鸡传染性支气管炎致弱疫苗株LDL?T株及其应用

本发明涉及鸡传染性支气管炎致弱疫苗株LDL-T株及其应用，属于鸡传染性支气 管炎的防治领域。

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎 病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的一种急性、高度接触传染性、病毒性呼吸 道疾病，其引起的病理特征因病毒类型不同而有巨大差异，“呼吸病变型”主要表现为病鸡 咳嗽、打喷嚏、气管啰音；“肾脏病变型”发病初期表现为“呼吸型”临床症状之外，发病后期 表现为肾脏肿大、苍白，输尿管扩张、有大量尿酸盐沉积，外观呈现典型的“花斑肾”；“生殖 系统病变型”除了初期表现“呼吸病变型”临床症状外，雏鸡感染后成年母鸡表现为输卵管 等生殖系统产生病变，而成为“假母鸡”，给养禽业造成重大的经济损失。

鸡传染性支气管炎于1930年在美国北达科塔州首次发现。早期的研究表明，鸡传 染性支气管炎病毒主要侵害雏鸡的呼吸道(呼吸型IB)，也危害育成鸡和产蛋鸡，使之抵 抗力降低、产蛋量及蛋的品质下降。1962年Winterfield和Hitchner在美国报道了致肾脏病 变型IB的出现。1956年Jungherr报到了1951年分离的康涅狄格株(Connecticut，以下简称 Conn)和1941年分离的马萨诸塞株(Massachusetts，以下简称Mass)可引起类似的疾病，但 不能交叉保护或交叉中和，从而证明IBV不只一个血清型。

中国在1953年就有呼吸型IB发生的报道，1972年邝荣禄在广东首次确诊IB在中国 的存在。目前，IBV在中国大部分地区流行，而且在中国免疫鸡和非免疫鸡中有新基因 型的肾致病型IBV在流行，根据近年来我国流行病学研究，表明我国主要LX4型、Mass型、4/ 91型、ck/CH/LDL/97I型、TW I型、LZ05型等多种基因型的病毒株，因传染性支气管炎病毒血 清型众多，且不同血清型之间无交叉反应性或交叉反应性小，因此，该病的防控异常困难。 随着近年来不同国家和地区发现不同的变异株，出现越来越多的血清型，据不完全统计，目 前已超过20种不同的血清型，因而鉴定病毒血清型没有完全的条件。但是研究显示，病毒结 构蛋白尤其是病毒表面的纤突蛋白S1基因与病毒的抗原性密切相关，鉴于此目前国际上均 采用病毒的基因型来反应病毒的血清类型。

免疫接种是防治该病的最有效手段。IB疫苗免疫模式往往是以活疫苗免疫幼龄 鸡、种鸡或产蛋鸡，后期则用灭活苗进行加强免疫。从目前来看，世界上多数地区应用的疫 苗为Mass型疫苗，部分地区也允许使用其他一种或多种疫苗。由于大量研究表明特定血清 型或基因型的疫苗能对同源的流行野毒株提供很好的保护，但往往也对其他不同的免疫保 护型、不同血清型或者不同基因型毒株提供部分保护。按照疫苗应用原则，一个国家或地区 只能应用已存在病毒类型的相应疫苗。然而各地区尤其是养禽业密集区域如中国流行IBV 毒株复杂多样，研制和应用针对每一种变异株的疫苗显得并不实际，而且根据生物安全基 本理论和IBV病毒特点，研制新的疫苗只能针对占据主导流行趋势的毒株，正如美国针对流 行的Ark型毒株研制的Ark型疫苗，欧洲针对本地区广泛流行的4/91开发的4/91型疫苗。近 年来，TW I型毒株在我国成为主导流行毒株，并且造成明显的输卵管生殖道损伤，给蛋鸡养 殖业造成重大的经济损失，针对我国该型毒株目前市场上的疫苗不能够有效预防该毒株的 感染和流行，因而研究开发新的具有较好保护力的IB弱毒疫苗显得尤为重要。

本发明主要所要解决的技术问题是克服现有疫苗株不能够有效防制TW I型鸡传 染性支气管炎病毒流行毒株的攻击，目前现有的IB疫苗防制效果不理想等缺陷，提供一株 新的鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株，该弱毒疫苗株能够有效抵抗TW I型传染性支气管炎病 毒的攻击，可提供良好的免疫保护效力。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

本发明将TW I型传染性支气管炎病毒野生强毒株ck/CH/LDL/140520毒株进行连 续梯度低温冷适应传代致弱培养，最终筛选获得一株具有良好免疫保护效力的鸡传染性支 气管炎冷适应弱毒或疫苗株(LDL-T株)，分类命名：传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus)，其于2016年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，保藏编号是：CGMCC No.12549，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研究所。

本发明鸡传染性支气管炎冷适应弱毒疫苗株(LDL-T株)的形态学观察：LDL-T株病 毒尿囊液经离心、磷钨酸负染后在电镱下可见到直径经为80-120nm的冠状毒，病毒粒子呈 多形性，多数为圆形，有囊膜，表面有呈松散、均匀排列的冠状突起。

由于弱毒疫苗株LDL-T株是由TW I型野生型毒株ck/CH/LDL/140520强毒株在鸡胚 持续逐级降温培育驯化而获得的子代毒株，参照本发明说明书中实施例1中的方法，本领域 普通技术人员将有可能应用从LDL-T株培育和分离子代亚克隆毒株，另外，公开的毒株进一 步传代或利用不同条件培养获得毒株均完全在病毒学领域技术人员的普通技能之内，因 此，以上LDL-T株及其子代毒均在本发明范围之内。

本发明提供的连续梯度冷适应弱毒疫苗株LDL-T全基因序列如SEQ ID NO:1所示。 以类似本发明公开的方式，从冷适应弱毒疫苗株LDL-T及亲本毒分离或培育的类似克隆毒 株也应在本发明的保护范围之内。本发明冷适应弱毒疫苗株与亲本野毒株进化关系紧密， 本领域技术人员可通过培育或分离的子代亚克隆毒株基因与亲本毒ck/CH/LDL/140520株 基因的对比，可发现本发明涉及弱毒疫苗毒株的基因在多处发生了突变(详见表18)。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种预防或鸡传染性支气管炎的 疫苗，由本发明冷适应弱毒疫苗株LDL-T株和冻干保护剂组成。

本发明所述的预防或鸡传染性支气管炎疫苗可参考以下方法制备得到：(1) 将本发明弱毒疫苗株培养增殖得到生产用毒种；将生产用毒种接种于鸡胚尿囊腔内，培养， 收获病毒尿囊液；(2)经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液与冻干保护剂混合配 苗，即得。

