、而在SC培养基上不生长的 转化菌株，即营养缺陷型菌株。其中，YPD+zeocin固体培养基为向YPD培养基中添加zeocin 得到的zeocin浓度为200μg/mL的固体培养基。

(二)将步骤(一)得到的营养缺陷型菌株及野生型菌株多形汉逊酵母CGMCC 7.89 分别接种于1mL无菌水中，室温静置2h，然后均分别点于SC、SCU、YPD和YPD+zeocin固体培养 基上，37℃静置培养48h。结果显示，野生菌株在SC、SCU、YPD培养基上均正常生长，但在YPD+ zeocin培养基平板上不能生长；步骤(一)得到的营养缺陷型菌株在SC培养基上不能生长， 但在SCU、YPD和YPD+zeocin培养基上正常生长。表明步骤(一)得到的营养缺陷型菌株为尿 嘧啶合成缺陷型菌株，并且带有zeocin抗性筛选标记。

菌株鉴定：

根据多形汉逊酵母URA3上下游侧翼序列，设计并合成引物URA3UP-F和URA3DOWN- R，其中引物URA3UP-F和URA3DOWN-R的序列分别位于URA3上下游侧翼序列上，各引物序列如 下：

URA3UP-F：5’-AGTCAGACGAGGGTAAGGAA-3’；

URA3DOWN-R：5’-CGATGATCCTAGCCCTGTCG-3’。

利用引物对URA3UP-F和URA3DOWN-R分别对多形汉逊酵母CGMCC 7.89与步骤(一) 得到的营养缺陷型菌株的基因组DNA进行PCR扩增，从多形汉逊酵母CGMCC 7.89扩增出 2719bp DNA片段，对该DNA片段测序显示其序列如序列表序列4所示，序列4的第544-2385位 序列与序列1所示的URA3基因序列完全一致；而从步骤(一)得到的营养缺陷型菌株基因组 扩增出6683bp的DNA片段，测序结果显示其序列如序列表序列5所示，序列5的第558-1633位 序列与序列2的第1-1076位序列完全一致，序列5的第1634-5590位为C-mazF-zeo序列，序列 5的第5597-6349位序列与序列2的第1077-1829位序列完全一致。因此步骤(一)得到的营养 缺陷型菌株对应于多形汉逊酵母CGMCC 7.89的URA3基因的序列为在mURA3的Sac Ⅰ识别序 列间插入C-mazF-zeoR得到的序列。表明步骤(一)得到的营养缺陷型菌株基因组上URA3位 点内插入了C-mazF-zeoR，且该菌株还含有序列2的第620-628位所示的mURA3的部分片段， 使细胞不能合成乳清苷-5′-磷酸脱羧酶，细胞产生尿嘧啶营养缺陷表型。将步骤(一)得到 的营养缺陷型菌株命名为HP-ura3::MZ。

四、反向筛选敲除筛选标记获得尿嘧啶缺陷型菌株HP7.89-ura3

(一)将步骤三的尿嘧啶营养缺陷型菌株HP-ura3::MZ接于2ml YPD液体培养基中， 37℃、200rpm培养18h，5000rpm离心5min收集细胞，无菌水洗涤一次，加入2ml无菌水，室温 静置2h后，取100μL菌悬液涂布于YPM固体培养基上，37℃静置培养至长出单菌落。

随机挑取四个单菌落(分别命名为ΔU1、ΔU2、ΔU3和ΔU4)接种于1mL无菌水中， 室温静置2h后，分别点种于SC、SCU、YPD和YPD+zeocin固体培养基上，同时以野生型菌株多 形汉逊酵母CGMCC 7.89及尿嘧啶缺陷型菌株HP-ura3::MZ为对照，37℃静置培养48h。

结果如图1所示，所有菌株在YPD培养基上均能正常生长，但只有菌株HP-ura3::MZ 能够在YPD+zeocin培养基上生长；野生型菌株在SC、SCU培养基上均正常生长，但菌株HP- ura3::MZ和来源于YPM平板上的单菌落(ΔU1、ΔU2、ΔU3和ΔU4)在SC培养基上不能生长， 在添加了尿嘧啶的SCU培养基上正常生长。表明HP-ura3::MZ在YPM培养基上培养后，由于甲 醇诱导毒性蛋白MazF的表达对细胞产生致死效应，而只有通过CYC1TT介导的同源重组敲除 zeocin抗性筛选标记和mazF表达盒后的酵母细胞才能生长，并表现为尿嘧啶营养缺陷型。

(二)根据多形汉逊酵母URA3位点核苷酸序列，设计并合成如下引物：

URA3-mF：5’-CAGGCCGCAGAAGAAAGTAC-3’；

URA3HP-R：5’-TTAAGCAATGCGCCGCTTGTAAG-3’。

分别提取ΔU1、ΔU2、ΔU3和ΔU4的基因组DNA，以此为模板，利用引物URA3-mF和 URA3HP-R进行PCR扩增对上述菌株进行验证。同时分别以野生型菌株CGMCC 7.89和尿嘧啶 缺陷型菌株HP-ura3::MZ基因组为对照。

PCR扩增产物的电泳检测结果如图2所示，利用引物URA3-mF和URA3HP-R从反向筛 选后菌株ΔU1、ΔU2、ΔU3和ΔU4的基因组均扩增出约800bp DNA片段、从野生型菌株CGMCC 7.89基因组扩增出约400bp的DNA片段、从菌株HP-ura3::MZ基因组扩增出约4.4kb的DNA片 段。对PCR产物进行序列分析和比对，结果表明来源于菌株ΔU1、ΔU2、ΔU3和ΔU4的PCR产 物具有完全一致的核苷酸序列，它们与野生型菌株CGMCC 7.89的PCR产物相比，在第57位核 苷酸后面插入了405bp的CYC1TT序列，与菌株HP-ura3::MZ的PCR产物相比缺失了mazF表达 盒和zeocin抗性表达盒。上述结果表明，通过反向筛选获得在靶基因URA3内部插入CYC1TT 序列的突变菌株，实现了URA3的无筛选标记破坏，使酵母细胞产生尿嘧啶营养缺陷表型。将 通过反向筛选获得的尿嘧啶营养缺陷型菌株(即ΔU1、ΔU2、ΔU3和ΔU4)命名为HP7.89- ura3。

野生型菌株CGMCC 7.89和尿嘧啶营养缺陷型菌株HP7.89-ura3 URA3位点编码序 列比较：

根据野生型菌株CGMCC 7.89的URA3起始密码子上游约200bp序列，设计并合成引 物URA3ORF：5’-GTCCACCAAACTGGTGTAG-3’。

分别以野生型菌株CGMCC 7.89和尿嘧啶营养缺陷型菌株HP7.89-ura3基因组DNA 为模板，利用引物URA3ORF和URA3HP-R进行PCR扩增。

利用引物URA3ORF和URA3HP-R从野生型菌株基因组扩增出991bp的DNA片段(对该 DNA片段的测序显示其序列为序列表中序列6)、从HP7.89-ura3的基因组扩增出1397bp的 DNA片段(对该DNA片段的测序显示其序列为序列表中序列7)。结果表明，与野生型菌株URA3 编码序列相比，HP7.89-ura3的URA3编码序列在序列2的第620-622位ATG后的TATAA突变为 连续的两个终止密码子TAATAA；而且在序列2的第620-622位ATG后454bp处插入了CYC1TT (序列7的第669-1039位)及其上下游各12bp和22bp序列。

