一种适合于中温好氧生物堆修复系统的石油烃降解混合菌剂及应用

本发明属于有机污染土壤微生物修复技术领域，具体涉及一种适合 于中温好氧 生物堆修复系统的石油烃降解混合菌剂及应用。

随着石油开采业的不断发展、开采需求量的不断提高及开采难度的 不断加大，石 油成为越来越宝贵的能源物质。然而，在石油工业高速发 展的同时，油气开发对土壤污染 的状况也愈发严重。石油烃污染物破坏 土壤结构和生态功能，危及生物乃至人类健康安 全，其中占石油污染物 含量一半以上的烃类组分是主要的土壤污染毒害物质成分，故而对 其的 修复治理迫在眉睫。针对由烷烃和芳烃等组成的石油烃类组分，虽具有 可被生物代 谢的潜力，但受代谢条件和底物特性等影响，其生物降解效 率仍然有限。虽然如此，但针对 石油污染土壤治理的生物修复技术因其 具有经济、便捷的优势，目前为止仍然是人们普遍 接受和采用的修复方 法之一。对此，如何改善和提高生物修复效率已成为需进一步解决的 关 键问题。目前，生物堆修复技术通过营养调控、强制通风等方式已成为 强化微生物修复 技术的最佳手段之一。特别是针对于我们提出的中温好 氧生物堆修复技术，通过有效控制 生物堆运行条件，提高微生物代谢效 率，可达到高效修复的目的。基于此，适合于中温好氧 生物堆修复体系 的石油烃降解功能微生物菌剂将是修复成败的关键因子。

针对于石油烃的复杂组分、污染土壤内的微生态环境及中温好氧生 物堆修复技 术的体系特征，通过不同技术条件的筛选，得到特异性的功 能代谢菌株，并制备高效混合 功能菌剂，将是满足中温好氧生物堆修复 技术对石油烃污染土壤进行高效修复的优良方 法。

本发明目的在于提供一种适合于中温好氧生物堆修复系统的石油烃 降解混合菌 剂及应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种适合于中温好氧生物堆修复系统的石油烃降解混合菌剂，混合 菌剂由地衣 芽孢杆菌PS5(Bacillus licheniformis PS5)和荧光假单 胞菌PB4(Pseudomonas fluorescens PB4)混合并固定化制成，其中， 地衣芽孢杆菌PS5(Bacillus licheniformis PS5)已于2011年7月22 日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山，保 藏登 记号为CCTCC NO：M 2011261；荧光假单胞菌PB4(Pseudomonas fluorescens PB4)已 于2011年7月22日保藏于中国典型培养物保藏中 心，地址为武汉市武昌珞珈山，保藏登记 号为CCTCC NO：M 2011260。

所述的地衣芽孢杆菌为以石油烃中烷烃组分为碳源底物，在一定温 度的培养条 件下筛选而得，具有针对土壤体系中烷烃的降解功能。

所述的荧光假单胞菌为以石油烃中芳烃组分为碳源底物，在一定温 度的培养条 件下筛选而得，具有针对土壤体系中芳烃的降解功能。

所述两菌株按3:1～5:1(V:V)比例混合，混合后经碳化稻壳固定化 后，即得混合 菌剂。

所述固定化为由酸化后并中和pH至7～8的稻壳作为载体，将其与混 合菌液按10 ～15:1(m:m)的质量比混合并静置吸附3～5h而成。

一种适合于中温好氧生物堆修复系统的石油烃降解混合菌剂的制备 方法，其特 征在于：混合菌剂由地衣芽孢杆菌PS5(Bacillus licheniformis PS5)和荧光假单胞菌PB4 (Pseudomonas fluorescens PB4)混合并固定化制成，其中，地衣芽孢杆菌PS5(Bacillus licheniformis PS5)已于2011年7月22日保藏于中国典型培养物保藏 中心，地址为武汉市 武昌珞珈山，保藏登记号为CCTCC NO：M 2011261； 荧光假单胞菌PB4(Pseudomonas fluorescens PB4)已于2011年7月 22日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为武汉市武 昌珞珈山，保藏 登记号为CCTCC NO：M 2011260。

