一种混合培养制备微藻油脂的方法

一种混合培养制备微藻油脂的方法

技术领域

本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种混合培养制备微藻油脂的方 法。

背景技术

由于化石能源的日趋减少和使用化石能源造成温室效应的增加，越来越多的科研 工作者把目光集中到可再生能源的开发和利用上。生物质能作为地球上最重要的可再生能 源，它包括林业生物质、农作物、水生植物、农业废弃物等。在诸多的生物质能源中，微藻是 重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长 周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微 藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻 中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。

随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的 日益恶化，特别是CO₂的急剧增加引起的温室效应越来越严重。微藻的生长周期短、光合效 率高，CO₂固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10 倍以上，不仅可以减少CO₂排放，同时 也降低了培养成本；除CO₂外，废气中的一些SOx、NOx 等成分也随着微藻的代谢被净化处 理，有效减少有害气体排放，因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能 满足世界运输所需燃料的可再生能源。

目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN20110144545.6公开了一株栅藻 藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于 目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO₂的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、素、淀 粉、多糖、核酸的生产。CN20120154470.4公开了一株富油海洋微藻微拟球藻( Nannochloropsis gaditana )藻株及其应用，该藻株可在pH=4.5的环境下正常生长，其油 脂含量可达35%。CN20111019480.X公开了一株微藻藻株（Mychonases sp .）及其用于生产 生物柴油的应用，利用该藻株可生产高附加值的多不饱和脂肪酸，包括亚麻酸 C18:3和神 经酸C24:1，其在获得生物柴油的同时，获得高附加值的副产品。这些专利都未涉及藻种对 二氧化碳的耐受性。CN102703326A公开了一种高CO₂耐受性和固定率的微藻及其选育方法， 但该专利所提供的藻株并未涉及该藻株的油脂含量。

上述专利要么不能高效利用CO₂生产油脂，要么获得的生物质中油脂含量不够高。 特别是在实际应用中，当环境中CO₂体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，固 碳效率低；同时一般微藻在中性条件下适宜生长，在偏酸性或者偏碱性的条件下不利于微 藻的生长，而微藻利用CO₂一般是以溶解在水中的HCO₃^-离子形式存在的，二氧化碳在中性环 境下溶解度低，不利于藻类吸收利用。而且，如果通入的化石燃料废气中含有高浓度的SOx、 NOx等气体也会抑制微藻生长和降低固碳效率。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种混合培养制备微藻油脂的方法。本发明方 法提高了微藻培养体系对高浓度CO₂的耐受性和溶解性，提高了固碳效率，微藻油脂的收获 量明显提高，有利于进行生物柴油的生产。

本发明混合培养制备微藻油脂的方法，包括如下内容：在光生物反应器中加入微 藻培养基和混合微藻种子液，维持培养体系PH为8～12，优选为9～11，并通入体积含量为 5v%～45v%的CO₂，优选为10v%～30v%；其中混合微藻包括凯氏拟小球藻（Parachlorella kessleri）FSH-Y3和纤维藻（Ankistrodesmus sp.）SS-B7，分别于2014年5月26日和2013年4 月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号分别为CGMCC No. 9238和CGMCC No. 7478，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微 生物研究所。

本发明中，所述的凯氏拟小球藻FSH-Y3藻株在显微镜下藻细胞为球形、椭圆形，内 有一个周生、杯状或片状的素体；无性繁殖，每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子，成 熟时母细胞破裂，孢子逸出，长大后即为新个体。该藻株在高PH值下能够更好的吸收利用二 氧化碳，快速生长繁殖。所述的纤维藻SS-B7藻株是一种淡水绿藻，在显微镜下藻细胞为绿 ，镰形或弓形、丛生、弯曲，自中央向两端渐尖细，末端尖，长大约5-6μm，中央宽约2μm。该 藻株能够耐受高浓度的CO₂和NOx，可以利用含CO₂和NOx的废气或烟气进行光照自养生长获 取富含油脂的生物质，固碳效率高，耐受能力强。

本发明中，微藻培养基采用本领域技术人员熟知的BG11、SE、BBM等培养微藻的液 体培养基。

本发明中，凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液的制备如下：将培养基的PH调节为10～12， 在温度为20～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～20000Lux，振 荡培养至对数生长期。光生物反应器中加入的凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液与微藻培养基的 体积比1:25～1:5。

本发明中，纤维藻SS-B7种子液的制备如下：将培养基的PH调节为7～9，在温度为 20～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～10000Lux，振荡培养至 对数生长期。光生物反应器中加入的纤维藻SS-B7种子液与微藻培养基的体积比为1:25～ 1:5。

