基于CRISPR/Cas9 SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体及其构建和应用

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种基于CRISPR/Cas9 Sun Tag系统表达DRM2基因靶标TYLCCNV从而抑制双生病毒侵染载体及其构建方法和应用。

中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV)是我国广泛存在的一种双生病毒，在田间伴随有卫星分子中国番茄黄化曲叶病毒β(Tomatoyellow leaf curl China betasatellite,TYLCCNB)一起侵染茄科作物。TYLCCNV/TYLCCNB通过烟粉虱传播，感病番茄植株矮化，生长缓慢或停滞，顶部叶片常稍褪绿发黄、变小，叶片边缘上卷，叶片增厚，叶质变硬，叶背面叶脉常显紫。目前该病害已经在我国大规模爆发，在多种作物上造成了严重的危害。以番茄为例，2009年我国番茄黄化曲叶病毒病的年发生面积超过300万亩，遭受严重损失的面积在100万亩以上，经济损失超过50亿人民币，近几年发病面积进一步扩大，对番茄生产造成了严重损失。

现阶段虽然在寄主植物以及TYLCCNV中鉴定到了许多抗病基因或关键位点，但这些发现在田间生产中尚未有进一步的实际应用，无法将理论转化为生产力。目前，田间抗双生病毒主要有以下局限和问题：

(1)田间抗病毒工程还是处于以预防为主，防治结合的阶段。病毒病不同于细菌、真菌以及虫害，没有特定的化学药剂进行根治；

(2)双生病毒多依靠昆虫媒介进行传播，控制昆虫传播的策略避免不了大量使用化学试剂，对田间生态环境以及人类生存环境都具有极大危害，农药残留问题也急需解决；

(3)抗双生病毒农作物品种培育缓慢，田间效果不理想。针对寄主内源基因的过表达和突变体材料可能造成植株的农艺性状的改变，存在潜在的极大不确定因素；

(4)目前广泛应用的CRISPR/Cas9系统的抗病毒效果主要是对靶标病毒进行切割，存在病毒进化出逃逸编辑的风险，若形成病毒突变体，会对农业生产产生更大的安全威胁。

CRISPR/Cas9系统可以定点靶标目标DNA片段，并依靠Cas9蛋白对其编辑，是一种目前广泛运用的基因编辑技术。CRISPR/Cas9 Sun Tag系统携带的是dCas9蛋白，不会对靶点进行编辑，会依据gRNA协同其他蛋白共同靶标到靶点。

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9 SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体及其构建和应用。

本发明通过设计针对TYLCCNV/TYLCCNB特定甲基化区域的gRNA，构建了利用甲基化修饰抗双生病毒的农杆菌侵染性克隆载体。

本发明采用的技术方案具体如下：

一种基于CRISPR/Cas9 SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体：

所述双生病毒为中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)及伴随的卫星(TYLCCNB)；所述载体为pEG302 22aa Sun Tag NtDRMcd-A(下文简称pEG302-A)和pEG302 22aa Sun TagNtDRMcd-β(下文简称pEG302-β)；

具体包括以下步骤：

(1)在TYLCCNV序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括pEG302-A载体所需的三个靶点所需的六条gRNA链：g16-A/B，g17-A/B，g9A-A/B；其序列如SEQ ID：No.1-6所示；

g16-A:ATTGTCTGGTGACGCGGACAGTGG

g16-B:AAACCCACTGTCCGCGTCACCAGA

g17-A:ATTGGCACTTTAAAGAATTCATGG

g17-B:AAACCCATGAATTCTTTAAAGTGC

g9A-A:ATTGGGCCATCCGTATAATATTAC

g9A-B:AAACGTAATATTATACGGATGGCC

(2)将(1)中所述单链gRNA合成为双链，具体方法如下：

①先将上述单链gRNA稀释为50uM/uL；

②按照5×Oligo Buffer：4uL；单链A：4uL；单链B：4uL；H2O：8uL做成20uL体系；

③PCR仪器控温：95℃2min；以0.1℃/S下降到25℃；4℃5min降温；

④得到的片段稀释50倍，保存于-20℃；

(3)包含g16单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g16载体的构建：

基础载体来自中国科学院赠予的AtU6-26-sgRNA-SK；

①1ug AtU6-26-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物：

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；其序列如SEQ ID:No.13所示；

R：g16-B：AAACCCACTGTCCGCGTCACCAGA；其序列如SEQ ID：No.2所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到含有g16单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g16(下文简称SK-U6-26-g16)载体；