其中，步骤(2)中将病毒液与冻干保护剂按照8：1的体积比进行配苗；所述的冻干 保护剂优选主要由蔗糖和明胶(8％明胶、40％蔗糖保护剂)或者脱脂牛乳组成。

本发明鸡传染性支气管炎疫苗的使用方法：

(1)接种途径：滴鼻或点眼。

(2)接种剂量：1羽份。

本发明鸡传染性支气管炎疫苗免疫后20天产生免疫力，一次免疫持续期为不少于 5个月。本发明弱毒株除了作为单苗使用外，还可用于制备联苗等。

免疫效力评价实验表明，本发明提供的LDL-T株(P75代毒)具有良好的免疫保护 性，主动免疫保护率为80％以上，说明本发明毒株对TW-I型鸡传染性支气管炎具有良好的 保护效力，可有效保护鸡抵抗传染性支气管炎病毒强毒的攻击。安全性试验结果表明，本发 明鸡传染性支气管炎弱毒活疫苗(LDL-T株)对雏鸡和产蛋种鸡安全，无副反应，安全性好。

生物材料保藏

一株鸡传染性支气管炎冷适应弱毒或疫苗株LDL-T株，分类命名：传染性支气管炎 病毒(Infectious Bronchitis Virus)，于2016年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，保藏编号是CGMCC No.12549，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所。

图1 ck/CH/LDL/140520强毒和致弱毒致病性对比，

图A～C：原代毒攻毒后死亡鸡肾脏出现花斑肾、免疫组化可见显著病毒抗原，同时 攻毒后形成母鸡输卵管液化；图D～F：LDL-T(ck/CH/LDL/140520P75代)攻毒后捕杀鸡肾脏 未出现病变、免疫组化未见病毒抗原，同时攻毒后母鸡输卵管正常，并形成正常卵泡。

图2不同基因型的传染性支气管炎病毒株遗传关系图谱。

实施例1鸡传染性支气管炎弱毒疫苗株LDL-T株的培育及鉴定

1材料与方法

1.1病毒株ck/CH/LDL/140520的梯度冷适应传代致弱

为了保证传染性支气管炎病毒能够通过鸡胚连续传代过程中达到快速且稳定地 致弱病毒，使用9-10日龄SPF鸡胚对IBV强毒株ck/CH/LDL/140520株进行连续梯度降温冷适 应传代培养，传代过程均通过鸡胚尿囊腔接种5枚鸡胚，每胚接种0.1ml的方式进行培养，致 弱过程的培养条件为：首先从37℃开始传代20个代次，每代次孵育72h，72h后，将鸡胚取出 置2-8℃，冷却18-24h后，观察鸡胚病变情况，无菌收集鸡胚尿囊液，进行下一次传代，传代 至20代时降低孵育温度至35℃，在该温度下疫上述相同传代方式连续传代10个代次，此后 再以31℃为孵育温度连续传代10个代次，最后再以29℃为孵育温度连续传代10个代次，期 间每10代将种毒返回至37℃孵育，留作种子毒。传代至60代次后在37℃孵育条件下连续传 代15代，即得本发明弱毒疫苗株LDL-T株(P75代毒)。

1.2病毒滴度测定

取ck/CH/LDL/140520传代过程中的P20、P40、P60和P75代次种子毒，分别依次作10 倍系列稀释；选择4个稀释倍数(104～107或105～108)的病毒悬液分别接种5枚9～10日龄的 SPF鸡胚，每枚鸡胚接种100μL，将鸡胚置37℃温箱内孵育1周，每天照胚，记录1周内鸡胚的 感染数和生存数，按Reed-Muench法计算EID50。

1.3无菌检验和支原体检验

分别将ck/CH/LDL/140520株传代过程中的P20、P40、P60和P75代次种子毒按现行 《中华人民共和国兽药典》附录进行无菌检验和支原体检验。

1.4外源病毒检验

1.4.1血凝性检测

分别将ck/CH/LDL/140520株传代过程中的P20、P40、P60和P75代次种子毒进行血 凝性病原的检测，其中包括禽腺病毒、新城疫病毒、H5和H9亚型禽流感病毒以及呼肠孤病毒 等。

1.4.2用鸡胚进行外源病毒检测(病毒的特异性检验)

取病毒样品ck/CH/LDL/140520传代过程中的P20、P40、P60和P75代次种子毒，稀释 成每剂量102.0EID50/0.1ml，与抗传染性支气管炎病毒特异性抗血清混合，进行中和，取9～ 10日龄SPF鸡胚10枚，每枚鸡胚尿囊腔接种病毒样品悬液0.2ml，另取9～10日龄SPF鸡胚10 枚，每枚鸡胚尿绒毛尿囊膜接种病毒样品悬液0.2ml，同时设正常对照组，孵化7日，每日照 胚，接种后24小时内的死亡鸡胚为非特异性死亡，弃去不计，每组存活至少8枚鸡胚，对所有 接种24小时后存活的鸡胚进行检查，观察有无异常。对绒毛尿囊膜进行观察，检查有无异 常。

1.4.3用细胞培养物进行外源病毒检测

取病毒样品102.0EID50/0.1ml，与抗传染性支气管炎病毒特异性抗血清混合，进行 中和，取2个方瓶(100ml容量)的鸡胚成纤维细胞(CEF)，接种中和后的病毒液0.2ml，在37℃ 下吸附1小时，观察5日，检查是否出现由接种物引起的CPE；用鸡红细胞进行血吸附试验，弃 去培养液，并洗涤单层细胞，加入5％红细胞悬液，在4℃吸附60分钟，用缓冲液洗涤2次细胞 后，在显微镜下观察，是否出现CPE和血吸附现象。

1.4.4 COFAL试验(禽白血病病毒检验)

取病毒样品，制备成每剂量5×105.5EID50/0.2ml，取2个方瓶(100ml容量)的鸡胚成 纤维细胞(CEF)，各接种病毒样品0.2ml，吸附30分钟，弃去培养液，加入细胞生长液，次日换 成维持液。同时设立正常细胞和培养液作为对照。培养5～7日，按常规方法收获细胞，其中 1/2作标记置-70℃检验用(P1)，其余细胞分在两个瓶中，培养7日后，按同样方法收获细胞， 留样(P2)，如此继续传第3代，收获细胞(P3)，所有对照同样处理。将P1、P2、P3和所有对照冻 融3次。同时设立阳性对照按照“中华人民共和国兽用生物制品质量标准”对每份样品进行 COFAL试验。