五、尿嘧啶缺陷型菌株HP7.89-ura3的遗传稳定分析

将尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌株HP7.89-ura3接于2ml YPD液体培养基中， 37℃、200rpm摇床培养20h，按10％接种量转接到新鲜YPD培养基中，如上连续传代培养10 次。分别取传代1、5、和10次的培养液200μL，进行10倍的梯度稀释。

将未稀释菌液及不同稀释度菌液各100μL分别涂布在SC、SCU和YPD培养基平板上， 37℃静置培养48h，记录不同平板上菌落生长情况。

结果发现，所有的SC平板上都没有菌落生长，而SCU和YPD平板上菌落正常生长，菌 落数随稀释度提高而递减，而且同样处理条件下SCU和YPD平板上的菌落数没有明显差异。 说明本发明的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌株HP7.89-ura3遗传稳定。

六、野生型和尿嘧啶缺陷型菌株HP7.89-ura3生长特性比较

将野生型多形汉逊酵母CGMCC 7.89和尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌HP7.89- ura3分别接种于2ml YPD液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养16h，按体积比10％的接种量 转接于10ml YPD液体培养基中，37℃摇床振荡培养16小时；离心收集菌体细胞，将细胞用无 菌水洗两次，菌体重悬于5ml无菌水中制成菌悬液；将菌悬液分别转接于SCU、YPD和YPM液体 培养基中，使培养液起始OD600约为0.15，37℃、200rpm摇床振荡培养36h，期间每6h取样2ml 测定OD600，制作生长曲线。结果如图3所示，本发明构建的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母 菌(Hansenula polymorpha)HP7.89-ura3和野生型多形汉逊酵母菌CGMCC 7.89在生长特性 上没有明显差异。

实施例2、葡聚糖酶在多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)HP7.89-ura3中的表 达

一、表达载体的构建

将pMOXZα-A(专利号：ZL200810101801.1)载体EcoRI和XbaI识别序列间的DNA片段 替换为斯达油脂酵母葡聚糖酶编码基因(LSD1基因，其序列为序列8的第1798-3624位)，得 到重组载体，将该重组载体命名为pMOXZα-LSD1，pMOXZα-LSD1能表达序列8的第1798-3624 位所示的LSD1基因编码的斯达油脂酵母葡聚糖酶。

以重组载体pMOXZα-LSD1为模板，利用引物MOXp-F和AOX1TT-R进行PCR扩增，将序 列正确的PCR产物命名为DNA片段1，DNA片段1的序列为序列8，序列8的第1-1511位为甲醇氧 化酶基因启动子MOXp序列，序列8的第1525-1791位为α信号肽序列，序列8的第1798-3624位 为LSD1基因编码序列，序列8的第3695-4033位为醇氧化酶基因终止子AOX1TT序列。

所用引物序列如下：

MOXp-F：5'-TCTTCGACGCGGAGAACGATCTCCT-3'，

AOX1TT-R：5'-TCCGCACAAACGAAGGTCTC-3'。

将DNA片段1插入至YEp352载体的SmaI位点中，得到重组载体，将该重组载体命名 为pMOXUα-LSD1。

二、酵母菌转化及重组菌株筛选

利用限制性内切酶SacII酶切质粒pMOXUα-LSD1，得到线性化质粒pMOXUα-LSD1；通 过电转化法(Bio-Rad Gene-Pulser仪，1.5kV，50μF，200Ω，3mSec)将线性化质粒pMOXUα- LSD1转化实施例1的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HP7.89- ura3(宿主菌HP7.89-ura3)，转化菌液涂布在SC培养基平板上，37℃静置培养3-5d至形成单 菌落。

将SC平板上单菌落转接于1ml无菌水中，在室温条件下静置2-4h，分别对应点种于 SC、SCU和YPD平板上，37℃培养48小时，以宿主菌HP7.89-ura3为对照。结果宿主菌HP7.89- ura3在SC平板上不能生长，只能在SCU和YPD平板上生长，而转化pMOXUα-LSD1的单菌落在上 述各培养基平板上均能正常生长，说明线性化质粒pMOXUα-LSD1成功转化入宿主菌HP7.89- ura3，线性化质粒携带的酿酒酵母URA3基因互补了宿主菌的尿嘧啶合成缺陷，将含有线性 化质粒pMOXUα-LSD1的重组菌命名为HP-LSD1。

三、葡聚糖酶活性分析

将宿主菌HP7.89-ura3和随机挑取的5个重组菌HP-LSD1单菌落(HP-LSD1-1～HP- LSD1-5)分别接于5ml YPD培养基中，37℃、200rpm培养20h，离心收集细胞，无菌水洗两次 后，细胞重悬于10ml YPM培养基中，37℃、200rpm进行诱导培养72h，每12h补加甲醇至甲醇 的体积百分比浓度为1％。每24h取样，通过3,5-二硝基水扬酸法测定发酵液中及酵母细胞 内的葡聚糖酶活性(Kang HK,Kim SH,Park JY,Jin XJ,Oh DK,Kang SS,Kim D.Cloning and characterization of a dextranase gene from Lipomyces starkeyi and its expression in Saccharomyces cerevisiae.Yeast,2005,22:1239-1248)。总的葡聚糖酶 活性为细胞内酶活和发酵液中酶活的总和。具体方法如下：

溶液的配制：准确称取15mg葡萄糖，溶于蒸馏水中，获得终浓度为1mg/ml的葡萄糖 贮液；准确称取7.16g磷酸氢二钠，溶于蒸馏水中，用柠檬酸调pH至5.5，蒸馏水定容至 1000ml，得到柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(50mM，pH5.5)；准确称取2g葡聚糖T-70，溶于柠檬 酸-磷酸氢二钠缓冲液中，定容到100ml；准确称取8g氢氧化钠，溶于蒸馏水中，定容到 100ml，使终浓度为2mol/L；准确称取1g 3,5-二硝基水杨酸(DNS)，溶于20ml氢氧化钠溶液 和50ml蒸馏水中，加入30g四水合酒石酸钾钠，溶解后加水定容至100ml，得到DNS溶液，在避 光密闭容器中保存备用。

葡萄糖标准曲线：将浓度为1mg/ml的葡萄糖贮液进行适当稀释，分别获得浓度为 0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9和1.0mg/ml的葡萄糖溶液，取上述葡萄糖溶液各1ml于试管中，分 别加入1ml DNS溶液，混匀后，沸水浴中煮沸5min，冷却至室温后，加蒸馏水定容至5ml，以不 含葡萄糖的反应液为对照，测定540nm的光吸收值(OD540)，以葡萄糖浓度为横坐标，OD540为 纵坐标，绘制标准曲线，得到葡萄糖浓度和OD540之间的函数关系式：葡萄糖浓度(mg/ml)＝ (OD540+0.0317)/1.4602。

发酵液中葡聚糖酶活性测定：不同时间点取培养液5ml，6000rpm离心5min，分别收 集上清液和酵母细胞；分别取0.5ml上清液于对照试管和反应管中，其中反应管中加入 0.5ml 37℃预热的2％的葡聚糖溶液；对照管和反应管均在37℃保温30min，然后分别加入 1ml DNS溶液，混匀后，在对照管中加入0.5ml 2％的葡聚糖溶液；沸水浴煮沸5min；冷却至 室温后，对照管和反应管分别加入蒸馏水定容至5ml；以对照管调零，测定反应管OD540，依据 标准曲线函数式计算反应液中还原糖浓度。

