一株拜氏羧菌及其应用

一株拜氏羧菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产丁醇的拜氏梭菌及其在发酵生产丁醇中的应用。

背景技术

丁醇是一种重要的有机化工原料，在化工、医药和石油等工业部门有广泛的用途。而且由于比乙醇多两个亚甲基，丁醇具有更高的疏水性，较低的挥发性，可与汽油以任意比例混合，并具有与汽油相当的热值。作为一种有潜力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越来越受到世界各国的关注。

丁醇的生产工艺主要有化学合成法和微生物发酵法两种。随着石油资源的日益枯竭，采用以石油为原料丙烯羰基合成法生产丁醇已举步维艰，而且由于技术落后，装置偏小导致产能不够，致使中国丁醇市场长期供应不足，不能满足国内市场的需求。生物发酵法制备丁醇有其独到的优势，发展生物丁醇将极大地缓解丁醇供应不足的现状。

丙酮丁醇发酵（acelone-butanol fermentation，ABF）的主要产物是丙酮、丁醇和乙醇，产物比例为3:6:1。传统丙酮丁醇发酵普遍存在以下问题：（1）传统的丙酮丁醇发酵菌株需在严格厌氧条件下培养发酵，稍有操作不慎，很容易进入空气，造成菌体不能正常生长，因此在发酵过程中通常需要通入惰性气体如N₂来保证无氧环境，能耗较高；（2）丁醇产率低，仅20%左右（质量分数），使得丁醇发酵过程原料成本偏高，制约了丁醇发酵产业的发展；（3）发酵产物除了丁醇外还有40%的丙酮和乙醇等副产物，增加了产品分离难度，提高了能耗。

其中菌株和原料问题一直是困扰丁醇发酵的瓶颈。近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕菌种诱变选育，寻合适的纤维原料及其糖液制备、发酵工艺条件优化和溶剂提取等方面进行。目前工业上用于丁醇生产的菌株主要是丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌，它们具有相似的代谢路径，产物主要分为3类 ：1)溶剂（丙酮、乙醇和丁醇）；2)有机酸（乙酸、乳酸和丁酸）；3)气体（包括二氧化碳、氢气等）。将产物中的氢气回收可以进一步提高ABE 的经济竞争力。然而，副产物如丙酮、乙醇等的生成消耗了有限的碳代谢流，降低了产物中丁醇所占的比例，增加了回收丁醇的难度。

中国专利201110047422.0提供了一种利用丙酮丁醇羧菌厌氧发酵产丁醇的方法，以丙酮丁醇梭菌 Clostridium acetobutylicum XY16，丙酮丁醇梭菌 Clostridium acetobutylicum AS1.134，或者丙酮丁醇梭菌 Clostridium acetobutylicum AS1.135为发酵菌株，以葡萄糖为底物，初始葡萄糖浓度为60g/L，在通入N₂保持发酵罐严格厌氧环境的情况下，对丙酮丁醇羧菌产酸期和产醇期的pH进行调控，总溶剂和丁醇的产量分别为19.20-19.65g/L和11.43-12.30g/L，丁醇选择性58.2%-63.1%，溶剂产率为32.0%-32.8%，丁醇产率为19.1%-20.5%。

中国专利201210089406.2公开了一株产丁醇的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）Y-3，该菌是通过对出发菌株Clostridium beijerinckii NCIMB8052采用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变获得的突变株，可以木糖渣为原料制备生物丁醇，在以木糖渣酶解液为碳源时，总溶剂产量为16g/L，丁醇产量为8.2g/L，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株产丁醇的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）XH0906及其应用。该菌株可在非严格厌氧条件下生长并发酵生产丁醇，具有丁醇产量高，丙酮和乙醇副产物少等特点。

本发明提供一株产丁醇的拜氏梭菌XH0906，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年05月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9124。

本发明所述的拜氏梭菌XH0906为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，可以形成芽孢。经生理生化鉴定为接触酶阴性，氧化酶阴性，不同化硝酸盐。生理生化特性如表1所示。

表1拜氏梭菌XH0906的生理生化特性

注 ： “+” 表示阳性反应或能利用 ； “－” 表示阴性反应或不能利用。

本发明拜氏梭菌XH0906 的 16S rRNA 基因测序结果见序列表。

本发明的拜氏梭菌XH0906属于非严格厌氧菌，在pH4.0-9.0，温度20-42℃的条件下均能良好生长，丁醇产率高，发酵产物中几乎不含丙酮和乙醇。

本发明还提供了拜氏梭菌XH0906在非严格厌氧条件下发酵生产丁醇的应用。在发酵产丁醇的过程中，发酵培养基中不需要加入保险粉除氧，发酵过程中不用通入N₂保持厌氧环境。