1.5 ck/CH/LDL/140520株的致弱和免疫原性评价

80只4-5日龄的SPF鸡随机分为8组(每组10只)，分别将8组鸡饲养于8个负压隔离 器中，雏鸡自由采食及饮水。在4-5日龄时，1～4组雏鸡分别用鸡胚代次毒P20(104.6EID50)、 P40(104.8EID50)、P60(104.5EID50)、和P75(104.5EID50)进行接种，每只滴鼻100μL；5～8组雏鸡 分别作为P20、P40、P60和P75接种组的对照组，每只滴鼻100μL的PBS。自接种之日起，每日观 察、记录接种鸡的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖检，观察IBV靶器官、组织的病理 变化。并于接种后20日，使用同源强毒ck/CH/LDL/140520进行攻击，每只滴鼻点眼100μL(病 毒含量为106.0EID50)；攻毒后，每日观察、记录鸡的发病情况、死亡情况，对死亡鸡进行剖 检，观察IBV靶器官、组织的病理变化。

实验结果

2.1 ck/CH/LDL/140520的传代致弱

随着对ck/CH/LDL/140520病毒传代次数的增加，其对鸡胚的适应性越来越强，鸡 胚病变逐渐显著，接种病毒的鸡胚呈现明显发育障碍(侏儒胚)，蜷曲成球形，胚体出血，羊 膜水肿增厚，紧贴胚体等典型的传染性支气管炎病毒感染的变化。每个代次的鸡胚尿囊液 均不凝集鸡外周血红细胞，说明鸡胚尿囊液中不含能使鸡外周血红细胞凝集的禽的其它病 毒，如正粘病毒、副粘病毒或腺病毒等。

2.2病毒滴度测定结果

ck/CH/LDL/140520毒株传代后高度适应鸡胚，P20代的滴度106.5EID50/0.1ml，传代 后病毒滴度逐渐升高，P60和P75代为107.0EID50/0.1ml，并趋于稳定。

表1 ck/CH/LDL/140520鸡胚冷适应梯度传代毒滴度测定结果

2.3无菌检验和支原体检验

鸡胚传代过程中的P20、P40、P60和P75经检验无细菌、霉菌和支原体污染。

2.4外源病毒检验

鸡胚传代过程中的P20、P40、P60和P75代次毒经检验无外源病毒的污染。

2.5 ck/CH/LDL/140520不同代次毒的致弱评价

ck/CH/LDL/140520毒株在鸡胚上连续传代后对SPF雏鸡的致病力在F60-P75之间 减弱(见表2)。P20、P40代毒对SPF雏鸡发病率均为60％以上，死亡率均在1/10至3/10。发病 鸡表现为精神沉郁、缩脖、拱背、被毛粗乱、两翅下垂、张口呼吸等症状。病死鸡剖检可见两 侧肾脏肿大，纹理清晰，外观呈现典型的“花斑肾”，有尿酸盐沉积。所有对照组鸡接种阴性 尿囊液后状态良好，无发病或死亡。而P60发病率降低为1/10，没有死亡鸡。P75代毒对SPF雏 鸡发病率和死亡率则均为0％。剖检未见气管出血，肾脏肿大等特异性病理变化，与接种阴 性尿囊液后的SPF鸡一致。

选取P75(LDL-T株)作为疫苗研制的候选毒株。将P75(LDL-T株)毒株提交保藏，微 生物保藏号是：其微生物保藏号是：CGMCC No.12549；分类命名：传染性支气管炎病毒 (Infectious Bronchitis Virus)；保藏时间是2016年6月2日；保藏单位是：中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所。

如图1所示：原代毒攻毒后死亡鸡肾脏出现花斑肾、免疫组化可见显著病毒抗原， 同时攻毒后形成母鸡输卵管液化。LDL-T(ck/CH/LDL/140520P75代)攻毒后捕杀鸡肾脏未出 现病变、免疫组化未见病毒抗原，同时攻毒后母鸡输卵管正常，并形成正常卵泡。

表2 ck/CH/LDL/140520不同代次毒对SPF雏鸡的致病力

实施例2梯度冷适应弱毒疫苗株LDL-T株的免疫效力及保护效果实验

1、实验方法

40只1日龄SPF鸡随机分为2组(每组20只)，分别饲养于负压隔离器中，雏鸡自由采 食及饮水。5日龄时，其中一组雏鸡使用LDL-T(P75，103EID50)进行接种，每只滴鼻100μL；另 一组雏鸡则作为对照组，每只滴鼻100μL正常尿囊液。自接种之日起，每日观察、记录接种鸡 的发病情况、死亡情况，并于免疫后20天同时将2组雏鸡用同源强毒ck/CH/LDL/140520P2 (106EID50/0.1ml)进行滴鼻点眼攻击，每只100μL；攻毒后5d，每只鸡分别采集咽拭子，分别 分离病毒，评价免疫后对强毒排毒的免疫保护，同时每日观察、记录鸡的发病和死亡情 况。

2、实验结果

2.1 LDL-T对雏鸡的临床保护效果

2个不同日龄的免疫组，在免疫后20天，采集鸡只血清样品，应用间接ELISA试剂盒 检测发现，接种过LDL-T的鸡只血清样品全部转为IBV抗体阳性，而对照组鸡血清样品均为 阴性。使用同源强毒ck/CH/LDL/140520P2(106EID50)对免疫组及对照组鸡攻击后观察5天， 发现免疫组鸡状态良好，无发病症状；而对照组发病明显，表现为精神沉郁、拱背、被毛粗 乱、两翅下垂、张口呼吸等症状，且在攻毒后约30％(3/10)鸡死亡。

表3 LDL-T的免疫效力评价

2.2 LDL-T对雏鸡气管排毒的保护效果

攻毒后5天每组随机采集10个咽拭子，经处理后接种9日龄SPF鸡胚，孵育24-128小 时，期间及时照胚，取出死亡鸡胚。128小时候取出除鸡胚观察鸡胚感染情况并结合RT-PCR 方法判定免疫和非免疫鸡感染强毒后病毒分泌情况。结果免疫组10只中有1只咽拭子中检 测出IBV，而对照组鸡咽拭子的检测结果均为阳性，表明本发明LDL-T免疫后能够对同源强 毒产生良好的免疫保护反应。

表4对雏鸡气管和肾脏的保护效果

3结论

无论从临床观察还是对呼吸道的病毒分泌检测结果来看，本发明LDL-T免疫后能 够对同源强毒产生良好的免疫保护反应。

实施例3 TW I型鸡传染性支气管炎弱毒疫苗的制备

取弱毒疫苗株(LDL-T株)，培养条件恢复至37℃，增殖生产用毒种，用灭菌PBS稀释 10万倍，接种9日龄SPF鸡胚尿囊腔，每胚接种0.1ml，接种后密封针孔，置37℃孵育。鸡胚接 种24小时照胚，弃胚，将于37℃条件下孵育36-72小时的鸡胚气室向上，置于4℃冷却24 小时。收获病毒尿囊液，将若干个鸡胚尿囊液混合为一组，置灭菌瓶中，在2-8℃保存，同时 做无菌检验，同时测得病毒含量应≥106.0EID50/0.1ml。

