景天根际铬抗性菌株，筛选方法及其应用

本发明涉及一株从景天根际分离的具有铬抗性的短小芽孢杆菌 (Bacillus pumilus)JCr9及其在植物-微生物联合修复铬重金属污染土 壤中的应用。

近年来，随着工业的发展，铬化合物在工业上的广泛应用，产生 的三价和六价铬化合物经由废水、废渣、含铬粉尘等大量排放到自然 环境，使土壤、水体和大气受到严重的铬污染。

我国的铬污染也非常严重，耕地受到重金属污染的面积2000万 hm2，每年造成约200亿元经济损失。据统计我国每年工厂排放的铬渣 大约60万吨，历年累计堆存铬渣达600万吨，经过解毒处理或综合利 用的不足17％。

铬污染具有潜在性、隐蔽性和长期性等特点，一旦污染水体、土 壤等，即使投入人力和物力也难以将其恢复，而且对植物生长、动物 发育和人体的健康都有很大的危害。土壤中的重金属被植物吸收再通 过食物链进入人体，并在人体内积累，对人类的健康造成严重的威胁。 Cr6+化合物是一种致癌物质。重金属铬还能对人的眼睛、皮肤、呼吸道 及肠胃造成损伤。每人每天大约有3.6微克铬从呼吸道入人体，占总 摄入量的1.4％。可能会引起上呼吸道的各种疾病，如鼻中隔穿孔、呼 吸道溃烂，严重时导致肺癌等。Cr6+具有腐蚀性，接触到皮肤会引起皮 炎，湿疹和铬疮等。

可以利用土壤、微生物、植物的共生关系，充分发挥植物与微生 物修复技术各自优势，弥补不足，进而提高土壤中污染物的植物修复 效率，最终达到彻底修复重金属污染土壤的目的。植物可为微生物提 供生存场所，并可转移氧气使根圈的好氧作用正常运行，根分泌物等 又为微生物提供大量营养，增加微生物对污染物的吸收，也可作为天 然的共代谢底物促进污染物的降解。另外，微生物作用能减轻污染物 对植物的毒害，提高植物的耐受性与累积量。如在利用植物进行污染 土壤修复的同时，向土壤中接种具有较强的降解能力的专性降解菌， 即可促进污染物的降解。

因此，分离具有较强铬耐受性和促进植物修复铬污染土壤的细菌 对植物-微生物联合修复铬重金属污染土壤具有现实意义和重要的工 程应用价值。

本发明的技术目的在于筛选景天根际具有较强铬耐受性的细菌。

因此，本发明的第一方面涉及一株从景天根际分离的铬抗性菌株 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)JCr9，其于2014年12月1日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.10078。

优选地，所述景天根际铬抗性菌株Bacillus pumilus JCr9的16S  rDNA的核酸序列如SEQ ID NO：3所示，GenBank数据库中没有与其 一致的序列，且本菌株16S rDNA核酸序列并未提交GenBank数据库。

本发明的第二方面涉及上述的景天根际铬抗性菌株Bacillus  pumilus JCr9的筛选方法，其包括步骤：

(1)选择生长状况良好的景天植株进行处理：取铬(Cr)溶液母 液2.5ml,稀释定容至40ml，均匀浇灌在生长供试植物的土壤中，使土 壤的铬含量达到1000mg·kg-1；在胁迫的条件下继续培养30d，每间隔 4d浇水40ml；

(2)菌种的分离、纯化与筛选：在经过处理的植物根际取10g土 样，置于90ml装有玻璃珠的细菌培养基中，在37℃恒温振荡器上150×g 振荡20-30min后取下，静止5min，使土壤沉淀；在沉淀以上的各个层 面进行多次取样，接入新的细菌培养基中，37℃培养24h；取富集后的 菌悬液，用倍数稀释法将其涂布于筛选培养基的平板上，倒置于37℃ 恒温培养箱中，培养48h；肉眼观察，分别挑选不同形态的典型单菌落， 在培养皿底做好标记，并挑取单菌落在新的筛选培养基上划线分离； 反复进行以上步骤，直至得到菌落特征一致的纯菌种；

(3)对于筛选出的已纯化菌种进行保存：将分离纯化得到的菌种 接种于细菌培养基，培养后加入60％(v/v)甘油，使甘油的终浓度为10％ (v/v)，置于-80℃进行保存；

其中所述细菌培养基为:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏 水1000mL，pH7.0；

所述筛选培养基的配制方法如下：基础培养基为细菌培养基 1000ml，添加微量元素液和维生素液各10ml，121℃灭菌20min，冷却 至70℃，加入铬溶液母液，使培养基中铬含量为1000mg·L-1，37℃培 养；