本发明还提供了上述拜氏梭菌XH0906在液体发酵培养基中通过非严格厌氧发酵生产丁醇，具体包括以下步骤：

（1）将所述拜氏梭菌接种在固体培养基斜面上，置于厌氧环境中，28-42℃培养12-48h；

（2）将步骤（1）培养的拜氏梭菌从斜面上刮下1-2环接入摇瓶种子培养基中，无需通入N₂保持厌氧环境，28-42℃静置培养12-48h；

（3）将步骤（2）培养的种子液以2%-20%的接种量接入到液体发酵培养基中，无需通入N₂保持厌氧环境，28-42℃培养48-120h；上述种子培养基和发酵培养基中无需加入保险粉除氧。

本发明所述种子培养基和发酵培养基成分相同，固体培养基在液体培养基中加入1%-2%的琼脂。

本发明所述发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐和维生素，培养基的初始pH为5.5-8.5。所述碳源为葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖、低聚葡萄糖、低聚木糖等中的一种或几种，优选为木糖，且不限于这几种糖，浓度为20-50g/L。所述氮源包括有机氮源和无机氮源：有机氮源可以是酵母膏、蛋白胨、玉米浆、豆粕水解液等中的一种或几种，优选豆粕水解液，浓度为0.1-10g/L；无机氮源可以是醋酸铵、硝酸钠、硫酸铵等中的一种或几种，优选醋酸铵，浓度为0.1-10g/L。所述无机盐可以是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸镁、氯化钙、硫酸锰等中的一种或几种，但并不限于这几种化合物，浓度为0.001-1g/L。所述维生素为维生素B1、生物素、对氨基苯甲酸等中的一种或几种，浓度为0-0.1g/L。

本发明利用拜氏羧菌XH0906发酵生产丁醇的操作条件为：发酵温度为28-42℃，优选34-38℃；发酵初始阶段自然pH，对数期后控制pH为4.0-7.0，优选5.0-6.0；发酵时间为72-120 h。

本发明利用拜氏羧菌XH0906发酵生产丁醇采用的发酵工艺可以采用一切常用的发酵方法，包括批次发酵、批次补料发酵、连续发酵、原位萃取发酵和气体原位抽提发酵等。

与现有丁醇发酵菌株相比，本发明具有如下有益效果：

1、本发明拜氏羧菌XH0906在发酵产丁醇的过程中，耐氧能力强，发酵培养基中不需要加入保险粉除氧，全程无需通入N₂保持厌氧环境，减少了传统厌氧菌发酵过程中的除氧步骤，避免了因除氧不干净造成的菌体不生长现象，降低了能耗。

2、本发明拜氏羧菌XH0906发酵产物中几乎无丙酮和乙醇副产物，提高了丁醇的产率，减轻了后续丁醇回收的压力，降低了分离能耗。

生物材料保藏说明

本发明提供的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）XH0906，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 9124；保藏日期： 2014年05月04日。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1拜氏梭菌XH0906菌株的筛选过程

2012年6月从辽宁省抚顺市周边采取森林土壤和牲畜粪便与玉米秸秆粉末混合一起置于无菌三角瓶中，加入适量无菌水，厌氧富集产气菌。经过2个星期的富集发现厌氧培养物中有气泡产生，取0.2mL培养物接种于置于试管的4.8 mL液体培养基中。液体培养基成分为：蛋白胨10 g/L、牛肉膏6 g/L、葡萄糖40g/L、氯化钠0.5 g/L、硫酸铵0.9 g/L、硫酸铁0.1 g/L、硫酸镁0.3 g/L、氯化钙0.1 g/L， pH7.0，在121℃下灭菌15min。静置培养72 h，培养过程中可观察到大量气泡产生。培养液离心取上清利用液相谱检测，发现有丁醇产生，丁醇浓度可达到2.3g/L。继续取试管培养液涂固体平板（与液体培养基同，加1.5%琼脂粉），置于无氧环境中培养72 h，挑取单菌落进行发酵测试。共挑取了50个单菌落进行发酵培养，其中19个培养物中有丁醇产生，见表2。