经无菌检验和病毒含量测定合格的病毒尿囊液混合后再与蔗糖明胶保护剂按 8.5：1(病毒液：保护剂)配苗，冻干保护剂以40℃-50℃为宜(8％明胶、40％蔗糖保护剂，经 115℃高压灭菌40分钟，放4℃保存，72小时内用完)。在添加过程中应不断摇动病毒液，充分 混合均匀后，即为疫苗原液。将疫苗原液无菌定量分装，迅速冷冻真空干燥，加盖密封。

实验例4毒株制备疫苗(LDL-T株)的免疫效力验证

1实验材料

试验用疫苗：按照实施例3的方法分3个批次制备疫苗，批号分别为：201601、 201602、201603。1000羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期：-20℃保存，有效期为12个月。

用法与用量 按瓶签标注羽份用生理盐水稀释，用滴管吸取疫苗，每只鸡滴鼻一滴 (约0.03～0.05ml)。

2实验方法

将1～3组5日龄SPF雏鸡分别接种3批次疫苗，每只滴鼻接种1个使用剂量(约0.03 ～0.05ml)。第4组5日龄SPF鸡每只滴鼻一滴灭菌生理盐水。免疫后20日，4组鸡滴鼻方法攻 击ck/CH/LDL/140520P2(106EID50)株强毒，攻毒后5天每组随机采集10个咽拭子，同时持续 观察各组鸡临床表现，记录发病和死亡情况。经处理后的咽拭子接种9日龄SPF鸡胚，根据鸡 胚感染情况并结合RT-PCR方法判定免疫和非免疫鸡感染强毒后病毒分泌情况。

3实验结果

各批疫苗免疫组免疫20日后，以强毒攻击，其中生理盐水对照组全部发病，均出现 甩头、精神萎靡，羽毛松乱等传染性支气管炎临床症状，在观察期内有9/10发病，其中4/10 死亡，解剖发现均有肾脏肿大，“花斑肾”特异病变。而疫苗免疫组均正常。通过检测攻强毒 后5d采集的咽拭子，结果其中201602批次免疫组10只咽拭子中有1只阳性，其他两批次均未 检测出IBV病毒，而对照组鸡咽拭子的检测结果均为阳性，表明LDL-T作为疫苗免疫鸡后能 够对同源强毒产生良好的免疫保护反应。详细结果见表5。

表5鸡传染性支气管炎活疫苗主动免疫效力试验数据

4结论

结果表明，本发明毒株LDL-T株制备成活疫苗主动免疫保护率达到90％，说明本发 明毒株对鸡传染性支气管炎具有良好的保护效力。

实验例5 LDL-T株制备疫苗的安全性验证

1实验材料

试验用疫苗：按照实施例4所描述的3个批次疫苗201601、201602、201603批次， 1000羽份/瓶。疫苗保存条件及有效期：-20℃保存，有效期为12个月。

用法与用量 按瓶签标注羽份用生理盐水进行适当稀释，用滴管吸取疫苗，每只鸡 滴鼻途径接种。

2实验方法

2.1单剂量接种试验

单剂量接种安全试验用5日龄雏鸡，每批疫苗使用10只，另设对照组鸡10只，试验 组滴鼻接种疫苗1羽份，对照组滴鼻等量的生理盐水，观察20日；剖检，观察是否出现鸡传染 性支气管炎特异病变如：部分发病鸡气管、鼻窦内有浆液性或卡他性分泌物，或肾脏出现肿 胀，出现典型的“花斑肾”变化。

2.2单剂量重复接种试验

单剂量重复接种安全试验用5日龄雏鸡，每批疫苗使用10只，另设对照组鸡同单剂 量接种试验对照鸡，试验组滴鼻接种疫苗1羽份，每只鸡于14天后重复滴鼻接种相同剂量的 疫苗，观察20日；剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变。

2.3大剂量接种组试验

大剂量接种试验用5日龄SPF雏鸡，每批疫苗使用10只，将疫苗稀释至10羽份/ 0.1ml的剂量，试验组滴鼻接种稀释好的疫苗0.1ml，同单剂量接种试验对照鸡，观察20日。 剖检，观察是否出现鸡传染性支气管炎特异病变。

3实验结果

从SPF雏鸡单剂量接种试验、单剂量重复接种试验、大剂量试验结果来看，本发明 毒株制备的鸡传染性支气管炎活疫苗对5日龄的SPF雏鸡安全可靠，生理活动正常，剖检无 传染性支气管炎特异病变；证明了该疫苗对小日龄鸡也是安全可靠的，鸡的采食、饮水、日 常活动不受影响。试验组和对照组试验数据无明显差异。试验数据详见表7、表8和表9。

表7鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡单剂量接种安全试验

表8鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡单剂量重复接种安全试验

表9鸡传染性支气管炎活疫苗雏鸡大剂量安全试验

4实验结论

4.1本发明毒株LDL-T株制备的鸡传染性支气管炎活疫苗对雏鸡是安全的。

实验例6 LDL-T株制备的鸡传染性支气管炎活疫苗免疫持续期实验

1材料和方法

1.1疫苗 按照实施例4所述的鸡传染性支气管炎活疫苗：批号为201601。

1.2试验用鸡 5日龄SPF雏鸡。

1.3攻击用强毒 ck/CH/LDL/140520P2株强毒(106.0EID50/0.1ml)由哈尔滨兽医研 究所分离、鉴定、保存和供应。

1.4实验动物分组 5日龄SPF雏鸡120只，随机分为12组，其中免疫组6组，对照组6 组。

1.5免疫 用疫苗免疫5日龄其中6组SPF雏鸡60只，作为免疫组。免疫组免疫疫苗的 剂量为一个羽份，对照组鸡滴鼻0.1ml生理盐水。

1.6不同时期免疫保护检测 6组免疫鸡分别于免疫后第30、60、90、120、150和180 天分别进行攻毒试验，在不同时间分别与一组对照鸡10只滴鼻方法攻击106.0EID50的ck/CH/ LDL/140520P2株强毒，分别观察20日，记录发病情况，统计结果，同时于攻毒后5天每组采集 咽拭子，经处理后的咽拭子接种9日龄SPF鸡胚，根据鸡胚感染情况并结合RT-PCR方法判定 免疫和非免疫鸡感染强毒后病毒分泌情况。评价疫苗免疫提供的免疫持续期。

2实验结果

2.1临床保护持续期 如表13所示，201601批次疫苗以1羽份的剂量免疫雏鸡后疫 苗免疫后30～180天临床发病率均维持在8/10以上，免疫后180天临床保护下降至8/10。