细胞内葡聚糖酶活性测定：前述离心后收集的酵母细胞，用5ml蒸馏水悬浮， 6000rpm离心5min，按每克湿细胞10ml缓冲液的比例将酵母细胞重新悬浮于柠檬酸-磷酸氢 二钠缓冲液中，-80℃冷冻过夜；自然融化后，取0.5ml菌悬液于1.5ml离心管中，同时加入 25mg直径为0.45mm的玻璃珠，漩涡振荡4次，每次振荡1min，冰浴1min；4℃、6000rpm离心 10min，收集上清液；按前述方法测定上清液中葡聚糖酶活性。

酶活定义为：上述反应条件下，每分钟催化葡聚糖水解产生相当于1μmol葡萄糖的 还原糖所需的酶量为一个酶活单位(IU)。

结果如表1所示，在宿主菌发酵液中没有检测到葡聚糖酶活性，但在重组菌HP- LSD1的发酵液中检测到了葡聚糖酶活性。诱导培养72h后，总的葡聚糖酶活性最高达到 2050IU/L，其中发酵液中葡聚糖酶酶活为720IU/L。

上述结果表明葡聚糖酶在本发明的尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母HP7.89-ura3 中获得了功能性表达。

表1、不同菌株发酵液中葡聚糖酶活性及发酵结束总酶活

<110> 中国科学院微生物研究所、中国科学院大学

<120> 尿嘧啶营养缺陷型多形汉逊酵母及其制备方法与应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1842

