一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法

本发明涉及微生物技术领域，具体为一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法。

我国是农业大国，粮食产量和农业副产品产量位居世界前列，但对农业废弃物处理还有待进一步发展。我国每年有大量未被利用的作物秸秆，不但是生物质能源的浪费，还会对环境造成压力。基于厌氧发酵技术，能够将秸秆等农业废弃物转化为沼气和中链脂肪酸等产品。转化上述产品的过程中，乳酸和乙酸都是重要的前体物质。沼气生成过程中，乳酸相较于乙酸难降解、转化效率低，增加发酵过程中乙酸含量，能够缩短产气进程，提高产气效率。对于中链脂肪酸的生产过程，乳酸和乙酸是碳链延长过程中的重要的电子供体和电子受体，提高体系中的乙酸含量能够在不添加外源电子受体的情况下实现中链脂肪酸的生产。因此，调控水解酸化体系高效协同产酸对于提高中链脂肪酸和沼气产量都具有重要意义。但是，目前依靠微生物技术协同产乳酸和乙酸，特别是提高乙酸含量的技术匮乏。

目前专注于提高单一乳酸含量的研究较多。张文娟在短期分批发酵模式下，通过调控不同参数，在最优发酵温度35℃、pH9条件下，得到最高乳酸产率0.67 g COD/g TCOD。现有的提高体系中乙酸含量的研究大多集中于青贮秸秆。何慧英将协同产乳酸、乙酸效果较好的菌株Lb. farciminis 1101和Lb. brevis 0991应用于玉米秸秆发酵，发酵液中乳酸含量分别为>150mM、0.203mol/L，乙酸含量均为38mM。但是，对于从菌构建角度构建协同产酸菌的技术研究的关注程度有限。

单一菌种添加到水解酸化体系中会出现产酸效率低，酶组分不全的问题。利用多菌种之间互利共营、功能互补的协同作用，提高发酵酶的产率且酶系比例协调，能够提升体系产酸效率。但是无论是单菌种组配的菌系还是从酸性体系中筛选出的菌等，其筛选及培养环境均依赖无菌环境，即在无菌环境中传代稳定，只要体系灭菌，就有较高的产酸效率。但在实际应用过程中，灭菌条件培养的菌恰恰限制了实际应用中使用秸秆、牛粪原料，产酸强化效果不明显，相关研究已被证实在连续迭代的过程中，无菌环境筛选的产酸菌很容易被外界复杂环境土著菌所替代，导致添加的强化菌无法成为体系的优势菌。在全程未灭菌条件中构建成功的菌系具有的抗逆性要远高于灭菌培养条件下的菌系，由于其复杂的生长繁殖环境，在将菌接种到水解酸化体系中后，能够很快适应环境，菌系存活率、繁殖效果远好于灭菌培养条件构件的菌。营造适当的无菌环境进行筛选目标菌，也是本专利解决的重点问题之一。

目前的方法仅限于自然条件筛选或高效产酸菌间的组配，但对于自然条件筛选来说，菌源单一、培养环境简单，对于高效产酸菌的组配来说，具有乙酸和乳酸功能的菌在一起组配的几乎没有报道，而且协同产乳酸、乙酸菌的组配未见报道。本专利思路为在全程不灭菌的基础上，多菌源、多轮次、多组合、注重乙酸乳酸协同、多种培养环境的长期筛选组配，在发酵环境进一步巩固驯化，最终得到产乙酸、乳酸协同性高、产量高、稳定性高的菌，适合处理含纤维类物料，菌兼备高效分解木质纤维素的能力。

基于上述分析说明，本专利创新性提出多原料协同、多措并举、精筛融合的正向和反向菌构建手段，以廉价易得菌源在未灭菌条件下凭借自然选择和功能诱导限制性迭代培养构建协同产酸菌和在未灭菌条件下以已知高产菌种复配构建协同产酸菌的方法，进而提升秸秆厌氧发酵体系协同高效产乳酸和乙酸能力，并增强后续应用的效果和稳定性。