2.2攻毒后咽拭子病毒分泌保护率 如表13所示，免疫后第30、60、90、120、150和 180天通过攻毒发现，免疫组在免疫后30～180天攻毒保护率达到8/10以上，但是免疫后180 天已经将保护值降低至8/10。

表13免疫持续期雏鸡攻毒保护结果(201601批次)

3实验结论鉴于本发明毒株制备的疫苗免疫后临床保护和呼吸道分泌病毒保护率 均保持在8/10及以上，可见本发明毒株制备疫苗免疫持续期至少可达5个月。

实验例7本发明母本毒株TWI型传染性支气管炎病毒的鉴定

2014年5月，在辽宁省大连市某养鸡场采集病料样本，通过接种SPF鸡胚分离到一 株疑似鸡传染性支气管炎病毒，通过对致SPF鸡胚病变特征、病毒对鸡外周血红细胞凝集特 性、病毒粒子形态学特征、对SPF鸡致病性及死亡率、基因特征等方面的研究，结果发现分离 的病毒为鸡传染性支气管炎病毒；可致鸡胚生长发育障碍(侏儒胚)、胚体严重卷曲；病毒尿 囊液不凝集鸡的外周血红细胞；在电镜下呈典型的冠状病毒粒子的形态特征；将病毒通过 滴鼻途径接种1、5、15日龄SPF雏鸡，同时设未攻毒对照组，在攻毒后第3-14天，攻毒组出现 萎靡、死亡临床症状，发病率100％，死亡率30-70％，死亡鸡呈现典型的“花斑肾”。攻毒后的 康复母鸡持续养殖，在5月龄时剖杀发现母鸡中1/3-3/5出现典型的输卵管发育不全，输卵 管水样化，成为“假母鸡”。以上结果表明鸡传染性支气管炎病毒ck/CH/LDL/140520是我国 流行的一种既能造成肾脏严重损伤而致死的肾型传染性支气管炎病毒类型，而且能够导致 存货母鸡产蛋性能的明显损伤，也成为一种重要的输卵管型传染性支气管炎病毒。

在此基础上，用RT-PCR方法对ck/CH/LDL/140520株全基因组进行了进行了克隆、 测序和分析，该毒株基因全长约为27851bp，基因组组成为5′-UTR-ORF1-S-ORF3-M-ORF5-N- UTR-3′，符合IBV基因组特征；并对筛选的代表不同类型毒株的免疫原基因S1基因进行亲缘 关系对比(如表14-15)，同时绘制了系统发育进化树(如表16)，确证了该毒株为传染性支气 管炎病毒，免疫原基因S1与其他毒株的核苷酸及氨基酸的同源性均在95％以下，而与台湾 地区分离的TW I型毒株同源性达到97.4％和98.5％。基于以上发现，筛选出代表不同基因 型的传染性支气管炎病毒株进行遗传进化分析，结果表明我们分离的ck/CH/LDL/140520株 传染性支气管炎病毒株为TW I型毒株，是我国大陆流行的新的基因型毒株，而且近年来流 行形势严峻，逐渐呈现出传染性支气管炎病毒主导流行毒株类型。

表14不同基因型的传染性支气管炎病毒株

“a”表示病毒分离的国家(省)

表15不同基因型的传染性支气管炎病毒株核酸和氨基酸亲缘关系

*病毒S基因的前端1632bp大小的核苷酸对比，始于AUG翻译起始密码子

为了明确现有商品化疫苗对该类型毒株的防控效果以及该类型毒株在抗原性上 与现有流行毒株的关系，将ck/CH/LDL/140520株与现有商品化疫苗毒株以及我国以往主要 流行的毒株进行血清交叉中和试验，结果显示ck/CH/LDL/140520株(nrTW I)与LDT3有部分 交叉反应之外，与其他类型的疫苗株和野毒株无交叉反应，说明该类型毒株与其他类型毒 株在抗原性上差异明显(如表16)。

同时，利用我国现有商品化疫苗以及本实验室致弱的QX型弱毒株进行动物免疫试 验，于免后20天攻击ck/CH/LDL/140520株强毒，同时在攻毒后采集咽拭子，在临床观察和病 毒分泌检测两方面评价不同疫苗或弱毒株对TW I型强毒株的免疫效力，结果表明现有的商 品化疫苗以及致弱的QX型弱毒株均不能对TW I型强毒株提供良好的交叉保护(如表17)。这 便给免疫防控该类型毒株的感染提出了新的挑战，也提示针对该类型毒株研发新型疫苗毒 株的必要性和紧迫性，本发明正是基于该研究基础，利用分离的ck/CH/LDL/140520株强毒 通过实验室建立和优化的连续梯度冷适应致弱技术培育在75代即培育成针对TW I型强毒 株的弱毒疫苗株。

表16 TW I型毒株(ck/CH/LDL/140520)与其他类型毒株抗原交叉中和实验结果

“-”表示未测定；“a”表示血清中和滴度

表17不同类型疫苗对ck/CH/LDL/140520强毒攻击的免疫保护情况

表18 ck/CH/LDL/140520强毒株(P1代)与通过梯度冷适应致弱后LDL-T株(P75代) 的基因组核苷酸和氨基酸的对比

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120> 鸡传染性支气管炎致弱疫苗株LDL-T株及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27851