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

aaccagtgaa tgaaaacgaa gagcccaact actacaagct aatacggcat cccgtggaca 60

ttaagagttt gggtaaagct attaggacgg gtgaaataaa gtcattcgac gagttggaat 120

ttgagcttca actgatgttc agcaacgcaa ttatgtacaa cgatatgaat cagacagaaa 180

cttacaaatg gacgattgaa atgatggaag aaacgcaaaa cttgttgagc ctattccggg 240

aatcatccag caattaaagc tcattaattg ccgcctctca tctggttcat caacatctgg 300

ttctgttcct ggaatcttaa accaactctt tcggagtgct tgaggaactt ttcagcgcac 360

ttgttcaaac atgtttcttc tctagagcta agtttgttgg aggtgaagtc gttgacgcaa 420

tcattaaaac atctgtccac caaactggtg tagagctgca atgttagttt tcagaaggcg 480

ttcacttact ctcatgaagt cattcatttg cttctgctcc acaattttct ggaattcttg 540

ctgttcttta tagttgagtt gatccatggt gtatcaaaaa taaactaatg aattatcgaa 600

aaattttcaa catttccctg aataataatc aacatgtata aatcttatgg agaaagggcg 660

aagtctcacc catctaaggt cgccagcaga ctacttaatt tgatggaatc caagcaaaca 720

aacctctgcg cttctgtgga tgtgactaaa actcaggaat tattggagct tcttgataaa 780

ctgggccctt acatctgcct tgtcaaaact catattgaca tagtagagga cttctcttat 840

gaacacacca ttttaccatt acaaggactt gcaaagaaac acaacttcat gatttttgaa 900

gacagaaagt ttgctgatat aggaaacaca gtcaaactac agtataaggg aggaatttat 960

cgaacatcca agtgggccga tatcacgaat gcacacggag tgactggcgc aggaattgtt 1020

gaaggtctta aacaggccgc agaagaaagt acagatgagc cacgtgggct tttgatgctt 1080

gctgagctct cttcaaaggg atcattagct accggtgagt atactcaaaa aactgtggaa 1140

atagcgaaaa gcgataaaga atttgtcatt ggatttattg cacagagaga catgggaggt 1200

cgtgaggaag gctttgactg gctgatcatg actccaggag ttggtttaga tgataaaggt 1260

gattctctgg gccaacagta cagaactgtt gatgaagtga tgcaaacagg aaccgatgtc 1320

attatcgttg gaagaggttt attcggaaaa ggaagagatc ctgaagtgga agggaagaga 1380

tacagaaatg ctgggtggga agcttacaag cggcgcattg cttaacggct ttcagttcta 1440

tatacatcgt caaaattgat tttcgctaaa atgctgacgg gatatttcga atacgaaaag 1500

cccaatagaa gtcgcgggaa tactagtgaa ggacgatctg aaaaagcctc tatagcagaa 1560

gccaaagagg gagaggtgag attttcgcca tcgttgtaga ataatatcaa atgtctcaat 1620

gtaagaatta tagtagagtt tgaagaagcg acgccgatcc agttgatgtg cttcgttgta 1680

gagatctaga gattcgagtc tagtcaggtg gaccttttga attttattga gtggatattg 1740

gattgcaagc agtgtagttg cggcggaagc tccagcaaga aggataaacg tcaaattcaa 1800

agctttgaaa aatcttgaat tcttttcccg gttttcttca cc 1842

<210> 2

<211> 1829

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

aacgaagagc ccaactacta caagctaata cggcatcccg tggacattaa gagtttgggt 60

aaagctatta ggacgggtga aataaagtca ttcgacgagt tggaatttga gcttcaactg 120

atgttcagca acgcaattat gtacaacgat atgaatcaga cagaaactta caaatggacg 180

attgaaatga tggaagaaac gcaaaacttg ttgagcctat tccgggaatc atccagcaat 240

taaagctcat taattgccgc ctctcatctg gttcatcaac atctggttct gttcctggaa 300

tcttaaacca actctttcgg agtgcttgag gaacttttca gcgcacttgt tcaaacatgt 360

ttcttctcta gagctaagtt tgttggaggt gaagtcgttg acgcaatcat taaaacatct 420

gtccaccaaa ctggtgtaga gctgcaatgt tagttttcag aaggcgttca cttactctca 480

tgaagtcatt catttgcttc tgctccacaa ttttctggaa ttcttgctgt tctttatagt 540

tgagttgatc catggtgtat caaaaataaa ctaatgaatt atcgaaaaat tttcaacatt 600

tccctgaata ataatcaaca tgtaataaat cttatggaga aagggcgaag tctcacccat 660

ctaaggtcgc cagcagacta cttaatttga tggaatccaa gcaaacaaac ctctgcgctt 720

ctgtggatgt gactaaaact caggaattat tggagcttct tgataaactg ggcccttaca 780

tctgccttgt caaaactcat attgacatag tagaggactt ctcttatgaa cacaccattt 840

taccattaca aggacttgca aagaaacaca acttcatgat ttttgaagac agaaagtttg 900

ctgatatagg aaacacagtc aaactacagt ataagggagg aatttatcga acatccaagt 960

gggccgatat cacgaatgca cacggagtga ctggcgcagg aattgttgaa ggtcttaaac 1020

aggccgcaga agaaagtaca gatgagccac gtgggctttt gatgcttgct gagctctctt 1080

caaagggatc attagctacc ggtgagtata ctcaaaaaac tgtggaaata gcgaaaagcg 1140

ataaagaatt tgtcattgga tttattgcac agagagacat gggaggtcgt gaggaaggct 1200

ttgactggct gatcatgact ccaggagttg gtttagatga taaaggtgat tctctgggcc 1260

aacagtacag aactgttgat gaagtgatgc aaacaggaac cgatgtcatt atcgttggaa 1320

gaggtttatt cggaaaagga agagatcctg aagtggaagg gaagagatac agaaatgctg 1380

ggtgggaagc ttacaagcgg cgcattgctt aacggctttc agttctatat acatcgtcaa 1440

aattgatttt cgctaaaatg ctgacgggat atttcgaata cgaaaagccc aatagaagtc 1500

gcgggaatac tagtgaagga cgatctgaaa aagcctctat agcagaagcc aaagagggag 1560

aggtgagatt ttcgccatcg ttgtagaata atatcaaatg tctcaatgta agaattatag 1620

tagagtttga agaagcgacg ccgatccagt tgatgtgctt cgttgtagag atctagagat 1680

tcgagtctag tcaggtggac cttttgaatt ttattgagtg gatattggat tgcaagcagt 1740

gtagttgcgg cggaagctcc agcaagaagg ataaacgtca aattcaaagc tttgaaaaat 1800

cttgaattct tttcccggtt ttcttcacc 1829

<210> 3

<211> 3975

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

agggagctca tccaattgtg acacgtccga cggcggccca cgggtcccag gcctcggaga 60

tccgtccccc ttttcctttg tcgatatcat gtaattagtt atgtcacgct tacattcacg 120

ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt agacaacctg aagtctaggt 180

ccctatttat ttttttatag ttatgttagt attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt 240

tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga 300

gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat ttgcaagctg gagaccaaca tgtgagcaaa 360

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggaagggcaa ttctgcagat atccatcaca 420

ctggcggccg ctcatgcatg agatcagatc ttcgacgcgg agaacgatct cctcgagctg 480

ctcgcggatc agcttgtggc ccggtaatgg aaccaggccg acgcgacgct ccttgcggac 540

cacggtggct ggcgagccca gtttgtgaac gaggtcgttt agaacgtcct gcgcaaagtc 600

cagtgtcaga tgaatgtcct cctcggacca attcagcatg ttctcgagca gccatctgtc 660

tttggagtag aagcgtaatc tctgctcctc gttactgtac cggaagaggt agtttgcctc 720

gccgcccata atgaacaggt tctctttctg gtggcctgtg agcagcgggg acgtctggac 780

ggcgtcgatg aggcccttga ggcgctcgta gtacttgttc cgtcgctgta gccggccgcg 840

gtgacgatac ccacatagag gtccttggcc attagtttga tgaggtgggg caggatgggc 900

gactcggcat cgaaattttt gccgtcgtcg tacagtgtga tgtcaccatc gaatgtaatg 960

agctgcagct tgcgatctcg gatggttttg gaatggaaga accgcgacat ctccaacagc 1020

tgggccgtgt tgagaatgag ccggacgtcg ttgaacgagg gggccacaag ccggcgtttg 1080

ctgatggcgc ggcgctcgtc ctcgatgtag aaggcctttt ccagaggcag tctcgtgaag 1140

aagctgccaa cgctcggaac cagctgcacg agccgagaca attcgggggt gccggctttg 1200

gtcatttcaa tgttgtcgtc gatgaggagt tcgaggtcgt ggaagatttc cgcgtagcgg 1260

cgttttgcct cagagtttac catgaggtcg tccactgcag agatgccgtt gctcttcacc 1320

gcgtacagga cgaacggcgt ggccagcagg cccttgatcc attctatgag gccatctcga 1380

cggtgttcct tgagtgcgta ctccactctg tagcgactgg acatctcgag actgggcttg 1440

ctgtgctgga tgcaccaatt aattgttgcc gcatgcatcc ttgcaccgca agtttttaaa 1500

acccactcgc tttagccgtc gcgtaaaact tgtgaatctg gcaactgagg gggttctgca 1560

gccgcaaccg aacttttcgc ttcgaggacg cagctggatg gtgtcatgtg aggctctgtt 1620

tgctggggta gcctacaacg tgaccttgcc taaccggacg gcgctaccca ctgctgtctg 1680

tgcctgctac cagaaaatca ccagagcagc agagggccga tgtggcaact ggtggggtgt 1740

cggacaggct gtttctccac agtgcaaatg cgggtgaacc ggccagaaag taaattctta 1800

tgctaccgtg cagcgactcc gacatcccca gtttttgccc tacttgatca cagatggggt 1860

cagcgctgcc gctaagtgta cccaaccgtc cccacacggt ccatctataa atactgctgc 1920

cagtgcacgg tggtgacatc aatctaaagt acaaaaacaa agcttaggaa gtctggtaat 1980

ggtaagccga tacgtacccg atatgggcga tctgatttgg gttgattttg acccgacaaa 2040

aggtagcgag caagctggac atcgtccagc tgttgtcctg agtcctttca tgtacaacaa 2100

caaaacaggt atgtgtctgt gtgttccttg tacaacgcaa tcaaaaggat atccgttcga 2160

agttgtttta tccggtcagg aacgtgatgg cgtagcgtta gctgatcagg taaaaagtat 2220

cgcctggcgg gcaagaggag caacgaagaa aggaacagtt gccccagagg aattacaact 2280

cattaaagcc aaaattaacg tactgattgg gtagtctaga acaaaaactc atctcagaag 2340

aggatctgaa tagcgccgtc gaccatcatc atcatcatca ttgagtttta gccttagaca 2400

tgactgttcc tcagttcaag ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct agattctaat 2460

caagaggatg tcagaatgcc atttgcctga gagatgcagg cttcattttt gatacttttt 2520

tatttgtaac ctatatagta taggattttt tttgtcattt tgtttcttct cgtacgagct 2580

tgctcctgat cagcctatct cgcagctgat gaatatcttg tggtaggggt ttgggaaaat 2640

cattcgagtt tgatgttttt cttggtattt cccactcctc ttcagagtac agaagattaa 2700

gtgagacctt cgtttgtgcg gatcccccac acaccatagc ttcaaaatgt ttctactcct 2760

tttttactct tccagatttt ctcggactcc gcgcatcgcc gtaccacttc aaaacaccca 2820

agcacagcat actaaatttt ccctctttct tcctctaggg tgtcgttaat tacccgtact 2880

aaaggtttgg aaaagaaaaa agagaccgcc tcgtttcttt ttcttcgtcg aaaaaggcaa 2940

taaaaatttt tatcacgttt ctttttcttg aaattttttt ttttagtttt tttctctttc 3000

agtgacctcc attgatattt aagttaataa acggtcttca atttctcaag tttcagtttc 3060

atttttcttg ttctattaca acttttttta cttcttgttc attagaaaga aagcatagca 3120

atctaatcta agggcggtgt tgacaattaa tcatcggcat agtatatcgg catagtataa 3180

tacgacaagg tgaggaacta aaccatggcc aagttgacca gtgccgttcc ggtgctcacc 3240

gcgcgcgacg tcgccggagc ggtcgagttc tggaccgacc ggctcgggtt ctcccgggac 3300

ttcgtggagg acgacttcgc cggtgtggtc cgggacgacg tgaccctgtt catcagcgcg 3360

gtccaggacc aggtggtgcc ggacaacacc ctggcctggg tgtgggtgcg cggcctggac 3420

gagctgtacg ccgagtggtc ggaggtcgtg tccacgaact tccgggacgc ctccgggccg 3480

gccatgaccg agatcggcga gcagccgtgg gggcgggagt tcgccctgcg cgacccggcc 3540

ggcaactgcg tgcacttcgt ggccgaggag caggactgac acgtccgacg gcggcccacg 3600

ggtcccaggc ctcggagatc cgtccccctt ttcctttgtc gatatcatgt aattagttat 3660

gtcacgctta cattcacgcc ctccccccac atccgctcta accgaaaagg aaggagttag 3720

acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt 3780

atttatattt caaatttttc ttttttttct gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat 3840

actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg acgctcgaag gctttaattt gcaagctgga 3900

gaccaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 3960

ggcatcgagc tccct 3975

<210> 4

<211> 2719

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

agtcagacga gggtaaggaa attacaaagg ttcttcaaga tctctcggat aaccagaaga 60

aagacggcca gattgtttta gatgaagaac agttggagaa aactttggaa atggccaaag 120

gtgacgcaca agaacctgaa gagaacgtgg acgataatga cgcagacaaa gagatcgatg 180

aaggtgtcga gcccgaggca gaatcatcgg ctcaatctca accggtcact gctttggaaa 240

aaagcagaac agagccatcg gaaacgcatt ccgaacctca agaaggccca gcgccaagct 300

ccgagttgaa tgtagaatca caaccccaaa cgaaattgga atccaagtcg gcttctaaag 360

aaataccatc gccaactcca gaacctgcta ccccatccac gccagcaagt ggagatgaag 420

aacgtgggag caagcgacgc ggatccgaaa gcgtcccccc tggttgtact aagcgcttta 480

atgctctttc tgcacaactt ctcacacaga tatcatccaa ccggtttgca tccatgttca 540

tgcaaccagt gaatgaaaac gaagagccca actactacaa gctaatacgg catcccgtgg 600

acattaagag tttgggtaaa gctattagga cgggtgaaat aaagtcattc gacgagttgg 660

aatttgagct tcaactgatg ttcagcaacg caattatgta caacgatatg aatcagacag 720

aaacttacaa atggacgatt gaaatgatgg aagaaacgca aaacttgttg agcctattcc 780

gggaatcatc cagcaattaa agctcattaa ttgccgcctc tcatctggtt catcaacatc 840

tggttctgtt cctggaatct taaaccaact ctttcggagt gcttgaggaa cttttcagcg 900

cacttgttca aacatgtttc ttctctagag ctaagtttgt tggaggtgaa gtcgttgacg 960

caatcattaa aacatctgtc caccaaactg gtgtagagct gcaatgttag ttttcagaag 1020

gcgttcactt actctcatga agtcattcat ttgcttctgc tccacaattt tctggaattc 1080

ttgctgttct ttatagttga gttgatccat ggtgtatcaa aaataaacta atgaattatc 1140

gaaaaatttt caacatttcc ctgaataata atcaacatgt ataaatctta tggagaaagg 1200

gcgaagtctc acccatctaa ggtcgccagc agactactta atttgatgga atccaagcaa 1260

acaaacctct gcgcttctgt ggatgtgact aaaactcagg aattattgga gcttcttgat 1320

aaactgggcc cttacatctg ccttgtcaaa actcatattg acatagtaga ggacttctct 1380

tatgaacaca ccattttacc attacaagga cttgcaaaga aacacaactt catgattttt 1440

gaagacagaa agtttgctga tataggaaac acagtcaaac tacagtataa gggaggaatt 1500

tatcgaacat ccaagtgggc cgatatcacg aatgcacacg gagtgactgg cgcaggaatt 1560

gttgaaggtc ttaaacaggc cgcagaagaa agtacagatg agccacgtgg gcttttgatg 1620

cttgctgagc tctcttcaaa gggatcatta gctaccggtg agtatactca aaaaactgtg 1680

gaaatagcga aaagcgataa agaatttgtc attggattta ttgcacagag agacatggga 1740

ggtcgtgagg aaggctttga ctggctgatc atgactccag gagttggttt agatgataaa 1800

ggtgattctc tgggccaaca gtacagaact gttgatgaag tgatgcaaac aggaaccgat 1860

gtcattatcg ttggaagagg tttattcgga aaaggaagag atcctgaagt ggaagggaag 1920

agatacagaa atgctgggtg ggaagcttac aagcggcgca ttgcttaacg gctttcagtt 1980

ctatatacat cgtcaaaatt gattttcgct aaaatgctga cgggatattt cgaatacgaa 2040

aagcccaata gaagtcgcgg gaatactagt gaaggacgat ctgaaaaagc ctctatagca 2100

gaagccaaag agggagaggt gagattttcg ccatcgttgt agaataatat caaatgtctc 2160

aatgtaagaa ttatagtaga gtttgaagaa gcgacgccga tccagttgat gtgcttcgtt 2220

gtagagatct agagattcga gtctagtcag gtggaccttt tgaattttat tgagtggata 2280

ttggattgca agcagtgtag ttgcggcgga agctccagca agaaggataa acgtcaaatt 2340

caaagctttg aaaaatcttg aattcttttc ccggttttct tcaccatgaa aaagccttga 2400

gcgccaatat tgataccact gtataactgc ttttgttttg tggaacccct ggtttttcac 2460

aagctcgaat actgaaaagt agaatgcaaa tccaaggctt tcctttatga aatttaaact 2520

aaagcctgca aatattccaa ctaaaccaat ttgttttagt ttgtataaag catactccca 2580

catgctcttc tgtttaccgc tgacaagctc tgagtaattc gatcgggcgt aaagtgcatc 2640

tagcggtgac gcagccacgc tagcagcagc tcccgcaaca aaaccagctt tgaaggtgtc 2700

gacagggcta ggatcatcg 2719

<210> 5

<211> 6683

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

agtcagacga gggtaaggaa attacaaagg ttcttcaaga tctctcggat aaccagaaga 60

aagacggcca gattgtttta gatgaagaac agttggagaa aactttggaa atggccaaag 120

gtgacgcaca agaacctgaa gagaacgtgg acgataatga cgcagacaaa gagatcgatg 180

aaggtgtcga gcccgaggca gaatcatcgg ctcaatctca accggtcact gctttggaaa 240

aaagcagaac agagccatcg gaaacgcatt ccgaacctca agaaggccca gcgccaagct 300

ccgagttgaa tgtagaatca caaccccaaa cgaaattgga atccaagtcg gcttctaaag 360

aaataccatc gccaactcca gaacctgcta ccccatccac gccagcaagt ggagatgaag 420

aacgtgggag caagcgacgc ggatccgaaa gcgtcccccc tggttgtact aagcgcttta 480

atgctctttc tgcacaactt ctcacacaga tatcatccaa ccggtttgca tccatgttca 540

tgcaaccagt gaatgaaaac gaagagccca actactacaa gctaatacgg catcccgtgg 600

acattaagag tttgggtaaa gctattagga cgggtgaaat aaagtcattc gacgagttgg 660

aatttgagct tcaactgatg ttcagcaacg caattatgta caacgatatg aatcagacag 720

aaacttacaa atggacgatt gaaatgatgg aagaaacgca aaacttgttg agcctattcc 780

gggaatcatc cagcaattaa agctcattaa ttgccgcctc tcatctggtt catcaacatc 840

tggttctgtt cctggaatct taaaccaact ctttcggagt gcttgaggaa cttttcagcg 900

cacttgttca aacatgtttc ttctctagag ctaagtttgt tggaggtgaa gtcgttgacg 960

caatcattaa aacatctgtc caccaaactg gtgtagagct gcaatgttag ttttcagaag 1020

gcgttcactt actctcatga agtcattcat ttgcttctgc tccacaattt tctggaattc 1080

ttgctgttct ttatagttga gttgatccat ggtgtatcaa aaataaacta atgaattatc 1140

gaaaaatttt caacatttcc ctgaataata atcaacatgt aataaatctt atggagaaag 1200

