一株含有游离型HPV18的宫颈上皮内瘤样病变细胞系及其用途

本发明属于微生物动物细胞系领域，特别涉及一株含有游离型人乳头瘤病毒18亚型的宫颈上皮内瘤样病变细胞系及其用途。

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)是一种最小的、球形双链DNA病毒，已知HPV感染可引发宫颈癌。子宫颈内膜存在一个特殊的宫颈上皮移形带或称为转化区，是子宫颈管壁单层柱状上皮和鳞状上皮(宫颈外口)的交界处。转化区宫颈内膜的基底层细胞具有增生和分化为柱状上皮细胞和鳞状上皮细胞的双向分化潜能，若转化区细胞持续暴露于高危型人乳头瘤病毒(High-risk human papillomavirus,HR-HPV)之下，很容易产生异常增生，导致癌前病变，随着病情的恶化，最终进展为宫颈癌。宫颈癌是女性妇科中最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率仅次于乳腺癌位居第二。近些年来，随着生殖器尖锐湿疣及女性宫颈癌发病率的持续攀升和逐渐年轻化的趋势，HPV越来越受到研究者们的广泛关注。尽管已经有预防性HPV疫苗，但是尚无抗HPV的药物，也没有有效的药物用于宫颈癌患者的，主要原因是缺乏合适的HPV研究模型用于新药研发。

从正常人或患者的组织中分离培养原代细胞并持续传代极其困难，细胞通常只能存活较短时间就会发生衰老和死亡，细胞量无法满足实验需求。还有通过导入病毒(SV40T或HPV16E6/E7)癌基因或外源基因(hTERT)建立的各种永生化细胞系，通过基因改造的细胞虽然在体外存活寿命(代数)延长，细胞数量满足实验需求，但其最大的缺点是细胞本身的遗传特性、表型及其真实生理状态发生了改变，例如：涉及到pRB和p53相关信号通路的抑制等，得到的实验数据不能反映体内的真实情况。

宫颈癌细胞系HeLa、Caski和SiHa分别为HPV18和HPV16整合型细胞系，这些细胞系在体外传代培养时间久，但由于肿瘤的异质性，这些长期传代的癌细胞系已经不能代表患者肿瘤的生物学特性，加之病毒感染宿主实际为一个动态变化的过程，因此，上述癌细胞系不能用来实时监控疾病的发生发展，得到的研究结果也不能真实反映机体内一系列肿瘤生物学行为。HeLa、Caski和SiHa等常用癌细胞系中的HPV均整合至宿主细胞基因组中。迄今为止，还没有建立过患者来源的可持续传代的含游离型HPV的细胞株。

由于HPV有严格的嗜上皮细胞和依赖上皮细胞分化成熟而复制繁殖的特性，加之宿主细胞内携带的HPV在体外传代过程中极易发生丢失或整合。因此，在体外建立合适且接近生理状态的携带HPV病毒的细胞模型，对于HPV病毒感染与免疫、抗病毒和抗肿瘤药物的研发等方面都具有重要意义。

本发明的目的是针对目前还没有建立过患者来源的可持续传代的含游离型HPV的细胞株且无法反映我国人特点，提供一种新的中国女性的、长期体外培养传代和性质稳定的人宫颈上皮内瘤样病变细胞系。该细胞系经全面的细胞系身份鉴定并确定含游离型HPV18。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变(Cervicalintraepithelial neoplasia,CIN)细胞系，分类命名为人宫颈上皮内瘤变细胞HCINC/HL-017，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号为CCTCC NO:C2015124。

本发明的细胞系来源的临床标本为HPV18感染患者的宫颈上皮内瘤样病变临床组织样本1–2cm3，无其它，经体外直接培养和筛选后成功获得稳定传代的一株含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变细胞系，命名为HCINC/HL-017。

第二方面，提供一种培养上述含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变细胞的HCIN培养基，该培养基是DMEM与Ham's F 12 NUTRIENT MIX按体积比4:1混合的培养基，同时添加4～6％(v/v％)胎牛血清(FBS)、1～3nM三腆甲状腺氨酸(triiodothyronine)，0.4～0.65％胰岛素(insulin)试剂、9～11ng/mL表皮生长因子(epithelial growthfactor〈EGF〉)、0.3～0.5μg/mL氢化可的松(hydro-cortisone)、35～45μg/mL庆大霉素(gentamicin)、45～55nM calpeptin、35～45ng/ml重组人IL-lRA，及3μg/ml重组人R-Spondin-1。