表2单菌落培养物中残糖和产物浓度列表

由表2可见，其中19号菌株培养物产生的丁醇浓度最高，因此选择该菌株进行保藏，并命名为XH0906，经鉴定为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）。

实施例2 拜氏梭菌XH0906非厌氧发酵生产丁醇

液体培养基成分：蛋白胨10 g/L、牛肉膏6 g/L、葡萄糖40g/L、氯化钠0.5 g/L、硫酸铵0.9 g/L、硫酸铁0.1 g/L、硫酸镁0.3 g/L、氯化钙0.1 g/L，pH 7.0，在121℃下灭菌15min。固体培养基在液体培养基中加入1%的琼脂。

利用拜氏梭菌XH0906非厌氧发酵生产丁醇：（1）将所述拜氏梭菌XH0906接种在固体培养基斜面上，置于厌氧环境中，30℃培养24h；（2）将步骤（1）培养的拜氏梭菌从斜面上刮下1-2环接入摇瓶种子培养基中，不需要通入N₂，35℃静置培养24h；（3）将步骤（2）培养的种子液以10%的接种量接入到液体发酵培养基中，不需要通入N₂， pH自然，37℃发酵88h。上述种子培养基和发酵培养基中不需要加入保险粉除氧。发酵88h后，发酵液中的丁醇浓度为7.5 g/L，无丙酮和乙醇产物，乙酸和丁酸浓度分别为1.0 g/L和0.6 g/L。

实施例3

发酵过程和操作条件同实施例2，不同之处在于采用不同的碳源、氮源替换原培养基中的葡萄糖，蛋白胨或硫酸铵。发酵结果如表3所示。

表3 培养基中碳源和氮源不同时的发酵结果

实施例4

利用5L发酵罐发酵，以葡萄糖为底物，初始培养基中葡萄糖浓度为40g/L。发酵培养基成分在实施例2基础上加入0.1%磷酸二氢钾、0.2%磷酸氢二钠、0.004%对氨基苯甲酸、0.004维生素B1和0.0004%生物素。装液量为3 L，搅拌速率150 r/min，发酵前16h不控制，任其自然下降，16h后通过流加10M的NaOH溶液调节pH为6.0，72 h后葡萄糖完全消耗。经检测，发酵液中的丁醇、乙酸和丁酸浓度分别为8.25g/L、1.2g/L和0.8g/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国石油化工股份有限公司

中国石油化工股份有限公司抚顺石油化工研究院

<120> 一株拜氏羧菌及其应用

<130> 新专利申请

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1299

<212> DNA

<213> Clostridium beijerinckii

<400> 1

caactctcat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc accgcgacat 60

tctgattcgc gattactagc aactccagct tcatgtaggc gagtttcagc ctacaatccg 120

aactgagact ggttttaaag tttggctcca cctcacggtt tagcatctct ctgtaccagc 180

cattgtagca cgtgtgtagc cctagacata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac 240

cttcctcccg gttaacccgg gcagtctcgc tagagtgctc aactaaatgg tagcaactaa 300

caataagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac 360

aaccatgcac cacctgtctt cctgccccga agggcttccc cgattaaggg taattcagga 420

gatgtcaagt ctaggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccgctgc 480

ttgtgcgggc ccccgtcaat tcctttgagt tttaatcttg cgaccgtact ccccaggcgg 540

aatacttaat gcgttagcgg cggcacagag gtcatgacaa cccctacacc tagtattcat 600

cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc tttcgagcct 660

cagtgtcagt tacagtccag aaagtcgcct tcgccactgg tattcttcct aatctctacg 720

catttcaccg ctacactagg aattctactt tcctctcctg cactctagat atccagtttg 780

gaatgcagca cccaggttaa gcccgagtat ttcacatccc acttaaatat ccacctacgc 840

tccctttacg cccagtaaat ccggacaacg cttgctacct acgtattacc gcggctgctg 900

gcacgtagtt agccgtggct tcctcctcag gtaccgtcat tatcgtccct gaagacagag 960

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tgtgcaatat tccccactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc agtcccaatg 1080

tggccgatca ccctctcagg tcggctacgc atcgtcgcct tggtgagccg ttacctcacc 1140

aactagctaa tgcgacgcgg gtccatctca tagcggatta ctcctttaat tgctatgcca 1200

tgcggcacta caatcttatg cggtattaat cttcctttcg aaaggctatt cccctctatg 1260

aggcaggtta cccacgtgtt actcacccgt ccgccgcta 1299