(4)包含g17单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g17载体的构建：

①1ug AtU6-26-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；其序列如SEQ ID:No.13所示；

R：g17-B：AAACCCATGAATTCTTTAAAGTGC；其序列如SEQ ID：No.4所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到含有g17单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g17(下文简称SK-U6-26-g17)载体；

(5)含有g16，g17的双靶点AtU6-26-sgRNA-SK-g16+g17载体的构建：

①单酶切SK-U6-26-g16；质粒1ug，SpeI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②双酶切SK-U6-26-g17；质粒1ug，SpeI 1uL，NheI 1uL，10×buffer 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收小片段，约500bp；

③10×T4DNA ligase buffer 2uL，单酶切后的SK-U6-26-g16线性化载体50ng，双酶切后的SK-U6-26-g17DNA小片段10ng，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认双靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：g16-A：ATTGTCTGGTGACGCGGACAGTGG；其序列如SEQ ID:No.1所示；

R：g17-B：AAACCCATGAATTCTTTAAAGTGC；其序列如SEQ ID:No.4所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到双靶点的SK-U6-26-g16+g17载体；

(6)AtU6-1-sgRNA-SK载体的构建：因为载体中靶点数如果过多，可以用AtU6其他成员来表达gRNA，防止发生同源重组，AtU6-26-sgRNA-SK载体换启动子，将AtU6-26换为AtU6-1；

①AtU6-1启动子的克隆：

所需引物：其序列如SEQ ID:No.15-16所示；

if-SK-U6-1-F：AGGGCGAATTGGGTGCTAGCGAAATCTCAAAATTCCGG

if-SK-U6-1-R：CTAAAACTGAGACCTGAATTCAGGTCTCTCAATCACTACTTCGT

5×Fast Pfu buffer 10uL，dNTP 4uL，引物F/R 1uL，拟南芥cDNA1uL，FastPfu酶1uL，ddH2O补足至50uL体系；PCR仪控温，95℃1min，(95℃20sec，55℃20sec，72℃90sec，35×cycle)，72℃5min，4℃5min；纯化回收DNA；

②双酶切AtU6-26-sgRNA-SK载体，质粒1ug，EcoRI 1uL，NheI 1uL，10×buffer2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收大片段；

③Infusion法换启动子：第二步线性化载体60ng，AtU6-1基因90ng，5×CEIIbuffer 4uL，Exnase 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认启动子是否更换成功；

鉴定引物：其序列如SEQ ID:No.15-16所示；

F：if-SK-U6-1-F：AGGGCGAATTGGGTGCTAGCGAAATCTCAAAATTCCGG

R：if-SK-U6-1-R：CTAAAACTGAGACCTGAATTCAGGTCTCTCAATCACTACTTCGT

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用上述引物测序，至此得到更换启动子后的AtU6-1-sgRNA-SK载体；

(7)含有g9A单靶点的AtU6-1-sgRNA-SK-g9A载体的构建：

①1ug AtU6-1-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-1-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物：

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；其序列如SEQ ID:No.13所示；

R：g9A-B：AAACGTAATATTATACGGATGGCC；其序列如SEQ ID:No.6所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到单靶点的AtU6-1-sgRNA-SK-g9A(下文简称SK-U6-1-g9A)载体；M13F/R其序列如SEQ ID:No.13-14所示；

(8)三靶点的SK-g16+g17+g9A载体的构建：

①单酶切SK-U6-26-g16+17；质粒1ug，SpeI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②双酶切SK-U6-1-g9A；质粒1ug，SpeI 1uL，NheI 1uL，10×buffer 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收小片段；

③10×T4DNA ligase buffer 2uL，单酶切后的SK-U6-26-g16+g17线性化载体50ng，双酶切后的SK-U6-1-g9A的DNA 10ng，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认双靶点是否连入载体；

鉴定引物：

F：g16-A：ATTGTCTGGTGACGCGGACAGTGG；其序列如SEQ ID:No.1所示；

R：g9A-B：AAACGTAATATTATACGGATGGCC；其序列如SEQ ID:No.6所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到三靶点的SK-g16+g17-g9A载体；M13F/R其序列如SEQ ID:No.13-14所示；