<212> DNA

<213> 传染性支气管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus）

<400> 1

actgaaaata gatattatta tatatctatt acactagcct tgcgctagat tttcaactta 60

acaaaacgga cttaaatacc tacagctggt ccctctaggt gttccattgc agtgcacttt 120

agtgccctgg atggcacctg gccacctgtc aggttttagt tattaaataa tattgttgct 180

agtatcactg cttgttttgt tgtgtctcac tttattacat ccgttgcttg ggctacctag 240

tgccagcgtc ctgcaggcgc cgtggtcggt tcgagtgcga agaacctctg gttcatctag 300

cggtacgcgg gtgtgtggaa gtagcacttc agaggtacgt tctgttgtgt gaaacacggg 360

gtcacctccc cccacattcc tctaagggct tttgagccta gcgttgggct acgttctcgc 420

acaaggtcgg ctatacgacg gttgtagggg gtagtgccga acaacccctg aggtgacagg 480

ttctggtggt gtttagtgag cagacataca atagacagtg acaacatggc ttcaagccta 540

aaacagggag tatcttccca aaaccagagg aatgtaattc ttgttgccaa agacattccc 600

gaccaactct gtgacgcttt gttcttctat acgtcacaca acccaaaaga ttacgctgat 660

gctttcgcct ttaggcagaa gttcgaccgt agtctcggtg ctgggaaaca gtttaaattt 720

gaaactgtgt gtggtccatt ctttttgaag ggagtggata aaataacacc aggagtccca 780

gccaaagtta taaaagccac ttcaaagttg gctgatttag aagacatctt tggtgtctca 840

cctcttgcac ggaaataccg tgaactcctg aaaacagcat gccattggtc tctcactgta 900

gaagcgctgg aggctcgtgc acaaactctt gaagaaatct ttgaaccaac tgaaatattt 960

tggcttcaag tggctgcaaa ggttcaggtt tcagccatgg caatgcgcag gcttgttggt 1020

gaggttattg caaaagtcat ggactcactt ggctcaaatt tgagcgctct attccaagtt 1080

gttaaggaaa caatgaccag aatctttcaa aaggccctgg ccatttttga gagtgtgagt 1140

gaattgccac agcgtattgc tgcacttaag atggcttttg tcaagtgtgc aagatcaatt 1200

acagttgtgg ttgttggaca tgccctcact attagagagt ttgctggaac ttgtcttgca 1260

agcattaatg gtgcagttgc aaaattcttt gaagaacttc caactggctt tatgggcgct 1320

aaggtctttt caactcttgc cttctttaaa gaagcagcag taaagattgt agaaaatata 1380

ccaaacgcgc caagaggtac taaaggtttt gaagtcgttg gcaatgccaa aggtacacaa 1440

gttgttgtcc gtggcatgcg aaatgactta actctgcttg accaaaaagc tgaagttcct 1500

gtggaatcag aaggttggtc tgcaattttg gagggacatc tttgctatgt ctttaagagt 1560

ggtgatcgtt tttatgcagc acctctttca ggaaattttg cattgcatga tgtgcattgc 1620

tgtgagcgtg tagtctgtct gtctgatggt gtaacaccgg agataaatga tgggcttgtt 1680

cttgctgcaa tttactcatc ttttagtgtt tcggaacttg tggcagcact taaaaaaggt 1740

gaaccattta agttcttggg gcacaaattt gtctatgcga aggaagcggc agtttctttc 1800

accttggcaa aagcagcaac cattggagat gtcctgaagc tgtttcaatc agcaagagta 1860

aagacgaaag atgtgtggtc tgcacttact gaacagtctt tcgaattctg gaaacttgcg 1920

tacaatagag tgcgcaatct tgaagaattc ctgaagactc atttttgtaa agctcaaatg 1980

tcaattgtgg tcctagcagc agtgcttggt gagggcattt ggcatctctg ttcgcaagtc 2040

atttataaat tgagtggcct gttttccaaa gtcgttgact tctgtgaaaa acactggaaa 2100

ggtttctgca cgcagttgcg aaaagttagg cttgttgtta cagaaaacct ttgtgtgttg 2160

aaaggaattg ctcagcattg ttttcaactt ttgctggaag cactacactt tatgtacaag 2220

agttttaaga aatgtgcact tggtagactt tctggggatt tatttttctg gaaaggcggt 2280

gtgcataaaa ttgtgcagga tggcgatgaa atttggtttg acgccattga tacgattgaa 2340

gttgaagatc tgggtattgt ccaagaaaaa cctatagatt ttgaggtttg tgaagatgtg 2400

atacttccag aaaatcaacc tggccacatg gttcaaatcc aggatgacgg aaagaactat 2460

atgttcttcc gtttcaagaa ggatgagaac atttattata caccaatgtc acaacttggt 2520

gctattaatg ttatttgcaa agcgggtggc aagactgtca cgtttggtga aacaactgta 2580

aaggaaatac catcacctga tgttgtgcct attaaggtaa gcattgagtg ctgtggtgaa 2640

ccatggaata caatcttcaa gaaggcttat aaagagccca ttgaagttga gactgacctc 2700

acagtagaac aactgctcac tgtgatctat gataaaatgt gtgaagatct caaattgttt 2760

ccagaggcac cagaacctcc accatttgag aatgtcgcac ttgttgataa aaacggtaaa 2820

gatctggatt gcataaaatc atgccacctc atttaccgtg attatgagag cgatgatgac 2880

atcgaggaag acgatgctga ggagtgtgat acagatccag ctgatgctga ggaatgtgat 2940

actgcttcag agtgtgaaca agaagatgag gatacaaagg tgctgtctct tttgcaagac 3000

ccagccagta acaagtatcc tctacctctt gatgatgatt atagtgtcta taatggatgt 3060

attgttcata atgacgctct agatgttgtt aatttaccat ctggtgaaga aacttttgtt 3120

gtcaataact gtttcgaagg ggctgtgaaa ccgcttccgc agaaggttgt tgatgttcta 3180

ggagattggg gagaggccgt tgatgcacaa gaacaattgt gtgaacaaga gtctgaatct 3240

gttaaagaac cagttgagaa acctactggt attggtggtt cagcaattga agaagctgtt 3300

gtcgtagagc aggaagtggt tcctgttgtt gaagagtctc aagaagtagt tgtttttaca 3360

tctgctgatt tagaagttgc taaagaaaca ccagaggatg ttgacgagtt tgttcttatt 3420

gctgatgttc ctacagaaga agttgtgcct caagaaaaag aagagccaca agtagaacag 3480

gagcctattc aagttgtcaa atcacaacgt gagaaaaagg ctaaaaagtt caaagtcagg 3540

caaaccacat gtgaaaaacc caaattcttg gagtacacaa catgtgtagg tgatttgacc 3600

gttgtaattg ccaaagcatt ggatgaattt aaagagttct gcgttgttaa cgctgcaaat 3660

gagtatatgt ctcatggtgg tggcgttgcg aaggcaattg ctgacttttg tggacctgat 3720

tttgtggaat attgtgagga ctatgttaag aaacatgggc cacaacaaag acttgtcaca 3780

ccttcatatg tcaaaggcat tcaatgtgtg aataatgttg taggaccccg ccatggtgac 3840

aaagatttgg aagaaaaact tgtcgctgcc tacaagaatg ttcttgtaga tggtgtggtc 3900

