一种猪粪便污染的微生物溯源方法

本发明涉及微生物溯源技术领域，具体涉及一种猪粪便污染的微生物溯源方法。

地表水体的粪便污染是畜禽养殖业导致的主要环境污染问题之一。在中国养殖业中，养猪业产生的粪污不仅数量占比最多，而且由于较难处理而常常出现漏排偷排的现象，从而导致了环境水体的粪便污染。准确鉴别猪源粪便污染有助于环境管理部门从源头上彻底治理猪源粪便污染。

微生物溯源(Microbial source tracking，MST)技术为追踪猪源粪便污染源提供了有效手段，其主要是依据源指示微生物与宿主之间所具有的特异性关系进而来定位污染源。

然而，目前为止，中国缺乏在地表水体中猪源粪便污染微生物溯源的相关技术及方法流程。虽然PCR法检测可用于地表水环境的猪源粪便污染溯源分析。但是，由于人、猪、鸡或羊等体内均有拟杆菌，并且不同地区的猪肠道拟杆菌基因存在差异，导致猪源粪便污染微生物溯源检测被干扰，产生假阳性或假阴性检测结果。

因此，本发明提供一种猪粪便污染的微生物溯源方法，普遍适用于我国地表水体样本检测，提高特异性、敏感性和准确性是本领域技术人员亟需解决的问题。

有鉴于此，本发明提供了一种猪粪便污染的微生物溯源方法。经过评估、优化反应条件以及验证，最终获得一对特异性、敏感性和准确性都为100％的猪源特异性拟杆菌PCR引物，可用于在中国环境水体中检测猪源粪便污染。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种猪粪便污染的微生物溯源引物，包括正向引物PF163F和反向引物Bac708R，引物序列为：

正向引物PF163F：5’-GCGGATTAATACCGTATGA-3’，SEQ ID NO:1所示；

反向引物Bac708R：5’-CAATCGGAGTTCTTCGTG-3’，SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种基于上述引物组的试剂盒，包括正、反向引物和反应液。

优选的：正、反向引物：25μmol/L正向引物PF163F；25μmol/L反向引物Bac708R；所述反应液包括10×Ex Taq buffer、dNTP Mixture、5U/μL TaKaRa Ex Taq、5mg/mLBSA。

本发明还提供了一种猪粪便污染的微生物溯源方法，PCR反应体系：5μL的10×ExTaqbuffer、4μL的2.5mM dNTP Mixture、0.25μL 5U/μL TaKaRa Ex Taq、1μL 5mg/mL BSA、1μL 25μmol/L正向和1μL 25μmol/L反向引物、1μL模板DNA，最后用无菌超纯水补至25μL。

优选的：PCR反应条件为：95℃3min，30个循环：95℃30s，62℃1min，72℃30s，最后72℃10min。

本发明还提供了一种基于上述引物或上述试剂盒在中国环境水体监测中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种猪粪便污染的微生物溯源方法，取的技术效果为克服了国内不同地区的猪肠道拟杆菌基因差异对检测的影响，并排除人、牛、鸡、羊等体内拟杆菌的干扰，采用本发明提供的方法，对猪粪便污染的微生物检测的特异性、敏感性和准确性都为100％。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为反应条件优化前本发明提供的引物PF163F和Bac708R在猪和牛粪便样品中的定性检测结果示意图。其中，左图泳道1～15是对猪粪便样品的检测结果；泳道16～21是牛粪便样品的检测结果；泳道22和23分别是Marker和阴性对照；右图为泳道22的Marker标记。

图2附图为反应条件优化前本发明提供的引物PF163F和Bac708R在羊、鸡、人和马粪便样品中的定性检测结果示意图。其中，左图泳道1～6是对羊粪便样品的检测结果；泳道7～12是对鸡粪便样品的检测结果；泳道14～19是对人粪便样品的检测结果；泳道20～23是对马粪便样品的检测结果；泳道13是Marker；右图为泳道13的Marker标记。