其中微量元素液为：MnSO40.01g，ZnSO40.05g，H3BO30.01g， CaCl20.01g，定容至1L，4℃避光保存；维生素液为：肌酸0.025g， 抗坏血酸0.025g，核黄素0.025g，柠檬酸0.02g，定容至1L，4℃避 光保存；铬溶液母液为：K2CrO4配制成Cr6+浓度为200mg·ml-1的母液， 过滤除菌后，室温保存。

本发明的第三方面涉及含有上述的景天根际铬抗性菌株Bacillus  pumilus JCr9的组合物。

优选地，所述组合物具有较强的铬耐受性。

本发明的第四方面涉及上述的景天根际铬抗性菌株Bacillus  pumilus JCr9及所述组合物在植物-微生物联合修复铬重金属污染土壤 中的用途。

本发明的第五方面涉及上述的景天根际铬抗性菌株Bacillus  pumilus JCr9及所述组合物在处理含重金属铬的污染物中的用途。优选 地，所述污染物为被污染的土壤。

利用本发明的筛选方法从铬胁迫的景天植物根际土壤中分离筛选 出的铬抗性菌株Bacillus pumilus JCr9，其于2014年12月1日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号 为CGMCC No.10078；其建议的分类命名为芽孢杆菌属Bacillus sp.；其 为革兰氏阴性菌，需氧棒状杆菌，无鞭毛、无荚膜。该菌株对重金属 铬有较强的耐性，对植物-微生物联合修复铬重金属污染土壤具有现实 意义和重要的工程应用价值。

本领域技术人员公知，在本发明所获得的上述景天根际铬抗性菌 株Bacillus pumilus JCr9新种的基础上，本领域技术人员可以对所述细 菌进行适当的诱变而继续提高其耐受重金属铬的能力，这样的诱变后 的基于本发明所述菌种的突变株也落入本发明保护的范围。所述诱变 包括辐射、化学诱变等。同时，本领域技术人员也可能将本发明获得 的上述菌株与其他植物共同使用，以达到最佳植物-微生物联合修复重 金属铬污染土壤的目的。

图1：菌株Bacillus pumilus JCr9的16S rDNA序列。

图2：菌株Bacillus pumilus JCr9的透射电镜照片。

图3：菌株Bacillus pumilus JCr9生长曲线图。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术 人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修 改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料 如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1 景天根际铬抗性菌株Bacillus pumilus JCr9的分离

材料与方法

1、培养基

细菌培养基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，蒸馏水1000mL， pH7.0。

配制筛选培养基：基础培养基为细菌培养基1000ml，添加微量元 素液和维生素液各10mL，121℃灭菌20min，冷却至70℃左右，加入 铬溶液母液，使培养基中铬含量为1000mg·L-1。37℃培养。

其中微量元素液为：MnSO40.01g，ZnSO40.05g，H3BO30.01g， CaCl20.01g，定容至1L，4℃避光保存。维生素液为：肌酸0.025g， 抗坏血酸0.025g，核黄素0.025g，柠檬酸0.02g，定容至1L，4℃避光 保存。铬溶液母液：K2CrO4配制成Cr6+浓度为200mg·mL-1的母液，过滤 除菌后，室温保存。

2、样品采集和菌株分离

选择生长状况良好的景天植株进行处理。取重金属Cr溶液母液 2.5mL,稀释定容至40mL，均匀浇灌在供试植物的土壤中，使土壤的铬 含量达到1000mg·kg-1。在胁迫的条件下继续培养30d，每间隔4d浇水 40mL。在经过处理的植物根际取10g土样，置于90mL装有玻璃珠的 细菌培养基中，在37℃恒温振荡器上150×g振荡20-30min后取下，静 止5min，使土壤沉淀。在沉淀以上的各个层面进行多次取样，接入新 的细菌培养基中，37℃富集培养24h。取富集培养后的菌悬液，用倍数 稀释法将其涂布于筛选培养基的平板上，倒置于37℃恒温培养箱中， 培养48h。肉眼观察，分别挑选不同形态的典型单菌落，在培养皿底做 好标记，并挑取单菌落在新的筛选培养基上划线分离。反复进行以上 步骤，直至得到菌落特征一致的纯菌种，至此完成菌种的分离、纯化 与筛选工作。对于筛选出的已纯化菌种进行保存：将分离纯化得到的 菌种接种于细菌培养基，培养后加入60％(v/v)甘油，使甘油的终浓度 为10％(v/v)，置于-80℃进行保存。分离获得一株对重金属铬有较强的 耐性的细菌，命名为JCr9。