ggcgaagtct cacccatcta aggtcgccag cagactactt aatttgatgg aatccaagca 1260

aacaaacctc tgcgcttctg tggatgtgac taaaactcag gaattattgg agcttcttga 1320

taaactgggc ccttacatct gccttgtcaa aactcatatt gacatagtag aggacttctc 1380

ttatgaacac accattttac cattacaagg acttgcaaag aaacacaact tcatgatttt 1440

tgaagacaga aagtttgctg atataggaaa cacagtcaaa ctacagtata agggaggaat 1500

ttatcgaaca tccaagtggg ccgatatcac gaatgcacac ggagtgactg gcgcaggaat 1560

tgttgaaggt cttaaacagg ccgcagaaga aagtacagat gagccacgtg ggcttttgat 1620

gcttgctgag ctcatccaat tgtgacacgt ccgacggcgg cccacgggtc ccaggcctcg 1680

gagatccgtc ccccttttcc tttgtcgata tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt 1740

cacgccctcc ccccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct 1800

aggtccctat ttattttttt atagttatgt tagtattaag aacgttattt atatttcaaa 1860

tttttctttt ttttctgtac agacgcgtgt acgcatgtaa cattatactg aaaaccttgc 1920

ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa gctggagacc aacatgtgag 1980

caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggaagg gcaattctgc agatatccat 2040

cacactggcg gccgctcatg catgagatca gatcttcgac gcggagaacg atctcctcga 2100

gctgctcgcg gatcagcttg tggcccggta atggaaccag gccgacgcga cgctccttgc 2160

ggaccacggt ggctggcgag cccagtttgt gaacgaggtc gtttagaacg tcctgcgcaa 2220

agtccagtgt cagatgaatg tcctcctcgg accaattcag catgttctcg agcagccatc 2280

tgtctttgga gtagaagcgt aatctctgct cctcgttact gtaccggaag aggtagtttg 2340

cctcgccgcc cataatgaac aggttctctt tctggtggcc tgtgagcagc ggggacgtct 2400

ggacggcgtc gatgaggccc ttgaggcgct cgtagtactt gttccgtcgc tgtagccggc 2460

cgcggtgacg atacccacat agaggtcctt ggccattagt ttgatgaggt ggggcaggat 2520

gggcgactcg gcatcgaaat ttttgccgtc gtcgtacagt gtgatgtcac catcgaatgt 2580

aatgagctgc agcttgcgat ctcggatggt tttggaatgg aagaaccgcg acatctccaa 2640

cagctgggcc gtgttgagaa tgagccggac gtcgttgaac gagggggcca caagccggcg 2700

tttgctgatg gcgcggcgct cgtcctcgat gtagaaggcc ttttccagag gcagtctcgt 2760

gaagaagctg ccaacgctcg gaaccagctg cacgagccga gacaattcgg gggtgccggc 2820

tttggtcatt tcaatgttgt cgtcgatgag gagttcgagg tcgtggaaga tttccgcgta 2880

gcggcgtttt gcctcagagt ttaccatgag gtcgtccact gcagagatgc cgttgctctt 2940

caccgcgtac aggacgaacg gcgtggccag caggcccttg atccattcta tgaggccatc 3000

tcgacggtgt tccttgagtg cgtactccac tctgtagcga ctggacatct cgagactggg 3060

cttgctgtgc tggatgcacc aattaattgt tgccgcatgc atccttgcac cgcaagtttt 3120

taaaacccac tcgctttagc cgtcgcgtaa aacttgtgaa tctggcaact gagggggttc 3180

tgcagccgca accgaacttt tcgcttcgag gacgcagctg gatggtgtca tgtgaggctc 3240

tgtttgctgg ggtagcctac aacgtgacct tgcctaaccg gacggcgcta cccactgctg 3300

tctgtgcctg ctaccagaaa atcaccagag cagcagaggg ccgatgtggc aactggtggg 3360

gtgtcggaca ggctgtttct ccacagtgca aatgcgggtg aaccggccag aaagtaaatt 3420

cttatgctac cgtgcagcga ctccgacatc cccagttttt gccctacttg atcacagatg 3480

gggtcagcgc tgccgctaag tgtacccaac cgtccccaca cggtccatct ataaatactg 3540

ctgccagtgc acggtggtga catcaatcta aagtacaaaa acaaagctta ggaagtctgg 3600

taatggtaag ccgatacgta cccgatatgg gcgatctgat ttgggttgat tttgacccga 3660

caaaaggtag cgagcaagct ggacatcgtc cagctgttgt cctgagtcct ttcatgtaca 3720

acaacaaaac aggtatgtgt ctgtgtgttc cttgtacaac gcaatcaaaa ggatatccgt 3780

tcgaagttgt tttatccggt caggaacgtg atggcgtagc gttagctgat caggtaaaaa 3840

gtatcgcctg gcgggcaaga ggagcaacga agaaaggaac agttgcccca gaggaattac 3900

aactcattaa agccaaaatt aacgtactga ttgggtagtc tagaacaaaa actcatctca 3960

gaagaggatc tgaatagcgc cgtcgaccat catcatcatc atcattgagt tttagcctta 4020

gacatgactg ttcctcagtt caagttgggc acttacgaga agaccggtct tgctagattc 4080

taatcaagag gatgtcagaa tgccatttgc ctgagagatg caggcttcat ttttgatact 4140

tttttatttg taacctatat agtataggat tttttttgtc attttgtttc ttctcgtacg 4200

agcttgctcc tgatcagcct atctcgcagc tgatgaatat cttgtggtag gggtttggga 4260

aaatcattcg agtttgatgt ttttcttggt atttcccact cctcttcaga gtacagaaga 4320

ttaagtgaga ccttcgtttg tgcggatccc ccacacacca tagcttcaaa atgtttctac 4380

tcctttttta ctcttccaga ttttctcgga ctccgcgcat cgccgtacca cttcaaaaca 4440

cccaagcaca gcatactaaa ttttccctct ttcttcctct agggtgtcgt taattacccg 4500

tactaaaggt ttggaaaaga aaaaagagac cgcctcgttt ctttttcttc gtcgaaaaag 4560

gcaataaaaa tttttatcac gtttcttttt cttgaaattt ttttttttag tttttttctc 4620

tttcagtgac ctccattgat atttaagtta ataaacggtc ttcaatttct caagtttcag 4680

tttcattttt cttgttctat tacaactttt tttacttctt gttcattaga aagaaagcat 4740

agcaatctaa tctaagggcg gtgttgacaa ttaatcatcg gcatagtata tcggcatagt 4800

ataatacgac aaggtgagga actaaaccat ggccaagttg accagtgccg ttccggtgct 4860

caccgcgcgc gacgtcgccg gagcggtcga gttctggacc gaccggctcg ggttctcccg 4920

ggacttcgtg gaggacgact tcgccggtgt ggtccgggac gacgtgaccc tgttcatcag 4980

cgcggtccag gaccaggtgg tgccggacaa caccctggcc tgggtgtggg tgcgcggcct 5040

ggacgagctg tacgccgagt ggtcggaggt cgtgtccacg aacttccggg acgcctccgg 5100

gccggccatg accgagatcg gcgagcagcc gtgggggcgg gagttcgccc tgcgcgaccc 5160

ggccggcaac tgcgtgcact tcgtggccga ggagcaggac tgacacgtcc gacggcggcc 5220

cacgggtccc aggcctcgga gatccgtccc ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag 5280

ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag 5340

ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt atttttttat agttatgtta gtattaagaa 5400

cgttatttat atttcaaatt tttctttttt ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca 5460

ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta atttgcaagc 5520

tggagaccaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 5580

tgctggcatc gagctctctt caaagggatc attagctacc ggtgagtata ctcaaaaaac 5640

tgtggaaata gcgaaaagcg ataaagaatt tgtcattgga tttattgcac agagagacat 5700

gggaggtcgt gaggaaggct ttgactggct gatcatgact ccaggagttg gtttagatga 5760

taaaggtgat tctctgggcc aacagtacag aactgttgat gaagtgatgc aaacaggaac 5820

cgatgtcatt atcgttggaa gaggtttatt cggaaaagga agagatcctg aagtggaagg 5880

gaagagatac agaaatgctg ggtgggaagc ttacaagcgg cgcattgctt aacggctttc 5940

agttctatat acatcgtcaa aattgatttt cgctaaaatg ctgacgggat atttcgaata 6000

cgaaaagccc aatagaagtc gcgggaatac tagtgaagga cgatctgaaa aagcctctat 6060

agcagaagcc aaagagggag aggtgagatt ttcgccatcg ttgtagaata atatcaaatg 6120

tctcaatgta agaattatag tagagtttga agaagcgacg ccgatccagt tgatgtgctt 6180

cgttgtagag atctagagat tcgagtctag tcaggtggac cttttgaatt ttattgagtg 6240

gatattggat tgcaagcagt gtagttgcgg cggaagctcc agcaagaagg ataaacgtca 6300

aattcaaagc tttgaaaaat cttgaattct tttcccggtt ttcttcacca tgaaaaagcc 6360

ttgagcgcca atattgatac cactgtataa ctgcttttgt tttgtggaac ccctggtttt 6420

tcacaagctc gaatactgaa aagtagaatg caaatccaag gctttccttt atgaaattta 6480

aactaaagcc tgcaaatatt ccaactaaac caatttgttt tagtttgtat aaagcatact 6540

cccacatgct cttctgttta ccgctgacaa gctctgagta attcgatcgg gcgtaaagtg 6600

catctagcgg tgacgcagcc acgctagcag cagctcccgc aacaaaacca gctttgaagg 6660

tgtcgacagg gctaggatca tcg 6683

<210> 6

<211> 991

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

gtccaccaaa ctggtgtaga gctgcaatgt tagttttcag aaggcgttca cttactctca 60

tgaagtcatt catttgcttc tgctccacaa ttttctggaa ttcttgctgt tctttatagt 120

tgagttgatc catggtgtat caaaaataaa ctaatgaatt atcgaaaaat tttcaacatt 180

tccctgaata ataatcaaca tgtataaatc ttatggagaa agggcgaagt ctcacccatc 240

taaggtcgcc agcagactac ttaatttgat ggaatccaag caaacaaacc tctgcgcttc 300

tgtggatgtg actaaaactc aggaattatt ggagcttctt gataaactgg gcccttacat 360

ctgccttgtc aaaactcata ttgacatagt agaggacttc tcttatgaac acaccatttt 420

accattacaa ggacttgcaa agaaacacaa cttcatgatt tttgaagaca gaaagtttgc 480

tgatatagga aacacagtca aactacagta taagggagga atttatcgaa catccaagtg 540

ggccgatatc acgaatgcac acggagtgac tggcgcagga attgttgaag gtcttaaaca 600

ggccgcagaa gaaagtacag atgagccacg tgggcttttg atgcttgctg agctctcttc 660

aaagggatca ttagctaccg gtgagtatac tcaaaaaact gtggaaatag cgaaaagcga 720

taaagaattt gtcattggat ttattgcaca gagagacatg ggaggtcgtg aggaaggctt 780

tgactggctg atcatgactc caggagttgg tttagatgat aaaggtgatt ctctgggcca 840

acagtacaga actgttgatg aagtgatgca aacaggaacc gatgtcatta tcgttggaag 900

aggtttattc ggaaaaggaa gagatcctga agtggaaggg aagagataca gaaatgctgg 960

gtgggaagct tacaagcggc gcattgctta a 991

<210> 7

<211> 1397

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

gtccaccaaa ctggtgtaga gctgcaatgt tagttttcag aaggcgttca cttactctca 60

tgaagtcatt catttgcttc tgctccacaa ttttctggaa ttcttgctgt tctttatagt 120

tgagttgatc catggtgtat caaaaataaa ctaatgaatt atcgaaaaat tttcaacatt 180

tccctgaata ataatcaaca tgtaataaat cttatggaga aagggcgaag tctcacccat 240

ctaaggtcgc cagcagacta cttaatttga tggaatccaa gcaaacaaac ctctgcgctt 300

ctgtggatgt gactaaaact caggaattat tggagcttct tgataaactg ggcccttaca 360

tctgccttgt caaaactcat attgacatag tagaggactt ctcttatgaa cacaccattt 420

taccattaca aggacttgca aagaaacaca acttcatgat ttttgaagac agaaagtttg 480

ctgatatagg aaacacagtc aaactacagt ataagggagg aatttatcga acatccaagt 540

gggccgatat cacgaatgca cacggagtga ctggcgcagg aattgttgaa ggtcttaaac 600

aggccgcaga agaaagtaca gatgagccac gtgggctttt gatgcttgct gagctcatcc 660

aattgtgaca cgtccgacgg cggcccacgg gtcccaggcc tcggagatcc gtcccccttt 720

tcctttgtcg atatcatgta attagttatg tcacgcttac attcacgccc tccccccaca 780

tccgctctaa ccgaaaagga aggagttaga caacctgaag tctaggtccc tatttatttt 840

tttatagtta tgttagtatt aagaacgtta tttatatttc aaatttttct tttttttctg 900

tacagacgcg tgtacgcatg taacattata ctgaaaacct tgcttgagaa ggttttggga 960

cgctcgaagg ctttaatttg caagctggag accaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 1020