图3附图为本发明提供的引物PS422F和Bac581R在猪和牛粪便样品中的定性检测示意图。其中，左图泳道1～15是对猪粪便样品的检测结果；泳道17～22是牛粪便样品的检测结果；泳道16是Marker；右图为泳道16的Marker标记。

图4附图为本发明提供的引物PS422F和Bac581R在羊、鸡、人和马粪便样品中的定性检测结果示意图。其中，左图泳道1～6是对羊粪便样品的检测结果；泳道7～12是对鸡粪便样品的检测结果；泳道14～19是对人粪便样品的检测结果；泳道20～23是对马粪便样品的检测结果；泳道13是Marker；右图为泳道13的Marker标记。

图5附图为本发明提供的引物Bac41F和PS183R在猪和牛粪便样品中的定性检测示意图。其中，左图泳道1～15是对猪粪便样品的检测结果；泳道17～22是牛粪便样品的检测结果；泳道16是Marker；右图为泳道16的Marker标记。

图6附图为本发明提供的引物Bac41F和PS183R在羊、鸡、人和马粪便样品中的定性检测结果示意图。其中，左图泳道1～6是对羊粪便样品的检测结果；泳道7～12是对鸡粪便样品的检测结果；泳道14～19是对人粪便样品的检测结果；泳道20～23是对马粪便样品的检测结果；泳道13是Marker；右图为泳道13的Marker标记。

图7附图为反应条件优化后本发明提供的引物PF163F和Bac708R在猪和牛粪便样品中的定性检测结果示意图。其中左图泳道1～15是对猪粪便样品的检测结果；泳道17～22是牛粪便样品的检测结果；泳道16和23分别是Marker和阴性对照；右图为泳道16的Marker标记。

图8附图为反应条件优化后本发明提供的引物PF163F和Bac708R在羊、鸡、人和马粪便样品中的定性检测结果示意图。其中左图泳道1～6是对羊粪便样品的检测结果；泳道7～12是对鸡粪便样品的检测结果；泳道14～19是对人粪便样品的检测结果；泳道20～23是对马粪便样品的检测结果；泳道13是Marker；右图为泳道13的Marker标记。

图9附图为本发明提供的引物PF163F和Bac708R在最佳反应条件下对治理前的水样的定性检测结果示意图。其中左图泳道4、5和9分别为阴性对照、Marker和阳性对照；其余泳道是对环境水样的检测结果；右图为泳道5的Marker标记。

图10附图为本发明提供的引物PF163F和Bac708R在最佳反应条件下对治理后的水样的定性检测结果示意图。其中，左图泳道10、11和12分别为Marker、阳性对照和阴性对照；其余泳道是对环境水样的检测结果；右图为泳道10的Marker标记。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种猪粪便污染的微生物溯源方法。

所涉及的单一药品、组分均为市售渠道采购，例如，10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)来源为TakaraBio,Otsu,Japan；dNTP Mixture来源为Takara Bio,Otsu,Japan；未提及的方法为常规实验方法，未提及的试验设备为常规实验设备，对其品牌不做限定，在此不再一一赘述。

样品收集和预处理：我们跨纬度从广西、河南、北京、内蒙古取各种动物的新鲜粪便样品用于说明猪源粪便污染微生物溯源方法的有效性；取环境水样样品用于验证猪源粪便污染微生物溯源方法实际应用效果，共采集两次，期间环保部门对采取区域进行了管治。

实施例1

样品DNA提取

粪便样品直接用FastDNATM Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，Solon，OH，USA)试剂盒提取DNA；环境水样采用0.45μm真空过滤器过滤后，微生物都被截留在滤膜上，将滤膜剪碎，然后用FastDNATM Spin Kit for Soil(MP Biomedicals，Solon，OH，USA)试剂盒提取DNA。