(9)pEG302-A终载体的构建：

①单酶切pEG302载体；质粒1ug，KpnI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②以SK-g16+g17-g9A载体为模板，扩增包含三靶点的片段：5×Fast Pfu buffer10uL，dNTP 4uL，引物F/R 1uL，质粒1uL，FastPfu酶1uL，ddH2O补足至50uL体系；PCR仪控温，95℃1min，(95℃20sec，55℃20sec，72℃90sec，35×cycle)，72℃5min，4℃5min；割胶回收DNA；

所需引物：其序列如SEQ ID:No.17-18所示；

pEG302-if-SK-F2：ACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGAATTGGGTGCTAGC

pEG302-if-SK-R：GTCGTGCTCCACCATGGTACCCTGGAGCTCACTAGT

③Infusion法连接：第一步线性化载体60ng，SK-g16+g17-g9A基因片段90ng，5×CEII buffer 4uL，Exnase 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用卡那霉素作为抗性筛选，挑选单克隆进行菌落PCR鉴定并测序，确认是否连入pEG302载体；

鉴定引物：

F：g16-A：ATTGTCTGGTGACGCGGACAGTGG；其序列如SEQ ID:No.1所示；

R：g9A-B：AAACGTAATATTATACGGATGGCC；其序列如SEQ ID:No.6所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到三靶点的pEG302-A终载体；M13F/R其序列如SEQ ID:No.13-14所示；

M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG

M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

(10)终载体农杆菌转化：农杆菌LBA4404菌株50uL，质粒5uL，电击转化；28℃孵育90min；Kan+Rif抗性涂板，挑选单克隆做菌落PCR鉴定；-80℃保存菌株。

(11)在TYLCCNB编码的βC1序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括pEG302-β载体所需的三个靶点所需的六条gRNA链：g1-A/B，g14-A/B，g9B-A/B；其序列如SEQ ID:No.7-12所示；

g1-A:ATTGGTAAAATAATTGGGACACCAA

g1-B:AAACTTGGTGTCCCAATTATTTAC

g14-A:ATTGATAGTCATGTTTATTTGTTG

g14-B:AAACCAACAAATAAACATGACTAT

g9B-A:ATTGCGCCACCGTTCTAATATTAC

g9B-B:AAACGTAATATTAGAACGGTGGCG

(12)将(10)中所述单链gRNA合成为双链，具体方法如下：

①先将上述单链gRNA稀释为50uM/uL；

②按照5×Oligo Buffer：4uL；单链A：4uL；单链B：4uL；H2O：8uL做成20uL体系；

③PCR仪器控温：95℃2min；以0.1℃/S下降到25℃；4℃5min降温；

④得到的片段稀释50倍，保存于-20℃；

(13)包含g1单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g1载体的构建：

①1ug AtU6-26-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存。

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；其序列如SEQ ID:No.13所示；

R：g1-B：AAACTTGGTGTCCCAATTATTTAC；其序列如SEQ ID:No.8所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到包含g1单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g1(下文简称SK-U6-26-g1)载体；

(14)包含g14单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g14载体的构建：

①1ug AtU6-26-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存。

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；其序列如SEQ ID:No.13所示；

R：g14-B：AAACCAACAAATAAACATGACTAT；其序列如SEQ ID:No.10所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到包含g14单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g14(下文简称SK-U6-26-g14)载体；

(15)包含g1，g14的双靶点AtU6-26-sgRNA-SK-g1+g14载体的构建：

①单酶切SK-U6-26-g1；质粒1ug，SpeI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②双酶切SK-U6-26-g14；质粒1ug，SpeI 1uL，NheI 1uL，10×buffer 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收小片段，约500bp；

③10×T4DNA ligase buffer 2uL，单酶切后的SK-U6-26-g1线性化载体50ng，双酶切后的SK-U6-26-g14DNA小片段10ng，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认双靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：g1-A：ATTGGTAAAATAATTGGGACACCAA；其序列如SEQ ID:No.7所示；

R：g14-B：AAACCAACAAATAAACATGACTAT；其序列如SEQ ID:No.10所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到双靶点的SK-U6-26-g1+g14载体；