aattatgttg tgccagttct ctcatcggga atttttggtg tagattttaa aatctcaata 3960

gacgcgatgc gtaaggcctt tgaagggctt aacatacgcg tgcttctttt ttctctgagt 4020

caagaacaca ttgagtattt cgatgcaact tgtaagcaga agaaaattta tcttacagaa 4080

gatggtgtta aataccgctc tgttgtattg aaacctggcg actctttggg tcaatttggt 4140

caggtttttg caaagaacaa gacagttttt acagcggatg atgttgagga cgaagaagtt 4200

cttttcactc caacaactga caaagctgtt cttgaatact atggattgga tgcgcaaaag 4260

tatgtaatat atttgcaaac actcgcgcag aaatgggaag tccaatatag ggacaatttt 4320

atcttactta aatggcgtga cggaaactgc tggattagtt cagctatagt gctccttcag 4380

gctgctaaga ttaggtttag aggtttcctt gcagaggcat gggctaaatt cttgggtgga 4440

gaccctacgg attttgttgc ttggtgctat gcaagttgca atgctaaagt tggtgatttt 4500

tcagactgca attggctttt ggctaacttg gcagaacact ttgatgcaga ttacacaaat 4560

gcactgctta agaagcgtgt gtcgtgtaac tgtggtgtta agagttatga acttagaggc 4620

cttgaagctt gtattcaacc agtaagggct cctaaccttc tacattttaa gacgcaatac 4680

tcaaattgtc caacttgtgg tacaaatagt atggatgaag ttgttgaagc atcactccca 4740

tacttgttgc ttgttgctac tgatggtcct gctgcagttg attgtgatga aaatgctgca 4800

ggaaatgttg tttttattgg gtccaccaac agtggacact gttatacaca agctgttgga 4860

aaagcttttg ataatttggc tcaagatagg aaatttggaa agagatcgcc ttacattact 4920

gcaatgtata tgcgcttctc tcttaagagt aaaaattctc tgtctgttgc taaaaagagt 4980

aagagcaaga gtgatgtagt aaaagaagat gtttctaatc tcgctacaag ttcaaaattc 5040

agttttgatg atcttactga ctttgaacag tggtatgata gtaacatcta tgaaagtctt 5100

aaagtgcagg aaacacctga gaatattgat gagtatgtgt cattcacaac aaaggaagat 5160

tccaagttgc cactgacact taaagttaga ggtatcaaat cggttgtcga ctttaagtca 5220

aaggatggct ttacttataa gttaatacct gacactgatg aaaattcaaa agcaccagtc 5280

tactatccta ctttggactc tgtaagtctt aaggcaatat gggtggacgg tactgctaat 5340

tttgttgttg gacaccccaa ctataatagt agagctctac gtatccccac attctgggaa 5400

tgcgcagaga cctttgtaaa aataggcgaa aaagttgatg gtgtaactat gggcctttgg 5460

cgtgcagaac accttaatag acctaatttg gaaaggattt tcaacgtcgt taagaagacg 5520

atggttggaa ctagtgttgt tactacacaa tgtggtaaat taattagtaa agcagctaca 5580

ttcgttgccg ataaagtagg agatggtgta atccgcaatg ttactgatag aattaagggg 5640

tgttttgggt ttactaggga gcattttgaa agaagagtgt ctccgcagtt cttaaaaact 5700

ctctttttct tctttttctg tcttgttaag gctagtgcta agggtttaat ggctagctac 5760

aagagtgtgt tatgtaaagt gttatttact gctttactta tattgtgggt tgtctacact 5820

agtaacccag ttgtatttac tggaacacgt gtgttagatt tcctattcga aggttcattt 5880

tgtagtcctt atgtggatta tggtaaagag tcttttgata ttttacgcta ttgtggaagt 5940

gattttactt gtcgtgtttg tttacatggt aaggattcgc ttcatttgta taaacatgcc 6000

tatagcgtag aacagtttta taaagatgca gttaatggta tcagttttac atggaattgg 6060

ctttatatgc tgttcttaat attgtttgtt aagccagtgg caggttttgt tattatttgc 6120

tactgtataa gatatttggt tttaagcacg actgtattac aaactggtgt aggattttta 6180

gactggttta ttcaaacagt gtttgctaac tttaatttta tgggtgcagg attttatttc 6240

tggctttttt ataaggtata tatacaggtg catcatatta tgtactgtaa ggatataaca 6300

tgtgaagtgt gtaagcgagt tgcacgtagt aatagacatg aggttagtgt tgttgttaac 6360

gggcgtaaac agcttgttca cgtctacact aactcaggtt ataatttctg taagagacat 6420

aattggtact gtagaaattg tgacaagtat ggccaccgaa atacatttat gtctcctgaa 6480

gttgctggcg agctttctga aaagcttaag cgccatgtta aacctacagc attcgcatac 6540

cacgtagtgg atgatgcatg cttagttgat gactttgtta atttgaagta taatgctgcc 6600

actccaggta aagaaggtgt gcattctgct gttaaatgtt ttagtgtgtc tgacttctta 6660

aagaaagctg tttttcttaa ggatgcacaa aaatgtgagc aaatatctaa tgatagtttt 6720

atagtttgta atacacacag tgcgcatgca ttagaggaag caaaaaatgc tgccatctat 6780

tatgcgcaat gtctttgtaa accaattctt atacttgacc aggcccttta tgaacaattg 6840

gttgtagaac ctgtgtcaaa aagtgtagta gataaggttt gtagtatcct gtctaatata 6900

atatctgtag actctgcagc tttgaattat aaggctggca cacttcgtga tgccctcctt 6960

tctattacta aagatgaaga agccgtcgat atggctatct tctgtcataa taatgatgtt 7020

gaatatacta gtgatggttt tactaatgtt gtgccgtcat atggtataga tactgataaa 7080

ttaacacctc gtgatagagg ctttttaata aatgcagatg cctccattgc taatttgaaa 7140

gtgaaaaatt caccgccagt agtatggaag tattctgatc ttataaaact gtctgacagt 7200

tgtcttaagt atttaatatc ggcaactgtc aaatcaggag gtagattttt cataacaaga 7260

tctggtgcta agcaagttgt ttcttgttac actcagaagt tgttagtgga aaagaaggct 7320

ggtggtgtcg ttagtagcac tattagtagt tttaagagtt gttgtaaatg gctcttagtg 7380

ttttatttaa tctttacagt gtgttgtttg ggttattatc aatgggaaat gagtagagaa 7440

tttgctcacc ccatgtatga tattaattcc acaatgcatg tagaagggtt taaggttata 7500

gataagggtg tacttcgtga tattgtgcca gaagacacgt gcttttctaa taagtatctt 7560

aattttgact cattttgggg aaaatcttat gtaaatagta gggactgtcc tattgtaacc 7620

gctattatag acggttctgg aacagtagct gctggtgtgc ctggtttcgt acagtgggtt 7680

atggatggtg taatgtttat ccatatgaca caaactgagc gaaaaccgtg gtatattcct 7740

acttggttta atagagaaat tgttggttac acccacgatt ctattattac agaaggtgag 7800

ttttatactt ccatagcatt gtttgcttct agatgtttgt atttaacatc tagtaacaca 7860