实施例2

引物筛选：

1组引物：

正向引物PF163F：5’-GCGGATTAATACCGTATGA-3’，SEQ ID NO:1所示；

反向引物Bac708R：5’-CAATCGGAGTTCTTCGTG-3’，SEQ ID NO:2所示。

靶标微生物为猪源特异性拟杆菌，目的片段为16S rRNA基因的部分片段，大小为563bp。

2组引物：

正向引物PS422F：5’-CGGGTTGTAAACTGCTTTTATGAAG-3’，SEQ ID NO:3所示；

反向引物Bac581R：5’-CGCTCCCTTTAAACCCAATAAA-3’，SEQ ID NO:4所示。

靶标微生物为猪源特异性拟杆菌，目的片段为16S rRNA基因的部分片段，大小为150bp。

3组引物：

正向引物Bac41F：5’-TACAGGCTTAACACATGCAAGTCG-3’，SEQ ID NO:5所示；

反向引物PS183R：5’-CTCATACGGTATTAATCCGCCTTT-3’，SEQ ID NO:6所示。

靶标微生物为猪源特异性拟杆菌，目的片段为16S rRNA基因的部分片段，大小为150bp。

根据前期试验预测，这三组引物皆可用于猪源粪便污染溯源。各组引物委托“华大基因有限公司”合成，并引物按如下条件进行试验：

反应体系均为：5μL的10×Ex Taq buffer(Mg2+plus)(TaKaRa)、4μL的dNTPMixture(2.5mM of each)、0.25μL TaKaRa Ex Taq(5U/μL)、1μL BSA(5mg/mL)、正向和反向引物(25μmol/L)各1μL、1μL模板DNA，最后用无菌超纯水补至25μL。

1组反应条件为：95℃3min，30个循环：95℃30s，53℃1min，72℃30s，最后72℃10min。

2组和3组反应条件均为：95℃3min，30个循环：95℃30s，62℃1min，72℃30s，最后72℃10min。

其中，1组引物在猪和牛粪便样品中的定性检测参见图1，泳道1～15是猪粪便样品；泳道16～21是牛粪便样品；

1组引物在羊、鸡、人和马粪便样品中的定性检参见图2，泳道1～6是羊粪便样品；泳道7～12是鸡粪便样品；泳道14～19是人粪便样品；泳道20～23是马粪便样品。

2组引物在猪和牛粪便样品中的定性检测参见图3，泳道1～15是猪粪便样品；泳道17～22是牛粪便样品；

2组引物在羊、鸡、人和马粪便样品中的定性检参见图4，泳道1～6是羊粪便样品；泳道7～12是鸡粪便样品；泳道14～19是人粪便样品；泳道20～23是马粪便样品。

3组引物在猪和牛粪便样品中的定性检测参见图5，泳道1～15是猪粪便样品；泳道17～22是牛粪便样品；

3组引物在羊、鸡、人和马粪便样品中的定性检参见图6，泳道1～6是羊粪便样品；泳道7～12是鸡粪便样品；泳道14～19是人粪便样品；泳道20～23是马粪便样品。

结果表明：仅1组引物的假阳性结果相对较少，2组和3组引物假阳性结果相对较多，部分预测实验效果较好的引物在实际应用中，根本不能满足实验要求。

最终，确认引物序列为：

PF163F：GCGGATTAATACCGTATGA；SEQ ID NO:1所示；

Bac708R：CAATCGGAGTTCTTCGTG。SEQ ID NO:2所示。

猪源粪便污染微生物溯源方法的有效性可从敏感性、特异性和准确性三个方面进行评估，分别用以下三个公式进行计算：

敏感性＝TP/(TP+FN)

特异性＝TN/(TN+FP)

准确性＝(TP+TN)/(TP+FP+TN+FN)

式中，TP(True Positive)为目标样品(猪粪便样品)检测为阳性的样品数；FN(False Negative)为目标样品检测为阴性的样品数；TN(True Negative)为非目标样品(非猪粪便样品)检测为阴性的样品数；FP(False Positive)为非目标样品检测为阳性的样品数。