第三方面，提供上述含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变细胞的培养方法，包括步骤：重悬细胞于上述HCIN培养基，接种于培养瓶与放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞共培养，小鼠成纤维细胞与宫颈上皮内瘤样病变细胞的比例为1:2或1:3或1:4或1:5，培养条件是37℃、5％CO2，所述小鼠成纤维细胞为小鼠成纤维细胞MFC/HL-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C201714。

本发明提供的含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变细胞系HCINC/HL-017具有以下生物学特性：

1、本发明的细胞系来源的临床标本为HPV18感染患者的宫颈上皮内瘤样病变临床组织样本1–2cm3，无其它。该细胞未导入任何外源基因，染体核型为46，X,X；基因分型鉴定为国内外从未登记注册过的一种人CIN细胞株。短串联重复序列(STR)基因型以22个短串联重复序列基因座/等位基因长度来表示：AMEL/X,CSF1PO/12，D10S1248/13/16，D12S391/18/22，D13S317/11/13，D16S539/11/12，D18S51/13/15，D19S433/＜9/15，D21S11/29/30，D2S1338/23/24，D2S441/10/12，D3S1358/15/17，D5S818/7/11，D6S1043/12/13，D7S820/12，D8S1179/13/15，FGA/20/24，Penta D/11/12，Penta E/10/20，TH01/7/10，TPOX/8，vWA/18。

2、该细胞在上述HCIN培养基中生长，第7天于显微镜下观察细胞的形态如图2，排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞。

3、该细胞生长曲线显示平均倍增时间约32小时，连续传代培养67天，细胞体倍增数超过50代以上，本发明的人宫颈上皮内瘤样病变细胞仍能保持增殖状态在体外生长增殖。

4、该细胞不具有锚定-非依赖性生长的能力，其恶性增殖能力及细胞转化程度远不及HeLa细胞。

5、该细胞在Matrigel中分化培养能够形成表面光滑的球状体，但DAPI染观察到少部分球体内部结构不规则，与癌细胞对比说明人宫颈上皮内瘤样病变细胞具有一定程度的正常分化能力。

6、经PCR、滚环扩增实验(Rolling Circle Amplification,RCA)鉴定，表明来源于中国女性宫颈上皮内瘤样病变的该株细胞为自身携带有HPV18亚型，且为游离型HPV18DNA。

第四方面，提供上述含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变细胞的培养试剂盒，包含小鼠成纤维细胞MFC/HL-041和上述HCIN培养基，所述小鼠成纤维细胞MFC/HL-041保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201714。

第五方面，提供上述HCIN培养基或上述试剂盒在含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变细胞HCINC/HL-017的培养中的应用。

第六方面，提供上述含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变细胞HCINC/HL-017在以下方面的应用：

(1)建立研究HPV18病毒生物学特性的模型中的应用；

(2)建立研究HPV18感染致宫颈癌的机制的模型中的应用；

(3)筛选抗HPV和抗宫颈癌药物及疫苗中的应用；

(4)筛选HPV和宫颈癌临床诊断试剂中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

本发明的含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变细胞HCINC/HL-017可长期体外培养传代，性质稳定，该细胞未导入任何外源基因，反映中国人特点，不具有锚定-非依赖性生长的能力，其恶性增殖能力及细胞转化程度远不及HeLa细胞，具有一定程度的正常分化能力，经PCR、滚环扩增实验鉴定，该株细胞为自身携带有HPV18亚型，且为游离型HPV18 DNA。并初步探讨了细胞系对现有的候选/潜在的抗宫颈癌药物的敏感性。本发明的含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变细胞HCINC/HL-017为HPV18感染致宫颈癌提供了代表临床上含有游离型HPV18的宫颈上皮内瘤样病变细胞研究工具。该细胞系及基于细胞系建立的动物模型可用于研究宫颈癌发生、发展、转移机制的基础研究，诊断宫颈癌的辅助检查手段的临床前研究，探索发现新的靶点开发抗肿瘤药物等用途。

