中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法

中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法

所属技术领域：

本发明涉及药用真菌的菌种分离培养技术领域，具体涉及中国野生桑黄蘑 菇菌株分离培养方法。

背景技术：

桑黄(Phellinus)属担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲 (Hymenomycetes)，非褶菌目(Aphyllophorales)，锈革孔菌科 (Hymenochaeyaceae)，针层孔菌属(Phellinus)，生长于杨、桑、柳、白桦、 榉、桃等阔叶树的枯立木、立木及树干上，是火木层孔菌(P.igniarius)，鲍 氏针层孔菌(P.baumii)，裂蹄针层孔菌(P.linteus)的俗称。桑黄初期像 块黄土，经过一段时间的生长，样子像树桩上伸出的舌头。子实体多年生，侧 生无柄，硬木质、蹄形、扁半球形或不规则形，盖面浅肝褐至灰褐或黑， 初时有细绒毛，老后常有明显的纵横龟裂，有同心环棱，边缘钝，有黄翻边， 菌肉蛋黄或浅咖啡，木质，菌管多层，层次不明显。桑黄因其寄生树种不 同，其形状、颜、及含有的成分亦不同。目前，市场上销售的桑黄有桑树桑 黄、松树桑黄、杨树桑黄、白桦桑黄等，其中桑树桑黄为极品，价格最高。

桑黄是一种珍贵的药用真菌，有“森林黄金”之美称。《中药大辞典》记载， 子实体入药，可治血崩、血淋、带下、闭经等妇科疾病，其抗菌、抗癌、抗纤 维化、抗氧化等效果也很显著，因而成为国际研究领域的研究热点，特别是日 本和韩国，对其进行了广泛深入的研究。由于桑黄价格昂贵及供不应求，必然 导致人们对桑黄菌的无序采集，加上桑黄菌本身生理生态的特殊性和复杂性， 以及外部条件的制约，自然界中形成的桑黄子实体非常稀少，而且桑黄的自然 生长周期相当长，要长成适合药用的大小，需要几年的时间，目前存在的问题 是：天然桑黄资源匮乏，面临枯竭，难以满足市场需要。所以利用生物工程对 其进行液体发酵菌丝体生产和人工栽培研究非常重要，但是无论是人工栽培子 实体还是液体发酵菌丝体生产，获得高品质的优良菌种是关键。目前，现有技 术中也有这样的文献记载，其培养方法是采用综合PDA培养基来进行培养。存 在的问题是此方法所分离培养的桑黄菌母种的菌丝体发酵产量低，只能达到 6.0～7.8g干菌丝体/1000mL。

发明内容：

本发明要克服现有技术存在的菌丝体发酵产量低的问题。

为克服现有技术存在的问题，本发明地技术方案是：中国野生桑黄蘑菇菌 株的分离培养方法，包括以下步骤：

(1)培养基的制作：按下述配方和配比制作试管斜面培养基

培养基的配方：马铃薯220～260g、葡萄糖18～25g、磷酸二氢钾0.8～1.2g、 硫酸镁0.4～0.6g、维生素B₁8～12mg、桑树枝80～100g、琼脂18～20g、水 1000mL，pH6～7.0；

(2)分离培养：

①桑黄子实体处理：取桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质，消 毒，然后置于无菌烧杯中备用；

②桑黄菌分离：将已处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用已灭菌 的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入试管斜面培养基表面；

③母种培养：试管置于25～28℃恒温箱中，待长成菌丝后，取生长快、菌 丝长的菌丝块移入另一无菌试管斜面培养基表面培养，待长出菌丝后，取生长 快、无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25～28℃培养12d、 菌丝长满斜面且无杂菌，即为桑黄菌母种。

上述步骤(1)中，培养基的制作方法是：先将桑树枝剪成1～2cm的小段， 加1200～1800mL水煮沸30～40分钟，过滤取汁。然后将马铃薯去皮、切1cm 左右厚片，加入此汁中煮沸10～20分钟，过滤取滤液。在此滤液中按配比量加 入葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B₁，小火煮至琼脂溶解，定容 至1000mL。将已制备好的培养基趁热分装于试管内，每支10mL，用棉塞塞紧试 管口，按每10支管为一捆，用防潮纸包紧有棉塞的一端，放入高压灭菌锅内灭 菌，压力1.0～1.5kg/cm²，温度121～126℃，时间30分钟，取出试管摆斜面， 凝固后为母种培养基。

上述步骤(2)、①中，消毒是用75％酒精擦洗固体外表面数次，再在0.5％ 甲硝唑溶液里浸泡5～10分钟。

与现有技术相比，本发明的优点是：由于培养分离方法合理，培养基配方 和配比合理，尤其是培养基中添加的桑树枝，其桑树枝中的部分有效成分含有 调整桑黄菌丝生长的生理因子，促进了菌丝生长发育，提高了菌株的活性，最 终实现了桑黄菌液体发酵生产的菌丝体产量高，平均可达到8.83g干菌丝体 /1000mL以上。为实现桑黄人工商品化、规模化栽培奠定了良好的基础。