1组引物的评估结果参见表1：

表1

结果表明，虽然1组相较于2、3检测效果好，但在该反应条件下，引物特异性和准确性不高，分别为67.9％、100％和79.1％。

实施例3

反应条件筛选

使用实施例2中1组引物，反应体系不变，梯度(1℃)提高退火温度，筛选最适宜的反应条件。

结果表明PCR最佳的反应条件为：95℃3min，30个循环：95℃30s，62℃1min，72℃30s，最后72℃10min。

实施例4

一种猪粪便污染的微生物溯源引物，包括正向引物PF163F和反向引物Bac708R，引物序列为：

正向引物PF163F：5’-GCGGATTAATACCGTATGA-3’，SEQ ID NO:1所示；

反向引物Bac708R：5’-CAATCGGAGTTCTTCGTG-3’，SEQ ID NO:2所示。

PCR反应体系：5μL的10×Ex Taq buffer、4μL的2.5mM dNTP Mixture、0.25μL 5U/μL TaKaRa Ex Taq、1μL 5mg/mL BSA、1μL 25μmol/L正向和1μL 25μmol/L反向引物、1μL模板DNA，最后用无菌超纯水补至25μL。

PCR反应条件为：95℃3min，30个循环：95℃30s，62℃1min，72℃30s，最后72℃10min。

在猪和牛粪便样品中的定性检测结果参见图7。其中泳道1～15是猪粪便样品；泳道17～22是牛粪便样品；

在羊、鸡、人和马粪便样品中的定性检测结果参见图8。其中泳道1～6是羊粪便样品；泳道7～12是鸡粪便样品；泳道14～19是人粪便样品；泳道20～23是马粪便样品。

从图1、2、7和8可以看出，本发明筛选的引物在优化反应条件前后对不同宿主粪便样品的定性检测结果。具体的，从图1和图2可以看出，在优化反应条件前，该引物在非猪宿主(人、马)样品中检测到较多的目标条带(大小约为563bp)，特异性较低。而在图7和图8中，优化反应条件后，该引物在非猪宿主样品中无目标条带检出，仅在猪粪便样品中检出有目标条带，特异性、敏感性和准确性都为100％。所以，该引物在优化后的反应条件下可以准确将猪粪便样品与其它宿主粪便样品区分开。

进一步的，在各种动物粪便样品中的检测结果如表2所示，分别用以下三个公式进行计算：

敏感性＝TP/(TP+FN)

特异性＝TN/(TN+FP)

准确性＝(TP+TN)/(TP+FP+TN+FN)

式中，TP(True Positive)为目标样品(猪粪便样品)检测为阳性的样品数；FN(False Negative)为目标样品检测为阴性的样品数；TN(True Negative)为非目标样品(非猪粪便样品)检测为阴性的样品数；FP(False Positive)为非目标样品检测为阳性的样品数

经过计算，引物特异性和准确性都为100％。结果说明提高了退火温度后，该引物可准确地将猪粪便样品与其它动物宿主粪便样品区分开。

表2

对比试验

将实施例4的检测方法应用于我国地表水体样本的检测。

分别采集环境治理前和治理后的样本，治理前参见图9，其中泳道4、5和9分别为阴性对照、Marker和阳性对照；其余泳道是环境水样；治理后参见图10，其中泳道10、11和12分别为Marker、阳性对照和阴性对照；其余泳道是环境水样。

结果表明，图9中很明显可以看到环境水样中有目标条带(大小约为563bp)检出，说明治理前的环境水体存在猪粪污染。

图10所示，经过相关环保部门处理后，可以看到所有水样均无目标条带检出，表明治理后的环境水体中不存在猪粪污染。

实施例5

一种猪粪便污染的微生物溯源的试剂盒，包括正、反向引物：25μmol/L正向引物PF163F；25μmol/L反向引物Bac708R；反应液包括10×Ex Taq buffer、dNTP Mixture、5U/μLTaKaRa Ex Taq、5mg/mLBSA。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。