图1是含有游离型HPV18人宫颈上皮内瘤样病变细胞构建流程图；

图2是人宫颈上皮内瘤样病变细胞形态图；

图3是人宫颈上皮内瘤样病变细胞的增殖倍增曲线图；

图4是人宫颈上皮内瘤样病变细胞的核型分析图；

图5是人宫颈上皮内瘤样病变细胞的STR基因分型图；

图6是人宫颈上皮内瘤样病变细胞的软琼脂克隆形成实验结果图；

图7是人宫颈上皮内瘤样病变细胞的matrigel 3D培养生长形态图；

图8是人宫颈上皮内瘤样病变细胞的HPV18 Q-PCR的Ct值与起始拷贝数标准曲线；

图9是人宫颈上皮内瘤样病变细胞的HPV18 Q-PCR的Ct值与起始拷贝数的E2/E7的比值；

图10是RCA法扩增酶切鉴定人宫颈上皮内瘤样病变细胞不同代数细胞中游离型HPV18；

图11 RCA法扩增后酶切及PCR鉴定人宫颈上皮内瘤样病变细胞p5代中HPV18环状DNA；

图11B的右图为左图泳道2的放大图；

图12是人宫颈上皮内瘤样病变细胞对不同药物的敏感性检测结果图；

本发明的含有游离型HPV18的中国女性宫颈上皮内瘤样病变细胞，于2016年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072)，细胞分类命名为“人宫颈上皮内瘤变细胞HCINC/HL-017”(Human Cervical IntraepithelialNeoplasia Cells HCINC/HL-017)，保藏编号为CCTCC NO：C2015124。

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

【实施例1】人宫颈上皮内瘤样病变细胞的原代分离培养

(1)在病人或病人监护人知情同意的情况下，收集HPV18感染患者的宫颈上皮内瘤样病变临床组织样本1–2cm3(立方厘米)，无其它。

(2)消化液的配制：含胶原酶和分散酶均0.2mg/mL的HCIN培养基；其中，HCIN培养基为：DMEM与Ham's F 12 NUTRIENT MIX按体积比4:1混合的培养基，同时添加4～6％胎牛血清(FBS)、1～3n M三腆甲状腺氨酸(triiodothyronine)，0.4～0.65％胰岛素(insulin)试剂、9～11ng/mL表皮生长因子(epithelial growth factor〈EGF〉)、0.3～0.5μg/mL氢化可的松(hydro-cortisone)、35～45μg/mL庆大霉素(gentamicin)、45～55nM calpeptin、35～45ng/ml重组人IL-lRA，及3μg/ml重组人R-Spondin-1。

(3)用95～100％(v/v)的乙醇洗分离的组织样品1次，再用PBS(0.01M，pH7.4)洗2次，然后将组织放入含冰上预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织中残留的脂肪。

(4)将组织样品1～2mm3(立方毫米)放入10mL消化液的14mL或50mL离心管中，37℃消化1小时。

(5)将消化后的组织低速离心(1000rpm)5min，去除上清。

(6)将细胞沉淀重悬于2～5mL的0.25％胰酶-EDTA中，置于冰上1小时或室温消化10min。

(7)加入10mL含10％(v/v)FBS的DMEM，用40～70μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，低速1000rmp离心5min，去除上清。

(8)重悬细胞沉淀于HCIN培养基中，接种于T25或T75的培养瓶培养，培养条件是37℃、5％CO2。将原代人宫颈上皮内瘤变细胞与放射线辐照或是药物丝裂酶素C处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞共培养，所述共培养利用上述HCIN培养基进行，所述小鼠成纤维细胞是申请号：201810335862.8中国专利申请中的小鼠成纤维细胞MFC/HL-041，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201714。对小鼠成纤维细胞MFC/HL-041的放射线辐照或药物丝裂酶素C处理方法按照申请号：201810335862.8中国专利申请中的【实施例3】和【实施例4】的步骤进行。

按照上述方法分离培养成功的原代人宫颈上皮内瘤变细胞，第7天于显微镜下观察细胞的形态如图2，排列紧密、细胞界限清晰、立体感强、多角型的上皮细胞。

【实施例2】人宫颈上皮内瘤样病变细胞的传代培养

(1)当在T25或T75的培养瓶中培养的人宫颈上皮内瘤样病变细胞增殖至70～90％丰度时，用1×PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤细胞2次，加入0.6mL浓度为0.02％的EDTA后轻轻晃匀使之与培养瓶上的细胞充分接触，20s后拍打培养瓶外壁，使小鼠成纤维细胞从培养瓶壁上脱落，当在显微镜下观察到小鼠成纤维细胞全部脱离瓶壁后，迅速移除EDTA，用PBS洗涤细胞3次。

(2)再用0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞5min。

(3)加入10mL DMEM中和消化反应1min，1000rmp离心5min，去除上清。

(4)以大约1:3比例重悬细胞沉淀于HCIN培养基，接种于培养瓶与放射线辐照或是药物处理后失去增殖能力但仍然维持代谢活性的小鼠成纤维细胞共培养，小鼠成纤维细胞与宫颈上皮内瘤样病变细胞的比例为1:3，培养条件是37℃、5％CO2。