本发明意在提供一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法，采用正向构建和反向构建两种技术路线，正向构建通过限制性迭代培养的到高效产酸复合菌系，反向构建是将高产菌株进行组配得到组配菌系，然后将其组配得到菌，以解决微生物协同产酸技术的缺乏。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法，包括以下步骤：

S1、正向构建菌：

S1.1选择深度为5、25、45、65、85cm且有机质含量达到40×10-3的酸性土壤或常温下微好氧发酵24h~72h后有明显酸味的东北泡菜或品质优良的黄贮秸秆中任一一种含有乳酸菌的丰富菌作为原菌源，在未灭菌条件下将原菌源在30℃~37℃接种至改良的选择性培养基中进行恒温静置培养；

S1.2以体积分数比为10%~20%的接种比进行接种，传代培养10~30代，初始培养菌生长速度较慢，第1-4代培养时间为72h；自第5代开始，菌适应培养基环境且处于活跃状态，第5~30代的培养时间为36h；筛选出pH在10代以内迅速下降到4.5及以下的、处于对数期生长的菌即培养基混浊未分层、菌组成稳定的三种复合菌系：①单产乳酸产量大于等于5g/L且乳酸占总挥发酸30%及以上的复杂菌系Z1、②单产乙酸产量大于等于1.5g/L且乙酸占总挥发酸35%及以上的复杂菌系Z2、③乳酸和乙酸协同生产总产量大于等于6.5g/L且乳酸和乙酸占总挥发酸的50%及以上复杂菌系Z3；连续5代以上满足限定条件的即为驯化培养成功；

S1.3取S1.2筛选出的复杂菌系离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S2、反向构建菌：

S2.1将同型产乳酸菌：德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜酸乳杆菌，异型产乳酸菌：短乳杆菌、布氏乳杆菌分别接种在优化的MRS培养基上进行活化培养24h~72h，活化培养好的复合菌系命名为F1、F2、F3、F4；

其中，所述德氏乳杆菌保加利亚亚种来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 05468；所述嗜酸乳杆菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC 19887；所述短乳杆菌来自中国农业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为ACCC05488，所述布氏乳杆菌来自中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC 1.15607；

S2.2取S2.1活化培养后的复合菌液离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S3、菌的组配：

S3.1不同目标产物下的组配：

S3.1.1以乳酸为目标产物的组配，选取S1.2中的Z1与S2.1中的F1或F2进行组配：Z1+F1、Z1+F2；

S3.1.2以乙酸为目标产物的组配，选取S1.2中的Z2与S2.1中的F3或F4进行组配：Z2+F3、Z2+F4；

S3.1.3以乳酸、乙酸为目标产物的组配：

选取S1.2中的Z1、Z2和Z3与S2.1中的F1、F2、F3和F4中的两种进行组配：Z1+Z2、Z1+Z3、Z1+F3、Z1+ F4、Z2+Z3、Z2+ F3、Z2+ F4、Z3+ F1、Z3+ F2、Z3+ F3、Z3+ F4、F1+F3、F1+F4、F2+F3、F2+F4、F3+F4；

选取S1.2中的Z1、Z2和Z3与S2.1中的F1、F2、F3和F4中的三种进行组配：Z1+Z2+Z3、Z2+ F1+ F2、Z2+ F1+ F3、Z2+ F1+ F4、Z3+ F1+ F2、Z3+ F1+ F3、 Z3+ F3+ F4；

选取S1.2中的Z1、Z2和Z3与S2.1中的F1、F2、F3和F4中的四种进行组配：Z1+Z2+Z3+F1、Z1+Z2+Z3+F2、Z1+Z2+Z3+F3、Z1+Z2+Z3+F4；