具体实施方式：

下面将通过具体实施例对本发明做详细的说明。

实施例1：

中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤：

(1)培养基的制作：按下述配方和配比制作试管斜面培养基

培养基的配方：马铃薯250g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、 维生素B₁ 10mg、桑树枝85g、琼脂20g、水1000mL，pH6.5；

培养基的制作方法是：先将桑树枝剪成1～2cm的小段，加1500mL水煮沸 30分钟，过滤取汁。然后将马铃薯去皮、切1cm左右厚片，加入此汁中煮沸10 分钟，过滤取滤液。在此滤液中加入葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁、维 生素B₁，小火煮至琼脂溶解，定容至1000mL。将已制备好的培养基趁热分装于 试管内，每支10mL，用棉塞塞紧试管口，按每10支管为一捆，用防潮纸包紧 有棉塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.0～1.5kg/cm²，温度121～126 ℃，时间30分钟，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。

(2)分离培养：

①桑黄子实体处理：取桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质， 先用75％的酒精擦洗固体外表面5次，再在0.5％甲硝唑溶液里浸泡10分钟进行 消毒，然后置于无菌烧杯中备用；

②桑黄菌分离：将已处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用已灭菌 的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入试管斜面培养基表面；

③母种培养：试管置于25～28℃恒温箱中，待长成菌丝后，取生长快、菌 丝长的菌丝块移入另一无菌试管斜面培养基表面培养，待长出菌丝后，取生长 快、无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25～28℃培养12d、 菌丝长满斜面且无杂菌，即为桑黄菌母种。

该实施例为最佳实施例。

实施例2：

中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤：

(1)培养基的制作：按下述配方和配比制作试管斜面培养基

培养基的配方：马铃薯220g、葡萄糖25g、磷酸二氢钾0.8g、硫酸镁0.6g、 维生素B₁ 8mg、桑树枝100g、琼脂18g、水1000mL，pH6.0；

培养基的制作方法是：先将桑树枝剪成1～2cm的小段，加1800mL水煮沸 30分钟，过滤取汁。然后将马铃薯去皮、切1cm左右厚片，加入此汁中煮沸10 分钟，过滤取滤液。在此滤液中按配比量加入葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫 酸镁、维生素B₁，小火煮至琼脂溶解，定容至1000mL。将已制备好的培养基趁 热分装于试管内，每支10mL，用棉塞塞紧试管口，按每10支管为一捆，用防 潮纸包紧有棉塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.0～1.5kg/cm²，温度 121～126℃，时间40分钟，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。

(2)分离培养：

①桑黄子实体处理：取桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质，先 用75％的酒精擦洗固体外表面4次，再在0.5％甲硝唑溶液里浸泡15分钟进行消 毒，然后置于无菌烧杯中备用；

②桑黄菌分离：将已处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用已灭菌 的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入试管斜面培养基表面；

③母种培养：试管置于25～28℃恒温箱中，待长成菌丝后，取生长快、菌 丝长的菌丝块移入另一无菌试管斜面培养基表面培养，待长出菌丝后，取生长 快、无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25～28℃培养12d、 菌丝长满斜面且无杂菌，即为桑黄菌母种。

实施例3：

中国野生桑黄蘑菇菌株的分离培养方法，包括以下步骤：

(1)培养基的制作：按下述配方和配比制作试管斜面培养基

培养基的配方：马铃薯260g、葡萄糖18g、磷酸二氢钾1.2g、硫酸镁0.4g、 维生素B₁ 12mg、桑树枝80g、琼脂20g、水1000mL，pH7.0；

培养基的制作方法是：先将桑树枝剪成1～2cm的小段，加1200mL水煮沸 30分钟，过滤取汁。然后将马铃薯去皮、切1cm左右厚片，加入此汁中煮沸20 分钟，过滤取滤液。在此滤液中按配比量加入葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫 酸镁、维生素B₁，小火煮至琼脂溶解，定容至1000mL。将已制备好的培养基趁 热分装于试管内，每支10mL，用棉塞塞紧试管口，按每10支管为一捆，用防 潮纸包紧有棉塞的一端，放入高压灭菌锅内灭菌，压力1.0～1.5kg/cm²，温度 121～126℃，时间30分钟，取出试管摆斜面，凝固后为母种培养基。

(2)分离培养：

①桑黄子实体处理：取桑黄子实体，用干净刷子刷去菇体表面的杂质，先 用75％的酒精擦洗固体外表面5次，再在0.5％甲硝唑溶液里浸泡10分钟进行消 毒，然后置于无菌烧杯中备用；

②桑黄菌分离：将已处理消毒好的子实体在超净工作台上撕开，用已灭菌 的解剖刀在菌片中央切取米粒大的组织1块，放入试管斜面培养基表面；

③母种培养：试管置于25～28℃恒温箱中，待长成菌丝后，取生长快、菌 丝长的菌丝块移入另一无菌试管斜面培养基表面培养，待长出菌丝后，取生长 快、无杂菌污染的菌丝块再次移入另一斜面培养基表面，25～28℃培养12d、 菌丝长满斜面且无杂菌，即为桑黄菌母种。