(16)包含g9B单靶点的AtU6-1-sgRNA-SK-g9B载体的构建：

①1ug AtU6-1-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存。

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-1-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；其序列如SEQ ID:No.13所示；

R：g9B-B：AAACGTAATATTAGAACGGTGGCG；其序列如SEQ ID:No.12所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到单靶点的AtU6-1-sgRNA-SK-g9B(下文简称SK-U6-1-g9B)载体；

(17)三靶点的SK-g1+g14+g9B载体的构建：

①单酶切SK-U6-26-g1+14；质粒1ug，SpeI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②双酶切SK-U6-1-g9B；质粒1ug，SpeI 1uL，NheI 1uL，10×buffer 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收小片段；

③10×T4DNA ligase buffer 2uL，单酶切后的SK-U6-26-g1+14线性化载体50ng，双酶切后的SK-U6-1-g9B的DNA 10ng，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认双靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：g1-A：ATTGGTAAAATAATTGGGACACCAA；其序列如SEQ ID:No.7所示；

R：g9B-B：AAACGTAATATTAGAACGGTGGCG；其序列如SEQ ID:No.12所示；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到三靶点的SK-g1+g14-g9B载体；

(18)pEG302-β终载体的构建：

①单酶切pEG302载体；质粒1ug，KpnI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②以SK-g1+g14-g9B载体为模板，扩增包含三靶点的片段：5×Fast Pfu buffer10uL，dNTP4uL，引物F/R 1uL，质粒1uL，FastPfu酶1uL，ddH2O补足至50uL体系；PCR仪控温，95℃1min，(95℃20sec，55℃20sec，72℃90sec，35×cycle)，72℃5min，4℃5min；割胶回收DNA；

所需引物：其序列如SEQ ID:No.17-18所示；

pEG302-if-SK-F2：ACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGAATTGGGTGCTAGC

pEG302-if-SK-R：GTCGTGCTCCACCATGGTACCCTGGAGCTCACTAGT

③Infusion法连接：第一步线性化载体60ng，SK-g1+g14-g9β基因片段90ng，5×CEIIbuffer 4uL，Exnase 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用卡那霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认是否连入pEG302载体；

鉴定引物：

F：g1-A：ATTGGTAAAATAATTGGGACACCAA；

R：g9B-B：AAACGTAATATTAGAACGGTGGCG；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到三靶点的pEG302-β终载体；

M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG

M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

(19)终载体农杆菌转化：农杆菌LBA4404菌株50uL，质粒5uL，电击转化；28℃孵育90min；Kan+Rif抗性涂板，挑选单克隆做菌落PCR鉴定；-80℃保存菌株。

本发明基于CRISPR/Cas9 Sun Tag系统表达DRM2基因构建的可以靶标TYLCCNV与TYLCCNB的侵染载体具有显著高效的抗病毒的功能。该系统基于的抗病毒原理并非常用的直接切割病毒序列，而是建立在定向甲基化病毒的基础上，更安全，不存在病毒逃逸编辑的潜在风险，具有重要的生产应用价值。

本发明构建出的重组载体pEG302-A、pEG302-β具有以下特征和优势：

(1)该载体构建了包括三个靶点的gRNA，降低了脱靶的可能，并且仍然保持了甲基化的功能。

(2)由于搭载的是dCas9蛋白，不会对病毒序列进行编辑，不会存在由于对病毒DNA的切割而造成的潜在的病毒逃脱编辑从而突变的风险。

(3)该载体针对的是病毒本身而非寄主植物，不会对寄主植物的农艺性状产生影响，更加利于投入实际田间生产中。

(4)该载体是以甲基化病毒特定区域达到抗双生病毒的效果，属于表观遗传修饰的范畴，在后代性状遗传上具有先天的优势，实际操作上更加灵活。

(5)甲基化效果是可逆的动态的，原则上可以人为的控制甲基化水平，可针对不同双生病毒灵活改变甲基化水平。

(6)此套系统应用范围广，在所有TYLCCNV/TYLCCNB寄主植物上均可应用。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述基于CRISPR/Cas9 SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体及其构建和应用作进一步说明。