S3.2将S3.1组配的菌系之间以体积比为1:5~5:1的比例进行组配；

S3.3将S3.2组配的菌系加入含固率为8%的秸秆水解酸化体系中厌氧发酵15d~20d，筛选出自然条件下适应复杂应用环境能力强且为体系中优势菌，检测菌系的产酸潜力，产乳酸产量大于等于6g/L、单产乙酸产量大于等于2g/L、乳酸、乙酸协同生产总产量大于等于8g/L的菌为组配成功的高效产酸复合菌系；

S3.4将S3.3中组配成功的高效产酸复合菌系再次统一浓度1010cfu/mL进行以体积比为1:5~5:1进行组配，加入含固率为8%的秸秆水解酸化体系中进行15~20d培养后，得到所需高效产酸菌系。

进一步地，在S1.1中，所述改良的选择性培养基组成的成分为：胰蛋白胨10 g、酵母粉 5g、葡萄糖 20g 、柠檬酸二铵 2 g、吐温80 1.0ml、氯化钠 25g、磷酸二氢钾 6g、7-水硫酸镁 0.58 g、7-水硫酸铁 0.03g、4-水硫酸锰 0.15g、蒸馏水1000ml。配置好的培养基pH为5.3，采用0.5mol/L的氢氧化钠将培养基pH调节为7.0，显著体现复合菌系产酸对体系pH值的影响。

进一步地，在S2.1中，所述优化的MRS培养基组成的成分为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、葡萄糖2g、吐温80 1.0ml、磷酸氢二钾2g、氯化钠5g

技术方案的有益效果是：

1、本发明通过限制性培养手段以酸性土壤、泡菜为菌源在未灭菌自然筛选得到的5株连续稳定的能够高效产乳酸、高产乙酸、协同高产乳酸和乙酸的复合菌系；

2、本发明将自然限制性手段筛选的菌株与组配的菌株相结合，通过外淘汰的方法构建高产乳酸、乙酸的微生物菌，得到的菌适应能力强、生长范围宽、产酸效率高；

3、在构建全过程未灭菌条件下培养得到的菌，在复杂的水解酸化体系迭代，能够减少被复杂环境中菌所替代的风险、提升其成为优势菌的潜力。菌抗逆性、适应性、稳定性远高于在灭菌条件下纯培养所得菌。

4、本发明将单菌、多菌和复杂菌之间进行交叉组配，解决了有单一菌种产酸效率低、生长范围窄的问题，保证了乳酸、乙酸协同生产的效率。

5.本发明在不影响培养基培育能力的前提下，改良传统选择性培养基、优化的MRS培养基组分，将乙酸钠更换为氯化钠，减少对体系乙酸产酸潜力测定的影响。

图1为本发明一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法的流程图。

下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明：

实施例1

如图1所示，一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法，包括以下步骤：

S1、正向构建菌：

S1.1取发酵效果优良的黄贮秸秆为菌源，于37℃下在未灭菌的改良的选择性培养基中恒温静置培养72h；

S1.2以10%的体积分数比为接种比进行接种传代培养25代，筛选出pH在25代内迅速下降到4.3、通过16s rRNA分析菌结构在20~25代稳定的、乳酸产量为6.3 g/L、乙酸产量为2.6 g/L、乳酸和乙酸占总挥发酸含量的57%的复杂菌系Z3；

S1.3取S1.2筛选出的复杂菌系Z3离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S2、正向构建菌：

S2.1取深度为5cm、有机质含量为41.6×10-3的酸性土壤为菌源，将其于30℃在未灭菌的改良的选择性培养基中恒温静置培养48h；

S2.2以10%的体积分数比为接种比进行接种传代培养25代，筛选出pH在25代内迅速下降到4.3、通过16s rRNA分析菌结构在20~25代稳定的、乙酸产量为3.1 g/L复杂菌系Z2；

S2.3取S2.2筛选出的复杂菌系Z2离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S3、菌的组配：