(5)细胞保种时可将约1×106个人宫颈上皮内瘤样病变细胞重悬于1mL的细胞冻存液(90％胎牛血清和10％DMSO,v/v)中，储存于液氮中备用。

按照上述方法传代培养人宫颈上皮内瘤样病变细胞，培养建系的细胞增殖倍增曲线如图3，连续传代培养67天，培养代数超过50代以上，本发明的人宫颈上皮内瘤样病变细胞仍能保持增殖状态在体外生长增殖。

【实施例3】人宫颈上皮内瘤样病变细胞的核型分析鉴定

(1)当人宫颈上皮内瘤样病变细胞(1×106)处于指数生长期时，加秋水仙素，终浓度为0.2μg/mL，继续培养3.5小时。

(2)反复吹打细胞使其脱落，2000rpm离心5分钟收获细胞。

(3)弃上清液，加入37℃预温的0.075mol/L KCl溶液8mL，轻轻吹打细胞团混匀，置37℃低渗处理25分钟。

(4)加入1mL新配制的固定剂(甲醇:冰乙酸＝3:1，v/v)，小心吹打、混匀，2000rpm离心5分钟。

(5)弃上清液，加入8mL固定剂，吹打制成细胞悬液后，室温下固定20分钟。

(6)2000rpm离心5分钟，弃上清液，重复固定一次。

(7)弃上清液，加入数滴固定剂制成细胞悬液，取2～3滴于冰水浸泡过的载玻片上。

(8)将载玻片置70℃烤箱中干烤2小时，自然冷却。

(9)2.5％(质量体积比)胰酶溶液(pH6.8～7.2)5mL处理25～45秒钟。

(10)37℃预温的生理盐水漂洗，Giemsa染5～10分钟，做G显带分析。

(11)显微镜下观察细胞核型并摄影，进行核型分析；至少观察分析20个以上有丝分裂中期细胞。代表性的细胞核型分析结果如图4，人宫颈上皮内瘤样病变细胞为正常二倍体，46条染体未见异常排列。

【实施例4】人宫颈上皮内瘤样病变细胞的基因分型鉴定

(1)贴壁生长的人宫颈上皮内瘤样病变细胞(1×106)，用1×PBS洗涤细胞两次，0.05％胰酶-EDTA消化单层细胞2～5min，10mL完全DMEM中和消化反应。

(2)10000rpm离心1min，倒尽上清，加200μL缓冲液GA(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，振荡至彻底悬浮。

(3)加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

(4)加入200μL缓冲液GB(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，充分颠倒混匀，70℃放置10min，简短离心。

(5)加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，简短离心。

(6)将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。

(7)向吸附柱中加入500μL缓冲液GD(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。

(8)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，12000rpm离心30秒，去废液。

(9)将吸附柱转入另一离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～200μL洗脱缓冲液TE(细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DP304，天根公司)，室温放置2～5min，12000rpm(～13400×g)离心2min，将提取的DNA溶液收集到离心管中。

(10)利用16HS系统(DC2101，promega公司)进行22个基因座(21个STR位点和1个性别位点)的DNA复合扩增。

(11)使用3100型遗传分析仪(1.1版本数据收集软件)进行扩增片段的检测。

(12)使用和PowerTyperTM 16 Macro软件分析样本数据，进行自动基因分型，STR分型结果见图5，检测22个STR基因位点，以“STR基因座/等位基因长度”来表示：AMEL/X,CSF1PO/12，D10S1248/13/16，D12S391/18/22，D13S317/11/13，D16S539/11/12，D18S51/13/15，D19S433/＜9/15，D21S11/29/30，D2S1338/23/24，D2S441/10/12，D3S1358/15/17，D5S818/7/11，D6S1043/12/13，D7S820/12，D8S1179/13/15，FGA/20/24，Penta D/11/12，Penta E/10/20，TH01/7/10，TPOX/8，vWA/18。

本发明的人宫颈上皮内瘤样病变细胞经STR基因分型，结果如图5，是国内外从未登记注册过的一种人宫颈上皮内瘤样病变细胞系。

【实施例5】人宫颈上皮内瘤样病变细胞的软琼脂克隆形成实验(HeLa细胞为阳性对照)

(1)用蒸馏水分别配制1.2％和0.8％两个浓度的低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃的水浴中保证其不凝固。