实施例2 菌株JCr9的菌种鉴定

1、基因组DNA提取

按照常规技术手段大量培养上述菌株JCr9，然后获取其基因组 DNA。

2、菌株JCr9的16S rDNA的鉴定方法

2.1 菌株JCr9的16S rDNA的PCR扩增、测序及系统发育树的构建

2.1.1 16S rDNA基因序列的PCR扩增

扩增16S rDNA基因序列的两端引物选用通用引物：正向引物 BSF8/20：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(SEQ ID NO：1)和反 向引物BSR1541/20：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′(SEQ ID  NO：2)。PCR反应体系为50μL，反应条件为94℃变性5min；接下来 进行35个循环反应：94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸90s；然后 72℃再延伸10min，最后于4℃保存。

2.1.2 扩增产物的克隆及序列测定

PCR产物用TAKARA公司生产的Vector克隆试剂盒进
行克隆，先将16S rDNA基因片段纯化，连接到Vector载体
上，5μL连接反应液转化感受态细胞DH5α，并用菌落PCR进行鉴定。
重组子的基因序列由上海生工生物工程技术服务有限公司测定。

2.2 菌株JCr9的16S rDNA的鉴定结果

2.2.1 菌株JCr9的16S rDNA基因序列

扩增菌株JCr9的16S rDNA基因序列，得到了长度约1.5kb的扩增片 段。扩增片段经胶回收、连接、克隆后测序，测得菌株JCr9的16S rDNA 为1482bp(SEQ ID NO：3，同时请见图1)，该序列未提交NCBI数据 库。

2.2.2 JCr916S rDNA基因序列的相似性比较

将JCr916S rDNA的序列输入到NCBI数据库中，运用Blast程序 将这株细菌的16S rDNA和数据库中的16S rDNA基因序列进行比对， 从数据库中挑选与JCr9的16S rDNA基因序列具有较高相似性的菌株， 见表1。

从表1中可以得出，菌株JCr9与Bacillus pumilus BF17、Bacillus  pumilus Jo2、Bacillus pumilus SAFR-032、Bacillus pumilus PR13和 Bacillus sp.CSL09-1菌株的相似性都比较高，均可以达到99％以上， 且都为Bacillus属的成员。这说明菌株JCr9为Bacillus pumilus的一个 新亚种。

表1 菌株JCr916S rDNA序列NCBI同源性检索结果

3.菌株Bacillus pumilus JCr9生理生化分析

3.1 形态特征

采用日本日立公司H-7650型号透射电子显微镜对菌株JCr9进行了 电镜观察。该透射电镜分辨率为0.2nm，加速电压为40kV～120kV，放 大倍率(连续放大模式为×200～×600000；低倍模式为×50～×1000)。

菌株JCr9的透射电镜观察照片见图2。菌株JCr9呈革兰氏染阴 性，棒状杆菌，无鞭毛、无荚膜，直径约1μm－1.2μm，长度约2μm， 其菌落的形态特征见表2。

表2 JCr9菌株菌落的形态特征

菌种 形状 直径(mm) 颜 边缘 表面 粘稠度 透明度

JCr9 圆形 0.8-1.5 淡黄 整齐 平滑 不粘稠 半透明

3.2 生理生化分析

对菌株JCr9进行了生理生化分析，其分析结果见表3。糖酵解试 验分析结果见表4。

表3 Bacillus pumilus JCr9的生理生化试验分析

注：“+”阳性“-”阴性

表4 Bacillus pumilus JCr9的糖酵解分析

糖酵解分析 Bacillus pumilus JCr9 糖酵解分析 Bacillus pumilus JCr9

葡萄糖 + 蔗糖 +

乳糖 - 麦芽糖 +

半乳糖 + 果糖 +

木糖 -    

注：“+”表示产酸，“—”表示不产酸。

3.3 Bacillus pumilus JCr9生长曲线

将Bacillus pumilus JCr9菌株接种于LB液体培养基中活化24h， 取500μL接种于100mL LB液体培养基中，将三角瓶置于37℃恒温振 荡器150×g进行培养。每隔2h取样一次，以未接菌的LB液体培养基 为空白对照，用分光光度计比法测定600nm波长下细菌悬浮液的吸 光值，连续测定36h。以培养时间为横坐标，OD600为纵坐标，绘制 细菌生长曲线，见图3。

从图3可知，菌株JCr9从接种后4小时内处于迟缓期，4-14小时 为对数生长期，14小时后进入平台期。

景天根际铬抗性菌株或含有景天根际铬抗性菌株的组合物在处理 含重金属铬的污染物或植物-微生物联合修复铬重金属污染土壤中的应 用。