本发明中，优选在混合培养体系中加入一定量CN201310537896.2所述的斜生栅藻 （Scenedesmus obliqnus）FSH-Y2，该藻株于2012年9月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心”，保藏编号为CGMCC No. 6551，保藏地址为北京市朝阳区北辰西 路1号院3号 中国科学院微生物研究所。斜生栅藻FSH-Y2种子液的制备方法同凯氏拟小球 藻FSH-Y3，加入量为斜生栅藻FSH-Y2种子液与微藻培养基的体积比1:40～1:10。

本发明中，混合培养的温度为20～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光 照强度为2000～10000Lux。通入气体优选使用含CO₂的废气或烟气，其中CO₂含量为10v%～ 45v%，NOx含量不高于500×10^-6（v/v）。混合培养至生长稳定期结束，通过离心、沉降等方式 收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量，细胞干重可达到12g/L以上，油脂含量可达到细 胞干重的45%以上。

与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：

1、本发明将凯氏拟小球藻FSH-Y3和纤维藻SS-B7混合培养，提高了微藻培养体系对高 浓度CO₂的耐受性和固碳效率，微藻油脂的收获量显著提高。

2、本发明在高PH环境下进行微藻的培养，能够增加培养体系中CO₂的溶解度，有助 于微藻对CO₂的吸收利用，提高了固碳效率。同时，在高PH值培养微藻时，可以有效抑制微藻 生长过程中杂菌的生长，提高微藻油脂收率。

3、本发明的混合培养体系能够耐受高浓度的CO₂和NOx，可以利用废气中的CO₂进行 自养生长，固定CO₂，缓解目前工业社会带来的温室效应和废气污染问题。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。本发明中，wt%为质量分数，v%为体 积分数。

实施例1 微藻种子液的制备

微藻培养采用BG11培养基，培养基配方如表1和表2所示。

表1 BG11培养基

*表2 表1中A5+Co solution的组成

首先按照表1和表2制备BG11液体培养基，将培养凯氏拟小球藻FSH-Y3、斜生栅藻FSH- Y2的培养基的PH调节为10，将培养纤维藻SS-B7的培养基的PH调节为8.0，然后将凯氏拟小 球藻FSH-Y3、斜生栅藻FSH-Y2、纤维藻SS-B7分别接种于上述培养基中。在恒温光照摇床中 培养，培养温度为25℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为5000Lux，120rpm 振荡培养至对数生长期，获得凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液、斜生栅藻FSH-Y2种子液、纤维藻 SS-B7种子液，将上述种子液在15℃弱光下保存备用。

实施例2 微藻油脂的制备

将实施例1制备的微藻种子液分别接种在BG11培养基进行微藻油脂的生产。在20L气升 式光生物反应器中进行，凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液、纤维藻SS-B7种子液按照体积比1:1 的比例接种，按照20%的总接种量接种到BG11培养基中，PH值控制在8～11之间，通入氮气和 二氧化碳的混合气体，其中二氧化碳含量为10v%～45v%，光照强度为5000Lux，培养温度为 28℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10。培养7天后处于稳定期，结束培养，离心收集藻 液，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷: 乙酸乙酯法测得总脂含量，结果如表3所示。

表3混合藻与单一藻的培养效果比较

由表3可见，相对于单一藻种，混合藻种在高PH和高CO₂浓度下，获得了更高的生物量和 油脂含量。

实施例3 微藻油脂的制备

在培养体系中加入斜生栅藻FSH-Y2种子液，其中凯氏拟小球藻FSH-Y3种子液、斜生栅 藻FSH-Y2种子液的、纤维藻SS-B7种子液三者按照总接种量20%接种到BG11培养基中。其它 过程和条件同实施例2，效果如表4所示。

表4混合藻培养效果比较

由表4可见，在混合体系中加入斜生栅藻FSH-Y2种子液，培养体系的效果有进一步提 高。

实施例4利用烟气制备微藻油脂

制备条件与实施例2相同，不同之处在于通入含NO、NO₂和CO₂的烟气，烟气中CO₂的含量 为10v%～40v%，NO和NO₂含量为100×10^-6～500×10^-6（v/v），维持反应体系的PH为10。10天后 结束培养，离心收集藻细胞，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生 物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量，结果如表5所示。

表5混合藻与单一藻的培养效果比较

由表5可见，相对于单一藻种，混合藻种不仅可以耐受高浓度的CO₂，而且可以耐受一定 浓度的NOx，获得了更高的生物量和油脂含量。由此可见，可以利用混合藻及烟气制备微藻 油脂，即实现了油脂的生产，同时可以净化废气。