所述两菌株按3:1～5:1(V:V)比例混合，混合后经碳化稻壳固定化 后，即得混合 菌剂。

所述固定化为由酸化后并中和pH至7～8的稻壳作为载体，将其与混 合菌液按10 ～15:1(m:m)的质量比混合并静置吸附3～5h而成。

一种适合于中温好氧生物堆修复系统的石油烃降解混合菌剂的应 用，所述混合 菌剂在生物堆修复的初期施加，并在修复过程中进行补加， 即当生物堆体内细菌微生物总 量达初始含量的40％～60％时，在堆体强制通 风停止的间隙进行混合菌剂补给，维持堆体 内细菌总量达90％～110％，同 时保持污染土壤内脱氢酶活性达初始值的70～90％。

本发明所具有的优点包括：

1)本发明混合菌剂由地衣芽孢杆菌和荧光假单胞菌混合组成，其中 地衣芽孢杆 菌具有烷烃高效代谢能力，荧光假单胞菌具有芳烃高效代谢 能力，二者的组合可实现石油 烃组分的全面降解。

2)本发明混合菌剂中地衣芽孢杆菌和荧光假单胞菌均可在38±2℃ 的培养条件 下生长，并具有适宜土壤中代谢石油烃的能力，从而更加适 合于中温好氧生物堆修复系统 的应用。

3)本发明混合菌株的固定化采用酸化后并中和pH的稻壳与菌液混 合的方式进 行，利用处理后稻壳的多孔吸附表面及产生的生物可代谢碳， 有效保障了微生物的代谢活 性、微生物与污染底物的接触几率以及微生 物营养物质的含量，同时还具有一定程度的增 大生物堆堆体孔隙度的作 用，有效搭配中温好氧生物堆修复体系，实现石油烃污染土壤的 快速高 效修复过程。

图1为本发明实施例提供的对照组2(CK2)与处理组(Biopile) 的中温好氧生物堆 堆体立体图。

图2为本发明实施例提供的各实验处理过程中细菌微生物数量的变 化图。

图3为本发明实施例提供的各实验处理过程中土壤脱氢酶活性的变 化图。

图4为本发明实施例提供的各实验处理过程中土壤石油烃污染物的 总降解率变 化图。

图5为本发明实施例提供的各实验处理过程中土壤石油烃污染物各 族组分的残 留量特征图。

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1石油烃降解混合菌剂的制备

本实施例所用菌源样品来自于辽河油田开采油井周边长期受石油污 染的土壤， 称取3.0g该石油污染土壤，加入50ml无机盐培养基，震 荡20min，静置5min，取上清液分别 加入至含有0.3g·L-1的石油烃中 的烷烃组分及0.2g·L-1的石油烃中的芳烃组分的无机 盐液体培养基中进 行富集筛选培养7d，培养物转移至分别含有0.3g·L-1烷烃和0.2g·L-1 芳烃无机盐固体培养基中进行划线分离，分别挑选长势较好的单一菌落 进行连续三次平 板划线纯化，分离物分别保存于牛肉膏蛋白胨斜面培养 基上，经鉴定分别隶属于地衣芽孢 杆菌和荧光假单胞菌。

所述的无机盐液体培养基，其组成为：0.5g·L-1NaCl，0.25g·L-1 MgSO4，1.0g·L-1NH4NO3，2.0g·L-1K2HPO4，1.0g·L-1KH2PO4，0.02g·L-1 CaCl2，0.02g·L-1FeSO4，1.0L蒸馏 水，pH值7.0-7.3，121℃灭菌20 min备用。

所述无机盐固体培养基，其组成为：0.5g·L-1NaCl，0.25g·L-1MgSO4， 1.0g·L-1NH4NO3，2.0g·L-1K2HPO4，1.0g·L-1KH2PO4，0.02g·L-1CaCl2， 0.02g·L-1FeSO4，15g·L-1琼 脂，1.0L蒸馏水，pH值7.0-7.3，121 ℃灭菌20min备用。

将分离所得地衣芽孢杆菌和荧光假单胞菌分别在烷烃及芳烃污染土 壤中进行摇 瓶培养功能鉴定。结果表明，38℃震荡培养6d后，土壤烷 烃和芳烃分别得到有效降解，降解 率分别达到17.2±0.6％和11.6±0.8％， 反映了两菌株在土壤体系内的高效代谢活性。

所分离的地衣芽孢杆菌和荧光假单胞菌分别于2011年7月22日提 交至中国典型 培养物保藏中心，地址为武汉市武昌珞珈山，保藏登记号 分别为CCTCC NO：M 2011261和M 2011260。