(2)按照1:1的比例使1.2％的琼脂糖和2×DMEM或2×HCIN培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)在无菌离心管中混匀，取3mL混合液注入6孔板中，冷却凝固，作为底层琼脂置37℃，5％CO2培养箱中备用，每株细胞做三个复孔。

(3)再按照1:1的比例使0.8％的琼脂糖和2×DMEM或2×HCIN培养基在无菌离心管中混匀，再向管内加入2mL的细胞悬液(琼脂糖和2×DMEM混合液中加入含有HeLa细胞的琼脂糖细胞悬液，琼脂糖和2×HL培养基中加入含有人宫颈上皮内瘤样病变细胞的细胞悬液)，六孔板中每孔加3×104个细胞，充分混匀，注入铺有1.2％琼脂糖底层平皿中，形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃，5％CO2培养箱中培养30天。

(4)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆的形态与细胞的致瘤性。

HeLa细胞和人宫颈上皮内瘤样病变细胞在软琼脂中的生长状态如图6A-B所示，HeLa细胞能在软琼脂中形成明显较大的细胞克隆，人宫颈上皮内瘤样病变细胞在琼脂中未能形成细胞克隆。说明人宫颈上皮内瘤样病变细胞不具有锚定-非依赖性生长的能力，其恶性增殖能力及细胞转化程度远不及HeLa细胞。

【实施例6】人宫颈上皮内瘤样病变细胞的matrigel胶3D培养、固定及DAPI染(HeLa细胞为阳性对照)

(1)将matrigel(BD，BD Biosciences)于4℃过夜溶解。

(2)在冰上充分预冷的8孔chamber slide中，均匀加入80μL的matrigel平铺底部成一层，置于37℃的培养箱15～30min，使matrigel形成胶状。

(3)胰酶-EDTA常规消化人宫颈上皮内瘤样病变细胞约3min，完全DMEM中和消化反应。

(4)1000rmp离心5min，去上清，重悬细胞沉淀于150μL的HCIN培养基中，加入上述(2)制备的8孔chamber slide中，置于37℃的培养箱15～30min。

(5)洗掉上层培养基。

(6)冰上充分预冷的HCIN培养基150μL中加入5％的matrigel，微量头混匀后沿培养板壁小心加入8孔chamber slide中。

(7)于37℃、5％CO2条件下培养7天，每2天更换一次培养基。

(8)用DAPI进行染并在荧光显微镜下观察。

按照上述方法在Matrigel中培养的人宫颈上皮内瘤样病变细胞，经固定和DAPI染后，显微镜下观察细胞的生长分化状况，免疫荧光染结果如图7，HeLa细胞会形成杂乱无章的聚集体，甚至有些会呈现“葡萄串样”的结构。而人宫颈上皮内瘤样病变细胞在Matrigel中分化培养能够形成表面光滑的球状体，但DAPI染观察到少部分球体内部结构不规则，与癌细胞对比说明人宫颈上皮内瘤样病变细胞具有一定程度的正常分化能力。

【实施例7】人宫颈上皮内瘤样病变细胞的分子病毒学分析(HeLa细胞为阳性对照)

(1)主要溶液的配制：

A.50×TAE溶液：分别称取Na2EDTA·2H2O 37.2g、Tris碱242g、57.1mL醋酸，先加入约800mL的双蒸水，玻璃棒充分搅拌使其完全溶解，并调至PH 8.5，再加入双蒸水于容量瓶内定容至1L，室温保存；

B.LB液体培养基：称取胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCL10g/L，加入约800mL双蒸水，1M的NaOH调节PH 7.0，加入双蒸水于容量瓶内定容至1L，高温高压蒸汽121℃灭菌20min，室温冷却，放置4℃冰箱待用；

C.LB固态培养基：按照LB液体培养基的配方，再额外加入1.5％琼脂糖，高温高压蒸汽121℃灭菌20min，自然冷却待温度降至45℃左右倒平板，室温冷却干燥后，用保鲜膜封装放置4℃冰箱待用；

D.SOC medium：称取30.236g/L SOC粉末，配制250mL，高温高压蒸汽121℃灭菌20min，室温冷却，可放置4℃冰箱待用。

(2)HPV特异性引物的设计如表1：

表1

(3)HPV18基因组限制性内切酶分析：在NCBI中，查HPV18基因组的准确序列，列出所有该病毒基因组内的限制性内切酶，同时给出每个限制性内切酶酶切位点的个数以及相应的酶切位置。