S3.1将S1得到的菌系Z3和S2得到的菌系Z2以3:2的比例进行组配；

S3.2将S3.1中组配的菌系加入含固率为8%的秸秆水解酸化体系中厌氧发酵15d，筛选出自然条件下适应复杂应用环境能力强且为体系中优势菌，检测组配菌系的产酸潜力，得到乳酸产量为7.6 g/L、乙酸产量为3.5 g/L的高效产酸复合菌系L1；

S3.3将S3.2中组配成功的高效产酸复合菌系L1离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL，为进一步组配更为高产复合菌系做准备。

实施例2

一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法，包括以下步骤：

S1、正向构建菌：

S1.1取微好氧发酵36h后有明显酸味的东北泡菜为菌源，30℃下在未灭菌的改良的选择性培养基中恒温静置培养72h；

S1.2以10%的体积分数比为接种比进行接种传代培养25代，筛选出pH在25代内迅速下降到4.5、通过16s rRNA分析菌结构在20~25代稳定的、乳酸产量为5.5g/L、乳酸占总挥发酸含量的38%的复杂菌系Z1。

S1.3取S1.2筛选出的复杂菌系Z1离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S2、正向构建菌：

S2.1取深度为5cm、有机质含量为41.6×10-3的酸性土壤为菌源，将其于30℃在未灭菌的改良的选择性培养基中恒温静置培养48h；

S2.2以10%的体积分数比为接种比进行接种传代培养25代，筛选出pH在25代内迅速下降到4.3、通过16s rRNA分析菌结构在20~25代稳定的、乙酸产量为3.1 g/L复杂菌系Z2；

S2.3取S2.2筛选出的复杂菌系Z2离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S3、菌的组配：

S3.1将S1得到的菌系Z1和S2得到的菌系Z2以1:4的比例进行组配；

S3.2将S3.1中组配的菌系加入含固率为8%的秸秆水解酸化体系中厌氧发酵15d，筛选出自然条件下适应复杂应用环境能力强且为体系中优势菌，检测组配菌系的产酸潜力，得到乳酸产量为6.7g/L、乙酸产量为3.8 g/L的高效产酸复合菌系L2；

S3.3将S3.2中组配成功的高效产酸复合菌系L2离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL，为进一步组配更为高产复合菌系做准备。

实施例3

一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法，包括以下步骤：

S1、反向构建菌：

S1.1将异型产乳酸菌短乳杆菌接种在未灭菌的MRS培养基上进行活化培养24h，得到乳酸产量5.8 g/L、乙酸产量为1.7 g/L的复合菌系F3；

S1.2取S1.1活化好的复合菌液F3离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S2、反向构建菌：

S2.1将异型产乳酸菌布氏乳杆菌接种在未灭菌的MRS培养基上进行活化培养24h，得到乙酸产量为2.6 g/L的复合菌系F4；

S2.2取S2.1活化好的复合菌液F4离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S3、菌的组配：

S3.1将S1得到的菌系F3和F4得到的菌系F2以1:1的比例进行组配；

S3.2将S3.1中组配的菌系加入含固率为8%的秸秆水解酸化体系中厌氧发酵15d，筛选出自然条件下适应复杂应用环境能力强且为体系中优势菌，检测组配菌系的产酸潜力，乳酸产量6.2 g/L、乙酸总产量为2.9 g/L的高效产酸复合菌系L3；

S3.3将S3.2中组配成功的高效产酸复合菌系L3离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL，为进一步组配更为高产复合菌系做准备。

实施例4

一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法，包括以下步骤：

S1、反向构建菌：

S1.1将同型产乳酸菌德氏乳杆菌保加利亚菌种接种在未灭菌的MRS培养基上进行活化培养24h，得到乳酸产量为6.0 g/L的复合菌系F1；

S1.2取S1.1活化好的复合菌液F1离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S2、反向构建菌：

S2.1将异型产乳酸菌布氏乳杆菌接种在未灭菌的MRS培养基上进行活化培养24h，得到乙酸产量为2.6 g/L的复合菌系F4；

S2.2取S2.1活化好的复合菌液F4离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S3、菌的组配：