图1为基于CRISPR/Cas9 Sun Tag系统表达DRM2基因抑制双生病毒侵染载体pEG30222aa Sun Tag DRMcd-A，pEG302 22aa Sun Tag DRMcd-A载体构建示意图；

图2为pEG302-A重组载体构建流程图；

图3为pEG302-β重组载体构建流程图；

图4中，(A)不含质粒(MOCK)，或者含有pEG302-A，pEG302-β或pEG302的农杆菌混合TYLCCNV/TYLCCNB侵染性克隆农杆菌浸润本氏烟植物7天后(7dpi)的症状图。

(B)以TYLCCNV编码的CP蛋白为参考，qPCR检测(A)图中TYLCCNV的积累水平。

(C)以TYLCCNB编码的βC1蛋白为参考，qPCR检测(A)图中TYLCCNB的积累水平。

如图1-3所示，一种基于CRISPR/Cas9 Sun Tag系统表达DRM2基因靶标中国番茄黄化曲叶病毒抑制病毒侵染载体pEG302-A，pEG302-β的构建方法，具体包括以下步骤：

(1)在TYLCCNV序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括pEG302-A载体所需的三个靶点所需的六条gRNA链：g16-A/B，g17-A/B，g9A-A/B；其序列如SEQ ID：No.1-6所示；

g16-A:ATTGTCTGGTGACGCGGACAGTGG

g16-B:AAACCCACTGTCCGCGTCACCAGA

g17-A:ATTGGCACTTTAAAGAATTCATGG

g17-B:AAACCCATGAATTCTTTAAAGTGC

g9A-A:ATTGGGCCATCCGTATAATATTAC

g9A-B:AAACGTAATATTATACGGATGGCC

(2)将(1)中所述单链gRNA合成为双链，具体方法如下：

①先将上述单链gRNA稀释为50uM/uL；

②按照5×Oligo Buffer：4uL；单链A：4uL；单链B：4uL；H2O：8uL做成20uL体系；

③PCR仪器控温：95℃2min；以0.1℃/S下降到25℃；4℃5min降温；

④得到的片段稀释50倍，保存于-20℃；

(3)包含g16单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g16载体的构建：基础载体来自中国科学院谢旗研究员课题组惠赠的AtU6-26-sgRNA-SK；

①1ug AtU6-26-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存。

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；

R：g16-B：AAACCCACTGTCCGCGTCACCAGA；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到包含g16单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g16(下文简称SK-U6-26-g16)载体；

(3)包含g17单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g17载体的构建：

①1ug AtU6-26-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存。

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；

R：g17-B：AAACCCATGAATTCTTTAAAGTGC；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到包含g17单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g17(下文简称SK-U6-26-g17)载体；

(4)包含g16，g17的双靶点AtU6-26-sgRNA-SK-g16+g17载体的构建：

①单酶切SK-U6-26-g16；质粒1ug，SpeI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②双酶切SK-U6-26-g17；质粒1ug，SpeI 1uL，NheI 1uL，10×buffer 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收小片段，约500bp；

③10×T4DNA ligase buffer 2uL，单酶切后的SK-U6-26-g16线性化载体50ng，双酶切后的SK-U6-26-g17DNA小片段10ng，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认双靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：g16-A：ATTGTCTGGTGACGCGGACAGTGG；

R：g17-B：AAACCCATGAATTCTTTAAAGTGC；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到双靶点的SK-U6-26-g16+g17载体；

(5)AtU6-1-sgRNA-SK载体的构建：因为载体中靶点数如果过多，可以用AtU6其他成员来表达gRNA，防止发生同源重组。AtU6-26-sgRNA-SK载体换启动子，将AtU6-26换为AtU6-1；

①AtU6-1启动子的克隆：

所需引物：

if-SK-U6-1-F：AGGGCGAATTGGGTGCTAGCGAAATCTCAAAATTCCGG

if-SK-U6-1-R：CTAAAACTGAGACCTGAATTCAGGTCTCTCAATCACTACTTCGT

5×Fast Pfu buffer 10uL，dNTP 4uL，引物F/R 1uL，拟南芥cDNA1uL，FastPfu酶1uL，ddH2O补足至50uL体系；PCR仪控温，95℃1min，(95℃20sec，55℃20sec，72℃90sec，35×cycle)，72℃5min，4℃5min；纯化回收DNA；