将保存的两株菌株分别挑取单一菌落接种在5ml牛肉膏蛋白胨液体 培养基中，38 ℃震荡培养16h，获得菌株种子液。分别取1ml种子液转 接至牛肉膏蛋白胨的扩大培养液 中，38℃震荡培养48h，10000rpm·min-1离心并分别收集菌体，而后用无机盐培养基清洗菌 体后分别等体积重悬， 重悬后按照地衣芽孢杆菌重悬液和荧光假单胞菌4:1重悬液(V:V) 的体 积比例制成混合菌液。采用35％(W/V)硫酸酸化处理的稻壳，经氨水调 节pH至中性(7 ～8)，风干稻壳，将稻壳载体与混合菌液按10～15:1(m:m) 的质量比混合并静置吸附3～5h 后制成固定化混合菌剂。

实施例2石油烃降解混合菌剂在中温好氧生物堆修复石油污染土壤 中的应用

将制备好的石油烃降解混合菌剂与待修复石油污染土壤进行充分混 合，使修复 初始堆体内细菌微生物数量达7.0×108CFU·g-1土。随后搭建 宽1～2m，高1m的生物堆体 (图1)。堆体底部铺设HDPE防渗膜，防 渗膜上铺设10cm厚的碎石导气层，注气管路与抽气管 路分别铺设至导 气层内，其中抽气管路还设有垂直于水平面的分支抽气管路。注气管路 堆体外末端依次连接管道加热器、注气风机、雾化器及空气通风口；抽 气管路堆体外末端 依次连接汽水分离器、抽气风机、活性炭吸附罐；堆 体顶部布设水分及液体营养补给管线， 管线末端连接液泵、附加连接变 频器及水分营养液体储罐。管道加热器温度控制在39±1 ℃，注气风机以 通气30min，停1h的模式运行，每日总通气时长为8h，抽气风机以 抽气 30min，停1h的模式运行，每日总抽气时长为8h，保持堆体处 于温度为38±2℃的中温好氧 状态。

具体相关参数设置见表1，全部试验共设置对照组1(非强制通风的 传统微生物修 复)、对照组2(强制通风的生物堆修复)及处理组(强制 通风的生物堆修复辅以混合菌剂二 次投加)，试验修复运行后，每10d 取样一次，观测土壤内微生物数量及石油烃降解率等参 数变化特征。结 果表明，处理组中生物堆体内微生物数量在堆体修复运行20d后，细菌 微 生物数量达到3.8×108CFU·g-1土，为初始微生物含量的54％，石油烃 降解率达22.6± 0.8％，而对照组1的微生物数量为8×107CFU·g-1，石 油烃降解率仅为14.7±0.7％。

此时，不做强制通风的对照组1和采用生物堆技术处理的对照组2 不做处理，分别 继续进行修复，处理组向堆体内二次补加实施例1中制 备成的石油烃降解混合菌剂(其中 地衣芽孢杆菌和荧光假单胞菌的体积 比达4:1(V:V)的比例)，补给时间选择在注气与抽气 间隙的后半小时 内进行(表2)，补加后堆体内微生物数量达6.5×108CFU·g-1土(图2)， 微 生物脱氢酶(DHA)活性达41ug TPF/g·24h，为试验初始时脱氢酶 活性的86％，而对照组2 中脱氢酶活性仅为试验初始时的78.65±0.84％ (图3)。堆体补加菌剂后继续进行修复处 理，结果表明，石油烃降解效 率得到有效维持，处理40d后，总的石油烃降解率达40.8± 1.2％，而对 照组的石油烃降解率仅为30.9±0.8％(图4)。分析石油烃族组分特征， 烷烃 及芳烃的降解率在处理组中较对照组2均有显著提高，特别是针对 烷烃组分，处理40d的降 解率较对照组高出10.3％(图5)。由此表明， 本石油烃降解混合菌剂适宜于在中温好氧生 物堆条件下进行土壤体系中 的石油烃降解，特别是针对性地将具有烷烃降解功能的地衣 芽孢杆菌与 具有芳烃降解功能的荧光假单胞菌进行混合并固定化制成菌剂，施用在 38± 1℃的堆体温度条件下，对于石油烃的降解修复显著。此外，选择在 堆体微生物数量下降至 堆体原始含量的54.86％时进行补给，补给后细菌 微生物数量达到初始含量的92.86％，并 在注气停止半小时后进行施加， 有效保证了高含量的堆体功能微生物数量，且有助于菌剂 随堆体内液体 流动而扩散分布。综上所述，证明了本专利的石油烃混合降解菌剂适于 在 中温好氧生物堆体系内进行石油烃污染土壤的修复工作，并具有维持 堆体高效快速地进 行石油烃污染物降解的功能。

表1

表2