S3.1将S1得到的菌系F1和F4得到的菌系F2以1:1的比例进行组配；

S3.2将S3.1中组配的菌系加入含固率为8%的秸秆水解酸化体系中厌氧发酵15d，筛选出自然条件下适应复杂应用环境能力强且为体系中优势菌，检测组配菌系的产酸潜力，乳酸产量7.2 g/L、乙酸产量为3.4 g/L的高效产酸复合菌系L4；

S3.3将S3.2中组配成功的高效产酸复合菌系L4离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL，为进一步组配更为高产复合菌系做准备。

实施例5

一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法，包括以下步骤：

将以上能够适应复杂水解酸化体系驯化成功的菌进行进一步组配，培养出产酸潜力更好的复合菌系。

1.取统一浓度1010cfu/mL的实施例1中构建的复合菌系L1和实施例2中的组配菌系L2，以体积比3:1进行组配；

2.将组配的菌系加入含固率为8%的秸秆水解酸化体系中厌氧发酵15d，筛选出自然条件下适应复杂应用环境能力强且为体系中优势菌，检测组配菌系的产酸潜力，得到乳酸产量8.3g/L、乙酸产量为3.9 g/L的复合菌系L5。

实施例6

一种未灭菌条件构建产乳酸-乙酸微生物菌方法，包括以下步骤：

本实施例为实施例1的对比试验，试验过程中除菌源外所有所涉及培养基等均在高温蒸汽锅121摄氏度灭菌15分钟进行无菌处理，操作过程均在提前紫外灭菌30分钟以上的超净工作台进行。

S1、正向构建菌：

S1.1取发酵效果优良的黄贮秸秆为菌源，于37℃下在灭菌的改良的选择性培养基中恒温静置培养72h；

S1.2以10%的体积分数比为接种比进行接种传代培养25代，筛选出pH在25代内迅速下降到4.3、通过16s rRNA分析菌结构在20~25代稳定的、乳酸产量为5.6 g/L、乙酸产量为1.8 g/L、乳酸和乙酸占总挥发酸含量的45%的复杂菌系Z3'；

S1.3取S1.2筛选出的复杂菌系Z3离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S2、正向构建菌：

S2.1取深度为5cm、有机质含量为41.6×10-3的酸性土壤为菌源，将其于30℃下在灭菌的SL培养基中恒温静置培养48h；

S2.2以10%的体积分数比为接种比进行接种传代培养25代，筛选出pH在25代内迅速下降到4.3、通过16s rRNA分析菌结构在20~25代稳定的、乙酸产量为1.9 g/L复杂菌系Z2'；

S2.3取S2.2筛选出的复杂菌系Z2离心去掉上清液，用生理盐水重悬将菌液浓度统一调为1010 cfu/mL；

S3、菌的组配：

S3.1将S1得到的菌系Z3'和S2得到的菌系Z2'以3:2的比例进行组配；

S3.2将S3.1中组配的菌系加入含固率为8%的秸秆水解酸化体系中厌氧发酵15d，筛选出自然条件下适应复杂应用环境能力强且为体系中优势菌，检测组配菌系的产酸潜力，得到乳酸产量为6.2 g/L、乙酸产量为2.2 g/L的高效产酸复合菌系L6；通过与实施例相比较，本实施例在灭菌条件下所得经复杂水解酸化体系培养后的菌系产酸效果不及未灭菌所得菌系。

在上述实施例中，改良的选择性培养基组成的成分均为：胰蛋白胨10 g、酵母粉5g、葡萄糖 20g 、柠檬酸二铵 2 g、吐温80 1.0ml、氯化钠 25g、磷酸二氢钾 6g、7-水硫酸镁 0.58 g、7-水硫酸铁 0.03g、4-水硫酸锰 0.15g、蒸馏水1000ml；

MRS培养基组成的成分均为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、葡萄糖2g、吐温801.0ml、磷酸氢二钾2g、氯化钠5g、柠檬酸三铵2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、蒸馏水1000ml。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。