(4)Trizol法提取细胞总RNA：

A.贴壁生长的人宫颈上皮内瘤样病变细胞(1×106)用PBS洗两遍，直接加入1mLTrizol裂解细胞，让Trizol充分接触细胞，吹打几下，液体均质，移至无RNA酶的1.5mL的Ep管中剧烈振荡混匀，室温放置5min；

B.加入200μL氯仿(1/5Trizol裂解液体积，氯仿和裂解液比例1：5)，充分混匀15s，剧烈振荡混匀后常温静置5min，可观察到液体分层；

C.4℃离心12,000g,15min，吸取上层透明层(1mL裂解液，透明层约500-600μL)转移至无RNA酶1.5mL Ep管内，避免吸取到中间层；

D.加入等体积异丙醇(透明层：异丙醇＝1：1)，充分颠倒混匀(动作缓慢轻柔)至液体均质，室温静置10min；

E.4℃离心12,000g,10min，轻柔弃上清，注意观察管底沉淀(白沉淀)，切勿倒出，扣干；

F.加入1mL 75％乙醇，轻柔漂洗，头轻吹将沉淀悬起，但不能将沉淀打散(先加乙醇后加水)；

G.4℃离心12,000g,5min，弃上清，瞬离，吸去多余的乙醇，晾干至沉淀周围透明；

H.DEPC水溶解(根据沉淀大小，米粒大小用50μL溶解)，冰上静置10-30min，吹打混匀后检测RNA浓度。

(5)滚环扩增实验(Rolling Circle Amplification,RCA)

A.人宫颈上皮内瘤样病变细胞的总DNA提取，重复【实施例4】(1)～(9)。

B.取2μL DNA置于10μL的RCA sample buffer中；

C.95℃，3min使DNA变性；

D.取出置于冰上或冷却至室温；

E.预先将0.4μL的enzyme加至10μL reaction buffer中混匀(现配现用)；

F.将E中所得到的混合液加入B中的离心管内，混匀；

G.PCR仪30℃，18h用于扩增反应，65℃，10min(酶热失活)；

H.RCA产物酶切鉴定。

(6)酶切反应：

A.单酶切反应体系如表2：

表2

B.双酶切反应体系如表3：

表3

C.待各个反应体系配制完成后，混匀，瞬时离心；

D.37℃酶切反应1h，取出置于冰上；

E.反应结束后，将酶切产物加入6×Loading buffer混匀后琼脂糖凝胶电泳，恒压120V电泳约45min，电泳结束后于凝胶成像仪中成像系统拍照。

(7)PCR反应体系如表4所示：

表4

(8)两步法逆转录反应：

A.Trizol法提取细胞的RNA，将RNA逆转录为cDNA(两步法，冰上操作)，以cDNA为模版进行扩增，程序如表5所示：

表5

B.依次加入上述溶液，轻柔混匀，进行逆转录反应，具体反应条件如表6所示：

表6

(9)实时荧光定量核酸扩增反应(Real-time PCR,q-PCR)：

A.反应程序如表7所示：

表7

B.依次加入上述溶液，轻柔混匀，进行逆转录反应，具体反应条件如表8所示：

表8

C.添加熔解曲线(Melt Curve 65.0to 95.0℃,increment 0.5℃for 5s)；

D.导出实验结果，处理分析数据，Graphpad Prism.5.0作图。

(10)细菌转化：

A.将感受态细胞放置于冰上融解10～15min，将预先准备好的连接液10μL加入至200μL的感受态细胞中，轻柔混匀内容物，冰上静置30min；

B.将Ep管转移至提前预热到42℃的水浴锅内热激45s(注意：在此过程中不要振动Ep管)，热激后迅速将Ep管放置于冰上，冷却1～2min；

C.加入250μL的SOC medium或不加Amp的LB液体培养基，混匀后放置于37℃摇床中振荡复苏1h；

D.取出复苏完的菌液50μL均匀涂布于LB软琼脂固态平板上，将平板的正面朝上，室温放置0.5h；

E.待菌液完全被培养基吸收后，转移至37℃细菌培养箱中过夜培养12～16h，次日取出平板挑取单克隆摇菌。

(11)PCR产物纯化(胶回收)：

A.事先称取离心管的重量，用于后续计算胶重，并提前打开水浴锅，调至温度为50℃；

B.经琼脂糖凝胶电泳分离后，确认目的片段，然后用一洁净小刀将目的片段切下(每切下一个片段应擦拭刀片后再切割下一个，避免产物间交叉污染)，放入离心管内，后纯化PCR产物，用于后续的定向克隆；