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcatcgagct ctcttcaaag ggatcattag 1080

ctaccggtga gtatactcaa aaaactgtgg aaatagcgaa aagcgataaa gaatttgtca 1140

ttggatttat tgcacagaga gacatgggag gtcgtgagga aggctttgac tggctgatca 1200

tgactccagg agttggttta gatgataaag gtgattctct gggccaacag tacagaactg 1260

ttgatgaagt gatgcaaaca ggaaccgatg tcattatcgt tggaagaggt ttattcggaa 1320

aaggaagaga tcctgaagtg gaagggaaga gatacagaaa tgctgggtgg gaagcttaca 1380

agcggcgcat tgcttaa 1397

<210> 8

<211> 4033

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

tcttcgacgc ggagaacgat ctcctcgagc tgctcgcgga tcagcttgtg gcccggtaat 60

ggaaccaggc cgacgcgacg ctccttgcgg accacggtgg ctggcgagcc cagtttgtga 120

acgaggtcgt ttagaacgtc ctgcgcaaag tccagtgtca gatgaatgtc ctcctcggac 180

caattcagca tgttctcgag cagccatctg tctttggagt agaagcgtaa tctctgctcc 240

tcgttactgt accggaagag gtagtttgcc tcgccgccca taatgaacag gttctctttc 300

tggtggcctg tgagcagcgg ggacgtctgg acggcgtcga tgaggccctt gaggcgctcg 360

tagtacttgt tccgtcgctg tagccggccg cggtgacgat acccacatag aggtccttgg 420

ccattagttt gatgaggtgg ggcaggatgg gcgactcggc atcgaaattt ttgccgtcgt 480

cgtacagtgt gatgtcacca tcgaatgtaa tgagctgcag cttgcgatct cggatggttt 540

tggaatggaa gaaccgcgac atctccaaca gctgggccgt gttgagaatg agccggacgt 600

cgttgaacga gggggccaca agccggcgtt tgctgatggc gcggcgctcg tcctcgatgt 660

agaaggcctt ttccagaggc agtctcgtga agaagctgcc aacgctcgga accagctgca 720

cgagccgaga caattcgggg gtgccggctt tggtcatttc aatgttgtcg tcgatgagga 780

gttcgaggtc gtggaagatt tccgcgtagc ggcgttttgc ctcagagttt accatgaggt 840

cgtccactgc agagatgccg ttgctcttca ccgcgtacag gacgaacggc gtggccagca 900

ggcccttgat ccattctatg aggccatctc gacggtgttc cttgagtgcg tactccactc 960

tgtagcgact ggacatctcg agactgggct tgctgtgctg gatgcaccaa ttaattgttg 1020

ccgcatgcat ccttgcaccg caagttttta aaacccactc gctttagccg tcgcgtaaaa 1080

cttgtgaatc tggcaactga gggggttctg cagccgcaac cgaacttttc gcttcgagga 1140

cgcagctgga tggtgtcatg tgaggctctg tttgctgggg tagcctacaa cgtgaccttg 1200

cctaaccgga cggcgctacc cactgctgtc tgtgcctgct accagaaaat caccagagca 1260

gcagagggcc gatgtggcaa ctggtggggt gtcggacagg ctgtttctcc acagtgcaaa 1320

tgcgggtgaa ccggccagaa agtaaattct tatgctaccg tgcagcgact ccgacatccc 1380

cagtttttgc cctacttgat cacagatggg gtcagcgctg ccgctaagtg tacccaaccg 1440

tccccacacg gtccatctat aaatactgct gccagtgcac ggtggtgaca tcaatctaaa 1500

gtacaaaaac aaagcttcga aacgatgaga tttccttcaa tttttactgc tgttttattc 1560

gcagcatcct ccgcattagc tgctccagtc aacactacaa cagaagatga aacggcacaa 1620

attccggctg aagctgtcat cggttactca gatttagaag gggatttcga tgttgctgtt 1680

ttgccatttt ccaacagcac aaataacggg ttattgttta taaatactac tattgccagc 1740

attgctgcta aagaagaagg ggtatctctc gagaaaagag aggctgaagc tgaattcatg 1800

acattaatct acgtgccttc aatatttaca atggtcccct caatcacacg gattgtactg 1860

gttaacattc tgttggcgac gttggttttg ggagctgcag tccttccacg agacaacaga 1920

actgtttgcg ggagtcaact ctgcacatgg tggcacgact ccggcgagat aaacaccggt 1980

actcctgtac aggcaggaaa cgttcgacaa tcccgaaagt actctgtcca tgtgagcctg 2040

gcagaccgta accaattcta cgactctttc gtatatgaat cgatacctag gaacggcaat 2100

ggcagaattt attctcccac cgacccacct aacagcaata cattgaatag tagcattgac 2160

gacggtatat caatcgaacc atctctcggc atcaacatgg cttggtccca gttcgaatat 2220

agacgagatg tcgacattaa gattactaca atcgatggct caatattgga tggccctttg 2280

gacattgtta ttcggccgac ttctgttaag tactcagtca aaagatgtgt gggtggtatc 2340

attattagag tcccttatga tcccaatggt cgaaaattct ctgttgagtt aaagagtgac 2400

ctttacagtt acctctccga cggttcgcaa tatgtgacct ctggagggag cgtggttggt 2460

gtggagccaa aaaatgccct ggtgatcttt gccagccctt tcttgccacg ggatatggtt 2520

cctcatatga caccacacga cacccagaca atgaagccgg gcccaatcaa taatggggac 2580

tggggttcaa agcctatact ctacttcccg cctggcgtat actggatgaa cgaggatacc 2640

tctggtaacc ccgggaagct cggctcaaat catatgcggc tggatcccaa tacctactgg 2700

gtccatctag ccccaggagc ctatgtgaaa ggagccattg agtatttcac gaagcaaaat 2760

ttctatgcaa cgggtcatgg cgttctctca ggtgagaact atgtttatca ggccaatgca 2820

gctgataact actatgccgt caagagtgat ggcacaagct tgagaatgtg gtggcacaac 2880

aaccttggag gcggtcaaac atggttttgc atggggccca ccattaatgc accgccgttt 2940

aatacgatgg acttcaacgg aaactctaat atttccagcc ggattagtga ctataagcag 3000

gttggcgctt attttttcca aacagacgga ccggagatct acgaggacag tgttgtccat 3060

gacgtcttct ggcatgttaa tgatgatgcc atcaagacat attattccgg agcttcaatt 3120

tcacgagcaa ccatctggag gtgtcacaat gacccgatca tacagatggg ctggacgtca 3180

cgaaatctca ccggaatcag cattgataac ctgcacgtca tccacacgag atatttcaaa 3240

tctgaaacag tggttccttc agcaatcatt ggagcgtctc cattctacgc aagtggaatg 3300

actgttgatc ccagcgagtc catcagcatg accatctcta acgtggtgtg tgagggtcta 3360

tgcccctcac tgttccgtat cactccgctt cagagctaca acaaccttgt tgtcaagaac 3420

gtggcctttc ccgatggact gcagacaaat ccaatcggaa taggagagag cattatacca 3480

gcagcttccg gctgtacaat ggacttggaa atcacaaact ggaccgtcaa aggacaaaaa 3540

gtcaccatgc aaaactttca gtccgggtca cttggccagt tcgatatcga tggttcatac 3600

tggggtcaat ggtccataaa ctaatctaga acaaaaactc atctcagaag aggatctgaa 3660

tagcgccgtc gaccatcatc atcatcatca ttgagtttgt agccttagac atgactgttc 3720

ctcagttcaa gttgggcact tacgagaaga ccggtcttgc tagattctaa tcaagaggat 3780

gtcagaatgc catttgcctg agagatgcag gcttcatttt tgatactttt ttatttgtaa 3840

cctatatagt ataggatttt ttttgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc ttgctcctga 3900

tcagcctatc tcgcagctga tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa tcattcgagt 3960

ttgatgtttt tcttggtatt tcccactcct cttcagagta cagaagatta agtgagacct 4020

tcgtttgtgc gga 4033