②双酶切AtU6-26-sgRNA-SK载体，质粒1ug，EcoRI 1uL，NheI 1uL，10×buffer2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收大片段；

③Infusion法换启动子：第二步线性化载体60ng，AtU6-1基因90ng，5×CEIIbuffer 4uL，Exnase 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认启动子是否更换成功；

鉴定引物:

F：if-SK-U6-1-F：AGGGCGAATTGGGTGCTAGCGAAATCTCAAAATTCCGG

R：if-SK-U6-1-R：CTAAAACTGAGACCTGAATTCAGGTCTCTCAATCACTACTTCGT

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用上述引物测序，至此得到更换启动子后的AtU6-1-sgRNA-SK载体；

(6)包含g9A单靶点的AtU6-1-sgRNA-SK-g9A载体的构建。

①1ug AtU6-1-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存。

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-1-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；

R：g9A-B：AAACGTAATATTATACGGATGGCC；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到单靶点的AtU6-1-sgRNA-SK-g9A(下文简称SK-U6-1-g9A)载体；

(7)三靶点的SK-g16+g17+g9A载体的构建：

①单酶切SK-U6-26-g16+17；质粒1ug，SpeI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②双酶切SK-U6-1-g9A；质粒1ug，SpeI 1uL，NheI 1uL，10×buffer 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收小片段；

③10×T4DNA ligase buffer 2uL，单酶切后的SK-U6-26-g16+g17线性化载体50ng，双酶切后的SK-U6-1-g9A的DNA 10ng，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认双靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：g16-A：ATTGTCTGGTGACGCGGACAGTGG；

R：g9A-B：AAACGTAATATTATACGGATGGCC；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到三靶点的SK-g16+g17-g9A载体；

(8)pEG302-A终载体的构建：

①单酶切pEG302载体；质粒1ug，KpnI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②以SK-g16+g17-g9A载体为模板，扩增包含三靶点的片段：5×Fast Pfu buffer10uL，dNTP 4uL，引物F/R 1uL，质粒1uL，FastPfu酶1uL，ddH2O补足至50uL体系；PCR仪控温，95℃1min，(95℃20sec，55℃20sec，72℃90sec，35×cycle)，72℃5min，4℃5min；割胶回收DNA；

所需引物：

pEG302-if-SK-F2：ACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGAATTGGGTGCTAGC

pEG302-if-SK-R：GTCGTGCTCCACCATGGTACCCTGGAGCTCACTAGT

③Infusion法连接：第一步线性化载体60ng，SK-g16+g17-g9A基因片段90ng，5×CEII buffer 4uL，Exnase 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用卡那霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认是否连入pEG302载体；

鉴定引物:

F：g16-A：ATTGTCTGGTGACGCGGACAGTGG；

R：g9A-B：AAACGTAATATTATACGGATGGCC；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到三靶点的pEG302-A终载体；

M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG

M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

(9)终载体农杆菌转化：农杆菌LBA4404菌株50uL，质粒5uL，电击转化；28℃孵育90min；Kan+Rif抗性涂板，挑选单克隆做菌落PCR鉴定；-80℃保存菌株；

(10)在TYLCCNB编码的βC1序列中选定PAM位点并设计gRNA；包括pEG302-β载体所需的三个靶点所需的六条gRNA链：g1-A/B，g14-A/B，g9B-A/B；

g1-A:ATTGGTAAAATAATTGGGACACCAA

g1-B:AAACTTGGTGTCCCAATTATTTAC

g14-A:ATTGATAGTCATGTTTATTTGTTG

g14-B:AAACCAACAAATAAACATGACTAT

g9B-A:ATTGCGCCACCGTTCTAATATTAC

g9B-B:AAACGTAATATTAGAACGGTGGCG

(11)将上述单链gRNA合成为双链，具体方法如下：

①先将上述单链gRNA稀释为50uM/uL；

②按照5×Oligo Buffer：4uL；单链A：4uL；单链B：4uL；H2O：8uL做成20uL体系(产生的双链两端有突起，不用酶切即可连接)；

③PCR仪器控温：95℃2min；以0.1℃/S下降到25℃；4℃5min降温；

④得到的片段稀释50倍，保存于-20℃；

(12)包含g1单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g1载体的构建：

①1ug AtU6-26-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；

R：g1-B：AAACTTGGTGTCCCAATTATTTAC；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到包含g1单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g1(下文简称SK-U6-26-g1)载体；