C.先单独称取离心管重为W1，将切割下的胶放置于对应离心管内，再称取离心管和胶的总重量为W2，W2-W1即得到胶重W3(0.1g-100μL)，向离心管中加入3倍胶重对应体积的QG buffer；

D.将离心管放于水浴锅(50℃)内10min，注意每2～3min取出离心管旋涡震荡一次，最终使胶完全溶解，溶液颜变为黄；

E.然后向离心管内加入一倍胶重对应体积的异丙醇溶液(提前放置50℃中预热)，上下颠倒混匀；

F.将吸附柱置于收集管内，使用移液器转移上述溶液至吸附柱内，12,000rpm离心1min，弃滤液；

G.向吸附柱内再加入500μL的QG buffer，室温12,000rpm离心1min，弃滤液；

H.加入750μL的漂洗液PE(使用PE液请前务必检查是否按照要求加入对应量的无水乙醇)，静置2～5min，室温12,000rpm离心1min，弃滤液；

I.将吸附有DNA的吸附柱置于离心机内，12,000rpm离心2min，尽可能除尽管壁上的液体，避免残留的乙醇对后续实验带来影响，彻底晾干；

J.将吸附柱转移至一个新Ep管中，向吸附柱的中央悬空滴加50μL(分两次滴加可提高洗脱效率)的洗脱液EB buffer，室温先静置4min，12,000rpm离心2min，Ep管中所得的溶液即为所需的目的DNA；

K.Nanodrop 2,000测定胶回收产物DNA的浓度。

(12)TA克隆连接：

A.目的基因的纯化：电泳后切胶回收目的DNA片段；

B.连接反应：取1μL上述胶回收DNA产物到新的microtube中，加入1μL pMD20-Tvector和3μL灭菌水，混匀；

C.加入5μL Ligation Mightly Mix，轻轻混匀；

D.16℃反应30min；

E.全量加入至100μL感受态细胞(DH5α)中进行细菌转化实验；

F.次日取出挑取单克隆于细菌摇床中摇菌，转速为250rpm,16h；

G.取出1mL菌液送至上海生工公司进行测序。

(13)人宫颈上皮内瘤样病变细胞中HPV18 E2/E7起始拷贝数比值的计算：

A.以pBR322-HPV18重组质粒为标准品，根据公式，起始拷贝数(copies/μL)＝(6.02×1023拷贝数/moL)×(浓度g/mL)/分子量(MW g/moL)＝copies/Ml,其中，分子量(MW)＝碱基数×660(道尔顿/碱基)，Nanodrop 2,000测定标准品浓度；

B.将标准品pBR322-HPV18依次10倍梯度稀释5次，共得到6个不同浓度的标准品(10倍浓度梯度)，将对应的数值分别代入上述公式中，计算出不同浓度的标准品对应的起始拷贝数，以不同浓度的标准品为模板，利用HPV18 E2 amino 1、HPV18 E2 amino 2、HPV18E2 hinge、HPV18 E2 carboxyl和HPV18 E7等引物分别对其进行荧光定量PCR(Q-PCR)，反应结束后可得到不同浓度模板的Ct值，由于每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数Log copies存在一定的线性关系，以起始拷贝数的对数Log copies为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线如图8；

C.以人宫颈上皮内瘤样病变细胞的第p5、p8、p10、p12和p14培养代数的细胞基因组DNA为模板，利用HPV18 E2 amino 1、HPV18 E2 amino 2、HPV18 E2 hinge、HPV18 E2carboxyl和HPV18 E7等引物分别对其进行荧光定量PCR(Q-PCR)，已知纵坐标的Ct值，利用线性公式可计算出对应的起始拷贝数，计算E2/E7的比值，计算结果如图9所示(E2/E7的比值可用来初步分析HPV18在人宫颈上皮内瘤样病变细胞内的存在形式，若E2/E7≥1或0＜E2/E7＜1，则说明HPV18在细胞内含有游离型HPV，若E2/E7＝0(或约为0)，则说明HPV18在细胞内以完全整合型的形式存在)。由此推测，人宫颈上皮内瘤样病变细胞在传代代数p5、p8、p10、p12和p14均有游离型HPV18的存在。

(14)RCA法鉴定人宫颈上皮内瘤样病变细胞中游离型HPV18：

A.提取人宫颈上皮内瘤样病变细胞第p5、p7和p8代细胞的基因组DNA，Nanodrop2,000检测DNA浓度，分别取第5代细胞DNA原液1μL、2μL、3μL，第p7代细胞DNA原液2μL、3μL和第p8代细胞DNA原液2μL、3μL为起始模板进行RCA扩增；