ccacagcttt attgctttaa tggtgataat gatgctcctg gtgctctatc atttgcaagt 7920

atacttcctc atagagtata ctttcaacct aatggagtca ggcttattgt gcctcagcaa 7980

attattcaca caccatacgt agttaagtta gtttcagaca gctattgtag aggtagtgtt 8040

tgtgaggtta ctaaaccagg ttattgtgtc tctatgaact ctcaatgggt tttgtttaat 8100

gatgaataca caattaaacc tggtgtattt tgtggttcta ctgttagaga acttttgttt 8160

agtatggtta gcacattctt tacgggtgtt aatccaaata tctatatgca attggcaact 8220

atgttcttaa cacttgttgc tgttgtgtta gtctttgcaa tggttataaa gtttcaaggt 8280

gttttcaaag cttatgcaac cactgtattt actataatgc ttgtttggct tattaatgca 8340

tttgtattat gtgtacatag ttataatagt gttttagcta ttatactact tgtgatttat 8400

tgttatgcat cacttgtgac gagtcgtaat attgctataa taatgcattg ttggcttgtt 8460

ttcacatttg gtttaatagt acctagttgg atagcttgtg tctatttagg ttttgtgcta 8520

tatatgtata caccgctggt tttgtggtgc tatggtacaa ctaaaaattg tcgcaagctt 8580

tatgaaggca atgagtttgt tggtaattat gatcttgctg cgaagagtac ttttgtaatt 8640

cgcggtcctg aatttgttaa acttactaat gagataggcg ataaattcga cgcttgtctc 8700

tcagcgtatg ctaggcttaa atattactca ggcactggca gtgagcaaga ttacttgcaa 8760

gcctgtcgtg catggttggc ctatgcacta gaccaattta gaagcagtgg tgtagaagta 8820

gtttatactc caccacgata ttcaattggt gttagtagat tacaagctgg ttttaagaaa 8880

ctagtatccc ctagtagtgc tgttgagaag tgcattgtta gtgtatccta taggggtaat 8940

aatcttaatg gattgtggtt gggtgactcc atctactgtc cacggcatgt gttaggtaag 9000

tttagtggtg accactgggg tgatgtactt aatcttgcta ataatcatga gtttgaagtt 9060

gtaactggaa atggtgttac tttgagtgtt gttagtaggc gtttgaaagg tgcagtttta 9120

attttacaaa ctgcaattgt caatgctgaa actccaaagt ataaatttat gaaagcaaat 9180

tgtggtgata gttttactat tgcttgctct tatggaggta cagttatagg actttaccct 9240

gttactatgc gttctaatgg aactattaga gcatcttttc ttgctggagc atgtggttca 9300

gtaggtttta atatagaaaa gggtgtagta aatttttact acatgcacca tctagagtta 9360

cctaatgcat tacatacagg gactgaccta atgggtgagt tctatggtgg ctatatagat 9420

gaagaggttg ctcagaaagt tcaacccgat aaattagtta ctaataatat tttagcatgg 9480

ctttatgcag caattattag tgttaaagag agtagttttt caacacctaa gtggcttgaa 9540

agtactactg tcagtattga tgattataat aagtgggcag gtgataatgg ttttacatca 9600

tttgtaagct gcactgctat tactaagtta agtgctataa caggagtaga tgtttgtaaa 9660

ctccttcgta ctattatggt aaaaagtgca caatggggta gtgaccctat tttgggacaa 9720

tataattttg aggatgaaat gacaccagaa tctgtcttta atcaggtggg tggtgttagg 9780

ttacagtctt ctgccgtaaa gaaagctgcg tcttggtttt ggagtagatg tgtgctagct 9840

tgttttttat ttgtcttgtg ttctattgtg ctgttcacag ctttaccata tagatattat 9900

ttacatggcg ctgctgtttt atttgcagct gtgttcttta tttcatttac tgtgaaacat 9960

gttatggcat ttatggatac tttcctcttg ccaacattga ttacggttat tataggagtt 10020

tgtgctgaag tacctttcat ctacaatact ctaattagtc aaattgttat tttctttagc 10080

caatggtatg atccagtagt ctttgacact gtagtaccgt ggatgtttct accattagtc 10140

ttgtacacag cttttaaatg tatacaaggt tgttatagtg taaattcctt taatacttct 10200

ctgttagtgt tgtatcagtt tatgaagttg ggttttgtta tatatacctc ttctaatact 10260

cttacagcct actcagaagg taattgggag ttattttttg agttagtgca cacaactgtg 10320

ttggctaatg ttagtagtaa ttccttaatt ggtttaattg tgtttaaatt tgctaagtgg 10380

atgctgtatt attgtaatgc ctcatacctt aataattatg tcctaatggc tgttattgtt 10440

aatggcatag gttggatgtt tacttgttac tttggattct attggtggat taataaggtt 10500

tttggtttaa ccttaggtaa atatagtttc aaagtttcag tagatcaata taggtatatg 10560

tgtctccata agattaaccc acctaaaact gtgtgggaag tcttttctac aaatatactt 10620

atacaaggta taggtggtga ccgtgtgttg cctatagcta cagtgcaatc caaattgagt 10680

gatgtaaagt gtacaactgt tgtcttaatg cagcttttga ctaagcttaa tgttgaagca 10740

aactcaaaaa tgcatgctta tcttgtagag ttacacaata aaattcttgc ctcagatgat 10800

gttaatgagt gcatggataa tttattgggt atgcttgtaa cactattttg tgtagatagt 10860

actattgatt taagtgagta ttgtgatgat atacttaaga ggtctactgt tttacagtca 10920

gtcactcaag agttttcaca cataccttct tatgcagagt atgaaagagc taaagatctt 10980

tatgaaaagg ttttagctga gtctaaaaat ggtagtgtta cacagcaaga gcttgctgca 11040

tatcgtaaag ctgccaatgt tgcaaagtca atctttgata gagacttggc tgttcagaag 11100

aagttggata gcatggctga acgtgctatg acaactatgt ataaggaagc gcgtgtcact 11160

gatagaagag ctaaacttgt ttcgtcatta catgcgctat tattttctat gcttaagaag 11220

atagattctg aaaagcttaa tgtactattt gaccaggcaa gtagtggtgt tgtaccgcta 11280

gctactgttc caatagtttg tagtaataag cttactcttg tagtgccaga tccagagacg 11340

tggaccaagt gcgtagaggg catgcatgtt acttattcaa cagttgtttg gaatattgat 11400

aatgtcattg atgcagatgg cactgaattg caaccaattt ctacaggtaa tggtttaatt 11460

tactgtataa gtggtgataa tatagcatgg cctcttaagg tcaatttgac taggaatgtg 11520

cataataaag ttgatgtagt attgcagaac aacgagctta tgcctcatgg tgttaaaaca 11580

aaggcatgcg tggcaggtgt agatcaagca cactgcagcg tagagtctaa atgttattat 11640

actaatatta gtggtaattc agtagtggct gctattacct cttcaaatcc taatttgaaa 11700

gttgcctcat ttttaaatga agcaggcaat caaatttatg ttgacttaga cccaccatgt 11760

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agagttagag c 27851