(13)包含g14单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g14载体的构建：

①1ug AtU6-26-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存；

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-26-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；

R：g14-B：AAACCAACAAATAAACATGACTAT；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到包含g14单靶点的AtU6-26-sgRNA-SK-g14(下文简称SK-U6-26-g14)载体；

(14)包含g1，g14的双靶点AtU6-26-sgRNA-SK-g1+g14载体的构建：

①单酶切SK-U6-26-g1；质粒1ug，SpeI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②双酶切SK-U6-26-g14；质粒1ug，SpeI 1uL，NheI 1uL，10×buffer 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收小片段，约500bp；

③10×T4DNA ligase buffer 2uL，单酶切后的SK-U6-26-g1线性化载体50ng，双酶切后的SK-U6-26-g14DNA小片段10ng，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认双靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：g1-A：ATTGGTAAAATAATTGGGACACCAA；

R：g14-B：AAACCAACAAATAAACATGACTAT；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到双靶点的SK-U6-26-g1+g14载体；

(15)包含g9B单靶点的AtU6-1-sgRNA-SK-g9B载体的构建。

①1ug AtU6-1-sgRNA-SK质粒，Bsa I-HF 1uL，10×cutsmart buffer 5uL；剩余体系用ddH2O补足；37℃酶切60min，然后纯化DNA，-20℃冷冻保存。

②10×T4DNA ligase buffer 2uL，酶切后的AtU6-1-sgRNA-SK载体80ng，双链化gRNA1uL，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

③将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG；

R：g9B-B：AAACGTAATATTAGAACGGTGGCG；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到单靶点的AtU6-1-sgRNA-SK-g9B(下文简称SK-U6-1-g9B)载体；

(16)三靶点的SK-g1+g14+g9B载体的构建：

①单酶切SK-U6-26-g1+14；质粒1ug，SpeI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②双酶切SK-U6-1-g9B；质粒1ug，SpeI 1uL，NheI 1uL，10×buffer 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；割胶回收小片段；

③10×T4DNA ligase buffer 2uL，单酶切后的SK-U6-26-g1+14线性化载体50ng，双酶切后的SK-U6-1-g9B的DNA 10ng，T4DNA ligase 1uL，ddH2O定容至20uL；PCR仪控温22℃反应15min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认双靶点是否连入载体；

鉴定引物:

F：g1-A：ATTGGTAAAATAATTGGGACACCAA；

R：g9B-B：AAACGTAATATTAGAACGGTGGCG；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到三靶点的SK-g1+g14-g9B载体；

(17)pEG302-β终载体的构建：

①单酶切pEG302载体；质粒1ug，KpnI 1uL，10×buffer 2uL，Fast AP 1uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；DNA纯化回收；

②以SK-g1+g14-g9β载体为模板，扩增包含三靶点的片段：5×Fast Pfu buffer10uL，dNTP4uL，引物F/R 1uL，质粒1uL，FastPfu酶1uL，ddH2O补足至50uL体系；PCR仪控温，95℃1min，(95℃20sec，55℃20sec，72℃90sec，35×cycle)，72℃5min，4℃5min；割胶回收DNA；

所需引物：

pEG302-if-SK-F2：ACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGAATTGGGTGCTAGC

pEG302-if-SK-R：GTCGTGCTCCACCATGGTACCCTGGAGCTCACTAGT

③Infusion法连接：第一步线性化载体60ng，SK-g1+g14-g9β基因片段90ng，5×CEIIbuffer 4uL，Exnase 2uL，ddH2O补足至20uL体系；37℃30min；

④将10uL连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，使用氨苄青霉素作为抗性筛选，挑选单克隆做菌落PCR鉴定并测序，确认是否连入pEG302载体；

鉴定引物:

F：g1-A：ATTGGTAAAATAATTGGGACACCAA；

R：g9B-B：AAACGTAATATTAGAACGGTGGCG；

将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，并用M13F/R引物测序，至此得到三靶点的pEG302-β终载体；