B.再将所得到的RCA产物分别用EcoR I酶切，琼脂糖凝胶电泳检测结果，所用DNALadder为DL 1,000和1Kb DNA Marker；

C.为验证人宫颈上皮内瘤样病变细胞基因组DNA的RCA扩增产物确实为HPV18，采用不同的组合式酶切，并分析得到的DNA片段的酶切模式。本实施例选取5种不同的限制性内切酶，6种不同的酶切方式，这些内切酶在HPV18基因组上的酶切位点个数、酶切位置以及酶切序列均如表所示，RCA产物经不同组合酶酶切后，所得的片段大小和数目如表所示；

c-1.限制性内切酶列表如表9：

表9

c-2.不同酶切列表如表10：

表10

D.提取人宫颈上皮内瘤样病变细胞第p5、p10和p14代细胞的基因组DNA进行RCA扩增，取DNA原液2μL作为扩增模板，同时在RCA反应体系中另外再加入1μL的dNTPs，酶切反应完成后，经琼脂糖凝胶电泳分离，得到的具体片段数目和大小如图10所示。第1～2孔道(对照组)分别为环状质粒pBR322经RCA扩增和未经扩增EcoR I酶切结果，分别得到长约4361bp明显的特异性条带；第4孔道(阳性对照组)为癌细胞HeLa(完全插入型HPV18细胞株)的基因组DNA经RCA扩增EcoR I酶切结果，未见任何条带。表明人宫颈上皮内瘤样病变细胞DNA的RCA扩增产物经不同酶切组合得到的片段大小和数目均与预测的片段大小和数目完全一致。每种酶切方式得到的各个片段的大小相加刚好为一个完整HPV18环状基因组的大小；

E.利用HPV18系列引物对RCA产物进行鉴定，采用EcoRI单酶切RCA产物，扩增得到完整长度的HPV18基因组，切胶回收纯化DNA产物，PCR检测HPV18不同基因，所用引物如表11；

表11

F.RCA扩增HPV18环状DNA产物的鉴定：HPV18限制性酶切图谱(EcoR I单酶切)，得到完整单位的HPV18基因组的线性片段(7857bp)，提取人宫颈上皮内瘤样病变细胞总DNA，RCA扩增完成后，EcoR I酶切、电泳，并设置两个对照，分别为人宫颈上皮内瘤样病变细胞RCA反应不加酶和阳性对照HeLa细胞RCA反应。将EcoR I酶切后的产物胶回收，纯化DNA，用HPV18相关引物对其进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测结果，凝胶成像仪拍照。结果如图11A-C所示扩增产生对应大小的特异性条带，步骤(14)C的结果得到验证表明本发明所分离培养的人宫颈上皮内瘤样病变细胞内含有游离型HPV18，并且在细胞持续传代至第14代依然可检测出游离型HPV18。

【实施例8】人宫颈上皮内瘤样病变细胞的药物敏感性检测

(1)将人宫颈上皮内瘤样病变细胞用0.05％胰酶消化，制备成单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种细胞悬液100μL，每孔约为5000个细胞，于37℃、5％CO2培养箱培养。

(2)次日加药(氯喹、双氢青蒿素、视黄酸、伏立诺他、JQ1)处理，每孔加入200μL配制好的不同浓度药物，药物浓度梯度(μM)为40、20、10、5、2.5、1.2、0.6、0，每种药物的每个梯度设置六个复孔，同时设置细胞对照组(接种细胞不加药处理)及只加HCIN培养基的空白对照组，每组设置六个复孔。

(3)药物处理(37℃、5％CO2培养箱培养)48小时后，吸去孔内溶液，每孔加入10μLCKK-8检测试剂(同仁化学，日本)，即10μLCCK-8+90μLDMEM培养基。

(4)在37℃、5％CO2细胞培养箱内继续孵育1～1.5个小时，吸光度范围控制在1.0～1.5之间最好。

(5)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

人宫颈上皮内瘤样病变细胞对上述5种药物敏感性检测结果如图12。药物浓度-细胞存活率曲线表明细胞存活率随药物浓度增大而减小，其中氯喹、视黄酸和双氢青蒿素对细胞株的杀伤力较小，即使使用药物设置的最大浓度(40μM)，细胞依然保持一定的存活率，JQ1对细胞的杀伤力相比会更强一些。以上实验表明人宫颈上皮内瘤样病变细胞对不同药物的敏感性和区分度。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。