M13F：GTTGTAAAACGACGGCCAG

M13R：CAGGAAACAGCTATGAC

(18)终载体农杆菌转化：农杆菌LBA4404菌株50uL，质粒5uL，电击转化；28℃孵育90min；Kan+Rif抗性涂板，挑选单克隆做菌落PCR鉴定；-80℃保存菌株；

(19)活化农杆菌，将含有pEG302-A，pEG302-β，pEG302载体三者侵染性克隆农杆菌并分别混合TYLCCNV/TYLCCNB侵染性克隆农杆菌在野生型本氏烟上进行接种，接种缓冲液的作为对照(Mock)，观察植物症状表型的差异，如图4所示，确定构建的pEG302-A，pEG302-β载体具有抗中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)的效果；

检测pEG302-A载体的抗病毒效果：提取混合接种pEG302-A和TYLCCNV/TYLCCNB的本氏烟植株系统叶的DNA，通过qPCR分析病毒CP蛋白积累量变化，如图4B所示，确定病毒TYLCCNV积累量相较于对照组显著下降；表明过表达DRM2(pEG302)或过表达DRM2同时靶标TYLCCNV的基因组(pEG302-A)能够有效抑制TYLCCNV的积累水平；

检测pEG302-β载体的抗病毒效果：提取混合接种pEG302-β和TYLCCNV/TYLCCNB的本氏烟植株系统叶的DNA，通过qPCR分析病毒βC1蛋白积累量变化，如图4C所示，确定病毒TYLCCNB积累量相较于对照组显著下降；表明过表达DRM2(pEG302)或过表达DRM2同时靶标TYLCCNB的基因组(pEG302-B)能够有效抑制TYLCCNB的积累水平。

以上结果均表明过表达DRM2能够有效抑制TYLCCN/TYLCCNB的侵染和病毒积累的水平，而过表达DRM2同时靶标TYLCCNV的基因组(pEG302-A)或者TYLCCNB的基因组(pEG302-B)相对过表达DRM2能够更加有效抑制TYLCCN/TYLCCNB的侵染和病毒积累的水平，说明该CRISPR/Cas9 Sun Tag系统能够有效抑制双生病毒的侵染。

确定本发明涉及到的pEG302-A，pEG302-β的抗中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV/TYLCCNB)的效果，通过组培技术得到包含此套载体系统的本氏烟、番茄并可以同时应用于其他寄主植物。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 基于CRISPR/Cas9 SunTag系统抑制双生病毒侵染的载体及其构建和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> g16-A(Artificial Sequence)

<400> 1

attgtctggt gacgcggaca gtgg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> g16-B(Artificial Sequence)

<400> 2

aaacccactg tccgcgtcac caga 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> g17-A(Artificial Sequence)

<400> 3

attggcactt taaagaattc atgg 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> g17-B(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacccatga attctttaaa gtgc 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> g9A-A(Artificial Sequence)

<400> 5

attgggccat ccgtataata ttac 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> g9A-B(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacgtaata ttatacggat ggcc 24

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> g1-A(Artificial Sequence)

<400> 7

attggtaaaa taattgggac accaa 25

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> g1-B(Artificial Sequence)

<400> 8

aaacttggtg tcccaattat ttac 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> g14-A(Artificial Sequence)

<400> 9

attgatagtc atgtttattt gttg 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> g14-B(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaccaacaa ataaacatga ctat 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> g9B-A(Artificial Sequence)

<400> 11

attgcgccac cgttctaata ttac 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> g9B-B(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacgtaata ttagaacggt ggcg 24

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> M13F(Artificial Sequence)

<400> 13

gttgtaaaac gacggccag 19

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> M13R(Artificial Sequence)

<400> 14

caggaaacag ctatgac 17

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> if-SK-U6-1-F(Artificial Sequence)

<400> 15

agggcgaatt gggtgctagc gaaatctcaa aattccgg 38

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> if-SK-U6-1-R(Artificial Sequence)

<400> 16

ctaaaactga gacctgaatt caggtctctc aatcactact tcgt 44

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> pEG302-if-SK-F2(Artificial Sequence)

<400> 17

actaggataa attatcgcgc gcggaattgg gtgctagc 38

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> pEG302-if-SK-R(Artificial Sequence)

<400> 18

gtcgtgctcc accatggtac cctggagctc actagt 36